Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Методы диагностики и лечения вич-инфицированных пациентов 15
1.2. Молекулярно-генетические методы диагностики ВИЧ 44
1.3. Эпидемиологические особенности ВИЧ 57
Результаты собственных исследований 66
Глава 2. Материалы и методы 66
Глава 3. Новые молекулярно-генетические подходы, позволяющие проводить раннюю диагностику вич-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей 78
Глава 4. Использование нового подхода, основанного на одновременном выявлении нуклеиновых кислот вич и вирусов гепатита вис, для повышения инфекционной безопасности донорской крови 94
Глава 5. Обоснование молекулярно-генетических подходов при конструировании тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ и оценка их эффективности при арв терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов 107
Глава 6. Стандартизация молекулярно-генетических исследований при диагностике ВИЧ-инфекции 142
Глава 7. Использование генотипических методов определения лекарственной устойчивости вич для совершенствования арв терапии и эпидемиологического надзора за первичной резистентностью ВИЧ 155
Глава 8. Эпидемиологический надзор за распространением генетических вариантов вич с использованием молекулярно-генетических методов 182
Обсуждение 187
Выводы 202
Список литературы 204
Приложения 227
- Молекулярно-генетические методы диагностики ВИЧ
- Новые молекулярно-генетические подходы, позволяющие проводить раннюю диагностику вич-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей
- Обоснование молекулярно-генетических подходов при конструировании тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ и оценка их эффективности при арв терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов
- Использование генотипических методов определения лекарственной устойчивости вич для совершенствования арв терапии и эпидемиологического надзора за первичной резистентностью ВИЧ
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время в Российской Федерации продолжает развиваться самая крупная в Европе эпидемия ВИЧ (вируса иммунодефицита человека). Согласно данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом на конец 2010 года на территории РФ было зарегистрировано более 580 тысяч человек, живущих с ВИЧ-инфекцией (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010). В связи с этим остро встают проблемы профилактики распространения ВИЧ-инфекции, своевременного выявления ВИЧ-инфицированных лиц и их эффективного лечения.
Одной из главных проблем диагностики ВИЧ-инфекции на сегодняшний день является неэффективность серологических методов в случае выявления инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, а также у лиц на ранней стадии ВИЧ-инфекции, у которых еще не выявляются антитела к ВИЧ (в период т.н. серологического окна).
Среди зарегистрированных в РФ случаев ВИЧ-инфекции на долю детей приходится более 5000 случаев, из них 3651 ребенок инфицирован при перинатальном контакте с матерью (данные на конец 2010 года). Еще более 25000 детей в возрасте до полутора лет, рожденных в 2009-2010 гг. от зараженных ВИЧ матерей, находятся под наблюдением до окончательного установления диагноза. Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена в связи с тем, что в крови таких детей в течение длительного времени сохраняются материнские антитела к ВИЧ (Rakusan, 1991; Palasanthiran, 1994; Moodley, 1995, 1997; Chantry, 1995). По существовавшим до 2011 года в России рекомендациям постановка или снятие диагноза ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, проводилась на основании результатов серологического обследования не ранее 18 месяцев (Инструкция по профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку и образца информированного согласия на проведение химиопрофилактики ВИЧ (Утверждено приказом МЗ РФ 19.12.2003, № 606)).
Проблема, связанная с наличием серологического окна, особенно актуальна в службе донорской крови. В 2009 году в нашей стране было обследовано 4 млн. доноров, среди них выявлено с помощью серологических методов 1240 ВИЧ-инфицированных, в то время как в 2008 году из 3,7 млн. обследованных доноров было выявлено 972 ВИЧ-инфицированных (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010). Это свидетельствует о возрастающем риске переливания инфицированной ВИЧ крови.
Решением проблем серологической диагностики является внедрение прямых методов выявления инфекционного агента, в частности молекулярно-генетических методов, обладающих наибольшей чувствительностью (, 1996). Из молекулярно-генетических методов диагностики наибольшее распространение получил метод ПЦР (полимеразная цепная реакция), направленный на выявление нуклеиновых кислот (НК) вирусов и других инфекционных агентов.
