Введение к работе
Актуальность темы
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в терапии В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) за последнее десятилетие, общая выживаемость больных значительно варьирует от 2 до 20 лет и более. Данное заболевание представлено агрессивной и вялотекущей формами, различающимися скоростью развития клинических проявлений и некоторыми молекулярными особенностями опухолевых клеток. В лечении В-ХЛЛ большое значение приобретает индивидуальный подход, который зависит как от показателей соматического статуса больного, так и от точности определения различных прогностических факторов, определяющих течение заболевания [Sagatys E.M. et al. 2012]. Среди молекулярных характеристик наиболее надежным прогностическим маркером, предсказывающим скорость прогрессирования В-ХЛЛ, является мутационный статус генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов, т.е. IgVH-генов. Наличие соматических мутаций IgVH-генов коррелирует с благоприятным прогнозом, отсутствие таковых – с агрессивным течением В-ХЛЛ [Hamblin T.J. et al. 1999]. Однако определение данного параметра остается недоступным для рутинной практики, в связи с чем предлагается использовать суррогатные маркеры - показатели экспрессии CD38 и ZAP-70 клетками В-ХЛЛ, оцениваемые с помощью лазерной проточной цитофлуориметрии [Shanafelt T.D. 2009]. Антиген CD38 в норме присутствует на мембране В-клеточных предшественников, В-лимфоцитов герминального центра фолликулов лимфатических узлов и на плазматических клетках [Malavasi F. et al. 2008], участвуя в транспорте ионов кальция, оказывая влияние на проведение сигналов с В-клеточного рецептора (BCR) и обеспечивая взаимодействие В-лимфоцитов с микроокружением в результате связывания лигандов - молекул CD31 и гиалуроновой кислоты [Deaglio S. et al. 2007, Malavasi F. et al. 2011]. Маркер ZAP-70 представляет собой внутриклеточную тирозинкиназу, которая функционирует в Т- и NK- лимфоцитах, участвуя в фосфорилировании тирозин-содержащих последовательностей при связывании иммунорецепторов, опосредуя таким образом проведение сигнала к клеточному ядру и активацию лимфоцитов [Bene M. et al. 2006]. ZAP-70 не экспрессируется в нормальных циркулирующих В-лимфоцитах, но обнаруживается на ранних стадиях В-клеточного развития [Schweighoffer E. et al. 2003]. В ряде случаев В-ХЛЛ в опухолевых В-лимфоцитах выявляется экспрессия CD38 и ZAP-70, что способствует усилению передачи сигналов от BCR, активной пролиферации моноклональных В-клеток и ассоциируется с агрессивным течением заболевания [Orchard J.A. et al. 2004, Buschenfelde C.M et al 2010]. Рассмотренные факторы должны определяться при первичной диагностике для оценки варианта течения В-ХЛЛ на ранних стадиях заболевания. Однако данные литературных источников относительно корреляции антигенов CD38 и ZAP-70 с мутационным статусом, а также их индивидуальной значимости весьма противоречивы [Letestu R. et al. 2006, Marti G. et al. 2006, Chiorazzi N. 2012].
Помимо молекулярных особенностей клеток В-ХЛЛ для индивидуализации терапевтического подхода важное значение имеет анализ показателей ответа на терапию. Последние позволяют выявлять случаи достижения раннего глубокого ответа либо рефрактерности к проводимому лечению [Paietta E. 2002]. На сегодняшний день качество ремиссии при В-ХЛЛ характеризуется с помощью критерия наличия или отсутствия минимальной резидуальной болезни (МРБ), т.е. остаточного опухолевого клона в крови или костном мозге [Marie C. et al. 2009]. Эрадикация МРБ предопределяет выживаемость, и даже среди пациентов с полной клинико-гематологической ремиссией именно достижение МРБ-негативного статуса ассоциируется с благоприятным прогнозом [Rawstron et al. 2007, Н.А. Купрышина и Н.Н. Тупицын 2012]. В настоящее время используются два метода определения МРБ при В-ХЛЛ на необходимом уровне чувствительности (10-4, т.е. 0,01% опухолевых клеток от числа проанализированных лейкоцитов) – это ПЦР с использованием пациент-специфичных праймеров и многоцветная проточная цитофлуориметрия. Указанные подходы характеризуются разными преимуществами и недостатками, в связи с чем представляет интерес сравнительный анализ методов для применения в рутинной диагностике МРБ при В-ХЛЛ. Кроме того, отсутствие информации о значении используемого биоматериала (периферическая кровь, костный мозг) и данных относительно кинетики элиминации опухолевого клона В-ХЛЛ на фоне современной иммунохимиотерапии свидетельствуют о необходимости детальной оценки особенностей мониторирования противоопухолевого ответа с помощью показателя МРБ.
