Введение к работе
Актуальность.
Одной из наиболее актуальных и сложных проблем в современной перинатологии являются инфекционные заболевания (Самсыгина Г.А., 1985; Флеминг П. и соавт., 1993; Гельфанд Б.Р. и соавт., 2006). Ключевыми бактериальными патогенами, вызывающими неонатальные инфекции являются Escherichia coli, Klebsiella spp., Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes и Lysteria monocytogenes. (Angus D.C. et al, 2001; Антонов А.Г. и соавт., 2005).
Успешное разрешение проблемы перинатальных инфекций, как в их предупреждении, так и в патогенетически оправданном и своевременном лечении зависит от использования эффективных диагностических и лечебных технологий. В связи с чрезвычайно высокой скоростью развития инфекционного процесса у новорожденного ребенка, особую значимость в неонатальной клинике приобретают методы микробиологической экспресс-диагностики. В настоящее время спектр диагностических возможностей для выявления перинатальных инфекций значительно расширился. В частности, в существующих программах по раннему выявлению инфекций у новорожденных, большое значение придается серологической диагностике, прежде всего для выявления вирусных инфекций (Гриноу А. и соавт.,2000).
В то же время существующие методы не всегда оказываются достаточно чувствительными для выявления патогенных микроорганизмов. В большей степени это относится к бактериальным патогенам, для обнаружения которых в основном используются традиционные микробиологические методы, характеризующиеся длительным временем получения результата, высокой трудоемкостью и высокой зависимостью интерпретации результатов от квалификации лабораторного персонала (Барашнев Ю.И., 2001).
В связи с этим в последние годы отдается предпочтение методам, основанным на эффектах ДНК-гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Прежде всего, речь идет о методах, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, позволяют обнаруживать присутствие микроорганизмов в микроколичествах исследуемого материала за короткое время (Виноградская Г.Р. и соавт., 1991; Ведяков А.М. и соавт., 1998; Fowlie P.W., Schmidt B., 1998). В качестве объекта исследования может быть использован любой биологический материал. Современные модификации этого метода, в первую очередь мультипраймерная ПЦР в режиме реального времени, позволяют проводить не только одновременное качественное определение присутствия нескольких патогенных микроорганизмов в исследуемом материале, но и устанавливать их количественное содержание (Carvalho G.S. et al, 2007).
В настоящее время в России не представлено ни одной тест-системы для одновременного определения методом мультипраймерной ПЦР в режиме реального времени бактерий S. agalactiae, E. coli, Klebsiella spp., являющихся основными патогенами в неонатологической практике. Разработка и внедрение в практику подобной тест-системы позволит существенно сократить время постановки диагноза новорожденных и назначения этиотропной антибактериальной терапии в отделениях интенсивной терапии и реанимации.
Цель исследования:
Разработать диагностическую тест-систему, обеспечивающую одновременную экспресс-диагностику инфекционных заболеваний, вызванных Streptococcus agalactiae, Escherichia coli и Klebsiella spp., у плодов и новорожденных детей, путем количественной детекции геномной ДНК указанных возбудителей методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Задачи исследования:
-
Подобрать нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов для детекции S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp.
-
Сравнить эффективность различных методов выделения ДНК из бактериальных культур S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. Выбрать наиболее адекватный метод, пригодный для выделения ДНК из различных видов клинического материала.
-
Создать систему калибровочных образцов ДНК и ДНК внутреннего контроля для использования в создаваемой мультипраймерной тест-системе.
-
Оптимизировать условия протекания ПЦР-РВ для детекции S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp, включая подбор оптимальной концентрации компонентов реакции и температурных режимов ее проведения.
-
Оценить чувствительность, специфичность и достоверность качественной и количественной детекции ДНК S. agalactiae, E. coli и Klebsiella spp. с использованием полученной мультипраймерной тест-системы.
Научная новизна исследования.
В ходе исследования была создана мультипраймерная тест-система позволяющая проводить одновременную детекцию методом ПЦР-РВ трех основных возбудителей неонатальных инфекций. Был произведен дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов комплементарных фрагментам генов uid A E. coli, cfb S. agalactiae, консервативному участку 16S рибосомальной РНК Klebsiella spp., а также проверена специфичность и чувствительность этих праймеров на коллекции лабораторных штаммов и клинических образцах. Кроме того был предложена модификация метода выделения геномной ДНК улучшающая выход геномной ДНК, выделяемой из бактерий рода Streptococcus.
Практическая значимость работы.
Применение разработанной тест-системы должно обеспечить раннее, в том числе доклиническое, выявление наиболее значимых перинатальных инфекций; широкий спектр дифференциально-диагностических возможностей при сходстве клинической картины заболевания у новорожденных; количественную оценку бактериальной обсемененности исследуемого материала, а также высокую чувствительность и специфичность.
Внедрение результатов работы в практику.
В настоящее время полученная тест-система используется в научно-исследовательской работе кафедр микробиологии и вирусологии, клинической лабораторной диагностики, а также кафедры неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Результаты исследования включены в материалы лекционного курса для студентов, врачей интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Положения, выносимые на защиту:
-
В ходе исследования была разработана мультипраймерная тест-система для выявления ДНК E. coli, S. agalactiae, Klebsiella spp. в образцах клинического материала методом ПЦР-РВ
-
Протокол выделения бактериальной ДНК из клинического материала, разработанный в ходе настоящего исследования, существенно повышает эффективность экстракции ДНК из бактерий рода Streptococcus.
-
Полученная диагностическая тест система характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью детекции ДНК трех основных возбудителей неонатальных инфекций в различных видах клинического материала.
Апробация работы.
Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и кафедры неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, протокол №1 от 25 февраля 2010 года.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых ВАК научных журналах.
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на русском языке, на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 180 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 9 таблицами.