Проблема лечения ВИЧ-инфицированных пациентов решается в настоящее время за счет использования комплекса антиретровирусных (АРВ) препаратов, которые позволяют увеличить продолжительность и улучшить качество жизни пациентов (Mocroft, 1998; Palella FJ Jr, 1998; Vittinghoff, 1999). Под действием лекарственных препаратов удается подавить вирусную репликацию до минимального уровня (, 2006; , 2009). Слежение за изменением содержания ВИЧ в крови (вирусной нагрузки) в процессе АРВ терапии позволяет вовремя оценить ее эффективность и в случае неудачи подобрать новую комбинацию препаратов. В настоящее время мониторинг вирусной нагрузки (концентрации РНК ВИЧ) является обязательной процедурой, как на этапе назначения терапии, так и в процессе терапии. Проведение такого рода исследований стало возможным после разработки и внедрения целого ряда количественных тест-систем, предназначенных для определения вирусной нагрузки ВИЧ.
Высокая стоимость зарубежных тест-систем ограничивает их широкое применение в России, поэтому не у всех пациентов, получающих АРВ терапию, удается адекватно оценить эффективность лечения, что в конечном итоге может приводить к развитию лекарственной устойчивости. Кроме того, далеко не все импортные тесты достаточно эффективно выявляют вирусные варианты, циркулирующие на территории РФ (в частности, наиболее распространенный субтип А, отличный от распространенного в Западной Европе и США субтипа В). Внедрение в практику дешевых отечественных тест-систем, апробированных на российских пациентах, позволит широко использовать критерий вирусной нагрузки в клинической практике.
Несмотря на использование высокоэффективных схем лечения, у достаточно большой части пациентов терапия становится неэффективной (Casado, 1998; Fatkenheuer, 1997; Moyle, 1996). Хотя причина неэффективности терапии может быть многофакторной, практически во всех случаях развивается устойчивость к используемым препаратам. Тестирование лекарственной устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам является важным дополнением в общей схеме мониторинга пациентов, получающих специфическую терапию, так как в большинстве случаев такие методы позволяют объяснить причину неэффективности терапии и назначить оптимальную комбинацию препаратов. Одним из наиболее распространенных методов определения лекарственной устойчивости ВИЧ является метод, основанный на секвенировании РНК фрагментов генома ВИЧ.
На фоне быстро развивающейся эпидемии ВИЧ в России и активного использования АРВ препаратов для лечения большого числа пациентов в ряде регионов РФ возникает опасность увеличения распространенности резистентных вариантов ВИЧ среди ВИЧ-инфицированных пациентов, что в свою очередь может приводить к повышению частоты передачи лекарственно устойчивых вариантов вируса вновь инфицированным пациентам, для которых возможности противовирусной терапии становятся ограниченными. В Западной Европе и США частота первичной устойчивости ВИЧ колеблется в диапазоне 6-23% (Weinstock, 2004; Wensing, 2005; Cane, 2005; Wheeler, 2010; Ross, 2007; Little, 2002; Grant, 2002; Masquelier, 2005; Fox, 2006; Shet, 2006). Результаты дозорного эпидемиологического надзора, показывающие, что на популяционном уровне лекарственная устойчивость ВИЧ превышает 5%, необходимо принимать во внимание с целью адаптации национальных рекомендаций, касающиеся АРВ препаратов первой линии. Поэтому очень важно проводить регулярный эпидемиологический надзор за появлением и распространением устойчивых к АРВ-препаратам вариантов вируса и заблаговременно проводить профилактические мероприятия по снижению распространения лекарственно устойчивых вирусов. Такие исследования проводятся с использования молекулярно-генетических методов определения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ.
Следовательно, роль молекулярно-генетических методов в диагностике и лечении ВИЧ-инфекции значительна. Разработка дешевых, доступных и эффективных отечественных тестов позволит заменить импортные тест-системы, что в свою очередь приведет к активному и широкому внедрению таких анализов в клиническую практику.
Немаловажную роль молекулярно-генетические методы играют при проведении эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, в частности при изучении распространенности различных субтипов ВИЧ. Изучение разнообразия субтипов ВИЧ, циркулирующих на различных территориях России, и определение их роли в эпидемическом процессе необходимы для выявления закономерностей развития эпидемии, совершенствования диагностики и создания вакцин. На сегодняшний день такие работы проводятся в России не в полном объеме, в частности по причине отсутствия доступных стандартных методик генотипирования, позволяющих с высокой точностью определять всевозможные субтипы ВИЧ и их рекомбинанты.
Цель исследования
Совершенствование лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции путем разработки и использования комплекса молекулярно-генетических подходов с учетом генетических особенностей вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории России.
Задачи исследования
-
Разработать молекулярно-генетические подходы и оценить возможность их использования для проведения ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.