Цель исследования – оценить минимальную резидуальную болезнь и иммунофенотипические маркеры (CD38, ZAP-70) в прогнозировании течения В-клеточного хронического лимфолейкоза.
Задачи исследования
-
Сопоставить результаты иммунофенотипического определения маркеров CD38 и ZAP-70 с данными молекулярно-генетического анализа мутационного статуса IgVH-генов.
-
Исследовать распределение иммунофенотипических маркеров (CD38 и ZAP-70) в прогностически разных группах больных В-ХЛЛ, выделенных по показателям времени до начала терапии и по критерию наличия МРБ на момент окончания лечения.
-
Провести сравнительный анализ результатов оценки МРБ методами многоцветной проточной цитофлуориметрии и пациент-специфичной ПЦР.
-
Модифицировать стандартизованный четырехцветный протокол оценки МРБ при В-ХЛЛ для 5- и 6-цветного цитофлуориметрического анализа, сравнить возможности различных иммунофенотипических подходов.
-
Оценить кинетику элиминации опухолевого клона В-ХЛЛ в динамике современной иммунохимиотерапии В-ХЛЛ.
-
Определить значение показателя МРБ на основании данных о выживаемости больных В-ХЛЛ.
-
Сопоставить уровень МРБ в костном мозге и периферической крови при мониторировании опухолевой популяции на фоне терапии.
Научная новизна
В работе определено значение иммунофенотипических маркеров CD38 и ZAP-70 в прогнозе качества ответа на терапию у больных В-ХЛЛ. Впервые показана значимость исследования кинетики элиминации опухолевого клона В-ХЛЛ в процессе лечения. Выявлен пороговый уровень показателя минимальной резидуальной болезни, составляющий 0,12% клеток В-ХЛЛ от числа лейкоцитов, оценка которого после первых циклов стандартного курса терапии позволяет определить вероятность достижения МРБ-негативной ремиссии у больных В-ХЛЛ.
Практическая значимость
В работе доказана зависимость результатов исследования иммунофенотипических маркеров от используемого способа интерпретации данных для внутриклеточной тирозинкиназы ZAP-70 и от величины порогового уровня экспрессии для поверхностного маркера CD38. Определены оптимальные подходы к оценке данных параметров методом проточной цитофлуориметрии. Показана хорошая сопоставимость результатов определения МРБ методами проточной цитофлуориметрии и пациент-специфичной ПЦР (93% согласующихся данных). Разработан алгоритм мониторирования противоопухолевого ответа на основе показателя МРБ, оцениваемого с помощью метода многоцветной проточной цитофлуориметрии. Определено значение используемого для оценки МРБ биоматериала (периферическая кровь или костный мозг) на различных этапах терапии В-ХЛЛ.
Личный вклад соискателя
Автором проведены клинический анализ крови и иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и костного мозга, осуществлена статистическая обработка полученных данных.
Внедрение в практику
С 2011 г. в практику иммунологического отделения клинико-диагностической лаборатории ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы внедрены методы оценки прогноза и мониторирования остаточного клона В-ХЛЛ с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии. Иммунофенотипические маркеры CD38 и ZAP-70 предложены к использованию в отделении гематологии ГКБ им. С.П. Боткина в качестве суррогатных маркеров мутационного статуса генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов и, соответственно, показателей агрессивности течения В-ХЛЛ. Разработанный алгоритм определения МРБ при В-ХЛЛ с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии успешно применен в практической оценке качества ответа на терапию при данном заболевании. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России.
Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России и сотрудников ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН, ГБУЗ «Банк стволовых клеток» ДЗМ «17» мая 2013 года. Основные положения диссертации были доложены на научно-практических конференциях «Национальные дни лабораторной медицины России 2010» (Москва, 2010), «Высокие технологии и модернизация в лабораторной медицине» (Москва, 2011), BD FACS User's Meeting (Сестрорецк, 2012), XXVIth International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology (Toronto, 2013), 18th Congress of the European Hematology Association (Stockholm, 2013). По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