-
Обосновать необходимость проведения скрининга донорской крови с помощью молекулярно-генетических методов и предложить современные подходы повышения инфекционной безопасности при переливании крови.
-
Обосновать и сконструировать оптимальный формат отечественных тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ, подтвердить их эффективность в клинической практике для прогнозирования течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности АРВ терапии в сравнении с зарубежными тест-системами.
-
Разработать методические подходы, позволяющие стандартизовать молекулярно-генетические исследования при ВИЧ-инфекции.
-
Разработать генотипический подход для определения лекарственной устойчивости ВИЧ и охарактеризовать возможность применения разработанного подхода для совершенствования АРВ терапии и проведения эпидемиологического надзора за первичной резистентностью.
-
Предложить новую технологию генотипирования ВИЧ на основе метода секвенирования, позволяющую определять большинство генотипов ВИЧ, включая рекомбинантные формы. С помощью разработанной технологии оценить разнообразие вариантов ВИЧ на территории России.
Научная новизна и теоретическая значимость работы:
-
Впервые в РФ разработана методология создания ПЦР-тест-систем для диагностики и мониторинга ВИЧ-инфекции с учетом генетических особенностей вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории РФ.
-
Впервые проведена оценка аналитических и диагностических показателей тестов, основанных на молекулярно-генетических методах и предназначенных для диагностики ВИЧ.
-
На основе разработанных молекулярно-генетических подходов для диагностики и генотипирования ВИЧ создан алгоритм оценки лабораторных показателей эффективности АРВ терапии у пациентов, инфицированных ВИЧ.
-
Определены частота и характер развившейся лекарственной устойчивости у ВИЧ-инфицированных пациентов, получавших различные схемы АРВ терапии в течение нескольких лет.
-
Сформулированы теоретические положения, обосновывающие проведение скрининга донорской крови на наличие вирусных маркеров с помощью молекулярно-генетических методов.
-
Получены новые данные о распространенности различных субтипов ВИЧ в России в 2003 и 2007 гг. и проведена оценка полученных результатов по сравнению с данными, полученными в более ранние годы.
-
Показана высокая эффективность метода секвенирования для определения генотипа ВИЧ по сравнению с другими методами генотипирования.
-
Разработаны методические подходы стандартизации лабораторных исследований для ВИЧ-инфекции, основанных на молекулярно-генетических методах.
Практическая значимость исследования:
-
Разработан комплекс отечественных диагностических препаратов на основе молекулярно-генетических методов, которые позволили усовершенствовать диагностику, мониторинг и лечение ВИЧ-инфицированных пациентов. На основе разработанных методологических подходов созданы наборы реагентов: «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT», «АмплиСенс ВИЧ Монитор» «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT», «АмплиСенс ВИЧ-генотип-Eph», которые зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.
-
Разработаны методические рекомендации по использованию тест-систем на основе молекулярно-генетических методов, позволяющие оптимально использовать молекулярно-генетические тесты в клинической и лабораторной практике.
-
Впервые в РФ разработаны и внедрены в клиническую практику молекулярно-генетический подход и алгоритм его использования для ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.
-
Разработана стандартная панель контрольных образцов, содержащих РНК ВИЧ, для проведения внешнего и внутрилабораторного контроля качества молекулярно-генетических исследований в области ВИЧ-инфекции.
-
Создана система эпидемиологического надзора за циркуляцией различных вариантов ВИЧ с помощью молекулярно-генетических методов для оценки генетического разнообразия вируса и эпидемиологических расследований новых случаев инфицирования ВИЧ.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики, учитывающие генетические особенности вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории РФ, позволяют более эффективно проводить диагностику и мониторинг российских ВИЧ-инфицированных пациентов.
-
Использование стандартной панели контрольных образцов, содержащих РНК ВИЧ, позволяет проводить внешний и внутрилабораторный контроль качества молекулярно-генетических исследований в области ВИЧ-инфекции.
-
Разработанные с учетом генетического разнообразия ВИЧ тест-системы обладают высокими аналитическими и диагностическими показателями.
-
Использование метода секвенирования для генотипирования ВИЧ позволяет проводить эпидемиологический мониторинг за циркулирующими в России вариантами ВИЧ, в том числе первично устойчивыми к АРВ препаратам, а также проводить эпидемиологические расследования, связанные с передачей ВИЧ.
Внедрения результатов работы
Разработанные ПЦР-тест-системы поставляются за счет федерального бюджета в региональные Центры СПИД по всей территории РФ в рамках Национальных приоритетных проектов и государственных контрактов.
В 2005 году была осуществлена поставка 123 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» в 46 регионов России (Государственный контракт № 04/1037 от 6.09.2005), 226 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 46 регионов России (Государственный контракт № 04/1037 от 6.09.2005). В 2006 году было поставлено 167 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» в 47 регионов (Государственный контракт № 04/1307 от 11.08.2006), 2700 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 55 регионов (Государственный контракт № 04/159 от 27.02.2006). В 2007 году было поставлено 340 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 59 регионов страны (Государственный контракт № 04/315 от 10.05.2007), 5261 набора тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 31 регион (Государственный контракт № 04/316 от 10.05.2007), 168 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 23 региона (Государственный контракт № 04/315 от 10.05.2007), 1448 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в 26 регионов (Государственный контракт № 04/317 от 10.05.2007). В 2008 году ЦНИИЭ осуществил поставку 249 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 31 регион страны (Государственный контракт № 52-Д от 3.10.2008), 1172 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 13 регионов (Государственный контракт № 54-Д от 3.10.2008), 452 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 43 региона (Государственный контракт № 53-Д от 3.10.2008), 2010 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в 35 регионов (Государственные контракты №№ 55-Д и 56-Д от 3.10.2008). В 2009 году ЦНИИЭ осуществил поставку 155 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 27 регионов страны (Государственный контракт № 84-Д от 10.06.2009), 266 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 5 регионов (Государственный контракт № 86-Д от 10.06.2009), 339 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 52 региона (Государственный контракт № 85-Д от 10.06.2009), 1280 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в 36 регионов (Государственные контракты № 89-Д от 10.06.2009 и 129-Д от 11.06.2009). В 2010 году ЦНИИЭ осуществил поставку 104 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» в 17 регионов страны (Государственный контракт № SBR1010080549-00001833-01 от 1.11.2010), 204 наборов тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» в 3 региона (Государственный контракт № SBR1011130915-00001833-01 от 30.08.2010), 344 наборов тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-FRT» в 62 региона (Государственный контракт № SBR1010080550-00001833-01 от 19.11.2010).
Алгоритмы проведения исследований на вирусную нагрузку и лекарственную устойчивость ВИЧ были опубликованы в Сборнике нормативно-правовых актов и методических документов по вопросам диагностики, лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора ВИЧ/СПИД и сопутствующих заболеваний в 2007 году.
Основные положения диссертации используются при чтении лекций, проведении научно-практических конференций, практических занятий и семинаров, включены в программу тематических семинаров для специалистов лабораторной службы в рамках курсов повышения квалификации.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации были доложены на 3-ей Всероссийской научно-практической конференции “Генодиагностика в современной медицине” в 2000 году, Москва; 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» в 2000 году, Саратов; совещании-семинаре “Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции” в 2001 году, Саратов; 4-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» в 2002 году, Москва; 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» в 2004 году, Москва; Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» в 2005 году, Новосибирская обл.; совещании по вопросам лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в 2005 году, Суздаль; III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» в 2006 году, Новосибирск; Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» в 2006 году, Алма-Аты, Республика Казахстан; Международной научно- практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» в 2007 году, Минск, Беларуссия; 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007» в 2007 году, Москва; Второй конференции по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии в 2008 году, Москва; 7-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» в 2010 году, Москва.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 57 работ, из них 12 – в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 – патент на изобретение.
Личный вклад автора
Автором сформулирована концепция работы, составлен план её выполнения, сформулированы и обоснованы новые молекулярно-генетические подходы для диагностики ВИЧ-инфекции, лично разработаны основные компоненты тест-систем, составлен план экспериментальной части разработок молекулярно-генетических методик, проведена оценка результатов и предложены новые подходы молекулярно-генетического тестирования ВИЧ-инфицированных пациентов. Автор принимала участие в планировании и проведении лабораторных, клинических и Государственных испытаний разработанных тест-систем. Автором оценивались все первичные данные по проведенным исследованиям, лично собран клинический материал, произведена систематизация, статистическая обработка и анализ полученных результатов.
Автором разработаны и опубликованы методические рекомендации по использованию тест-систем на основе молекулярно-генетических методов в клинической практике. Большая часть опубликованных работ написана автором или при непосредственном ее участии.
Структура и объем диссертации
Диссертация представлена на 230 страницах, включая 25 рисунков, 25 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов. Список использованной литературы включает 16 отечественных и 176 зарубежных источников.
Молекулярно-генетические методы диагностики ВИЧ
На сегодняшний день существует 3 основных подхода для проведения молекулярных исследований в области ВИЧ-инфекции: полимеразная цепная реакция (ПНР); изотермальная амплификация (NASBA) и bDNA (разветвленная ДНК-гибридизация).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), изобретенная в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом, представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы in vitro. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами (короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований). Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы.
Первая публикация, посвященная методу ПЦР, появилась в 1985 году в журнале Science (Saiki, 1985). Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты: ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент); праймеры, комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента; смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК); фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, с помощью которой происходит элонгация цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК); буферный раствор.
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах (рис. 4): 1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95 в течение 30-40 сек. 2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой оригинальной пары праймеров требуется своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65С. Время отжига -20-60 сек. 3 этап: Достраивание цепей ДНК (элонгация). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5 -конца к 3 -концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза осуществляется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq полимеразой) и проходит при температуре 70-72С. Время протекания синтеза - 20-40 сек. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2П, где п - число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 10 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
Изотермальная амплификация (NASBA). В основе метода NASBA лежит реакция транскрипционно опосредованной амплификации, в ходе которой происходит увеличение количества РНК, транскрибируемой со специального промотора (используется промотор для Т7-полимеразы), входящего в состав специфического праймера, который отжигается в определенном месте РНК- (и или ДНК) мишени. Если в случае первичной мишени используется РНК-матрица, то первые стадии процесса формируют полноценную структуру промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 для инициирования транскрипции. Для достраивания второй цепи ДНК после первого этапа - обратной транскрипции используется фермент РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). Фермент РНКаза Н удаляет матричную РНК после синтеза первой цепи ДНК и, следовательно, делает процесс "денатурации" ДНК-РНК гибрида (за счет гидролиза РНК) автоматически воспроизводимым в каждом последующем цикле амплификации. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза транскрибирует за один цикл, время которого составляет 5-15 мин., 105копий фрагментов РНК. Таким образом, в течение 40-50 мин изотермической транскрипционно опосредованной амплификации ДНК или РНК в растворе образуется 10-10 копий. В отличие от ПЦР амплификация в NASBA протекает изотермически — при +41 С, что позволяет отказаться от оборудования, обеспечивающего циклическое изменение высоких температур.
В России тесты, основанные на методе изотермальной амплификации, не используются для диагностики ВИЧ-инфекции.
Разветвленная ДНК (bDNA). Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов представляет собой пример амплификационных технологий, позволяющих усиливать в ходе определения сигнал. В результате многоступенчатого процесса гибридизации происходит присоединение многочисленных зондов, коньюгированных с молекулами фермента, окисляющего специальный субстрат и запускающий таким образом хемилюминесценцию.
Недостатком тестов, основанных на методе bDNA, является невозможность проведения исследований по выявлению возбудителя инфекции. Методика предназначена только для количественных определений. В России единичные лаборатории имеют оборудование для bDNA и проводят количественные определения вирусной нагрузки ВИЧ и вирусных гепатитов.
Новые молекулярно-генетические подходы, позволяющие проводить раннюю диагностику вич-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей
Одной из важнейших задач в диагностике ВИЧ-инфекции является выявление ВИЧ у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Как уже было ранее отмечено, процент новорожденных детей, заразившихся от матерей, зависит от комплекса проведенных профилактических мероприятий. В случае, если беременная женщина получала эффективную АРВ терапию, роды были проведены путем кесарева сечения, а ребенок не получал грудное молоко, риск передачи ВИЧ от матери ребенку становится минимальным.
До недавнего времени для того, чтобы определить, инфицирован новорожденный ребенок или нет, необходимо было в течение 1,5 лет наблюдать за ребенком, и единственным диагностическим тестом был иммуноферментный анализ, позволяющий выявлять антитела к ВИЧ. Только исчезновение материнских антител к 1,5 годам могло свидетельствовать об отсутствии инфекции у ребенка.
Для более ранней диагностики ВИЧ у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, необходимо выявлять сам вирус, а не антитела к нему. На сегодняшний день оптимальным методом прямого выявления вируса в организме является метод ПНР, позволяющий с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять нуклеиновые кислоты микроорганизмов. За рубежом была разработана тест-система, предназначенная для диагностики ВИЧ у новорожденных детей («Amplicor HIV-1 test», Хоффманн-Ла Рош). Однако в силу низкой эффективности выявления некоторых субтипов ВИЧ, а также по другим вышеописанным причинам (см. обзор литературы) данная тест-система не используется в нашей стране. В странах, где тест-система «Amplicor HIV-1 test» не может быть использована, рекомендуется проводить диагностику новорожденных детей с помощью тест-систем, предназначенных для определения концентрации РНК ВИЧ в плазме крови. Это в свою очередь приводит к появлению двух важных проблем: высокая стоимость исследования (100-200 долл. США за одно исследование) и низкая информативность теста в тех случаях, когда ребенку сразу после рождения назначают профилактический курс АРВ терапии (т.к. под действием препаратов репликация вируса быстро подавляется и РНК ВИЧ не определяется в плазме крови).
В связи с этим первой задачей настоящей работы было разработать ПЦР-тест-систему, позволяющую выявлять ДНК провируса ВИЧ, обладающую низкой стоимостью и высокой эффективностью в отношении большинства вариантов ВИЧ, распространенных на территории РФ. В дальнейшем такая тест-система могла бы быть использована для верификации диагноза ВИЧ-инфекции после получения сомнительных результатов ИБ и даже положительных результатов ИФА, минуя исследования методом ИБ. Для этих целей необходимо использовать именно ДНК-тесты, а не РНК, т.к. у части пациентов в латентном периоде концентрация вируса может снижаться до нескольких вирионов в 1 мл плазмы крови (Mulder, 1997). Ранее было показано, что во время латентной фазы инфекции основным депо активного размножения ВИЧ является лимфоидная ткань, в то время как активность репликации ВИЧ в периферической крови в это время минимальна (Pantaleo, 1993).
Разработка ПЦР-тест-систем для выявления ДНК провируса ВИЧ состояла из 4 этапов: 1) выбор оптимальных способов экстракции ДНК из цельной крови; 2) подбор праймеров, позволяющих с высокой чувствительностью и одинаковой эффективностью выявлять наиболее распространенные субтипы ВИЧ-1; 3) разработка внутреннего контрольного образца (ВКО); 4) разработка методов детекции продуктов ПЦР на основе ГИФА и Realime ПЦР. Несмотря на то, что основным этапом разработки тест-системы является создание праймеров, также необходимо было подобрать оптимальные способы пробоподготовки. Поскольку тест предназначен для выявления провирусной ДНК, в качестве клинического материала необходимо было использовать цельную кровь, а точнее лейкоциты крови. Одним из самых простых способов экстракции геномной ДНК из лейкоцитов крови является обработка осадка лейкоцитов протеиназой К после избирательного лизиса эритроцитов. Разработанный комплект получил название «Цитолизин». Полученный таким образом лизат лейкоцитов содержит геномную ДНК, которая может нести встроенную провирусную ДНК ВИЧ. Преимуществом такого метода является быстрота и простота процедуры, однако существенным недостатком является то, что экстрагированная ДНК содержит большое количество ингибиторов ПЦР, что может приводить к получению ложноотрицательных результатов. Кроме того, такая процедура требует определенных навыков работы и ее достаточно сложно стандартизовать. При недостаточном уровне подготовки персонала данный метод может привести к значительному снижению чувствительности анализа и большому числу ложноотрицательных результатов. Для повышения эффективности экстракции ДНК была разработана полуавтоматическая методика выделения лейкоцитов из цельной крови. В основу разработанной методики был положен принцип иммунной сорбции клеток крови, содержащих CD4 рецепторы (т.е. тех клеток, которые инфицирует и в геном которых интегрирует ВИЧ). В качестве «сорбента» использовали парамагнитные частицы, покрытые моноклональными антителами, специфичные к С04-рецепторам («Dynal», Норвегия). Для автоматизации процедуры выделения CD4 позитивных клеток, связавшихся с магнитными частицами, использовали полуавтоматический экстрактор KingFisher ml («Thermo Labsystems», Финляндия).
Обоснование молекулярно-генетических подходов при конструировании тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ и оценка их эффективности при арв терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов
Разработка количественных тест-систем состояла из четырех основных этапов: 1) разработка нескольких методов выделения РНК из образца плазмы крови, позволяющих проводить экстракцию РНК с одинаковой эффективностью. (Возможность проведения экстракции разными способами даст возможность врачам-лаборантам самостоятельно выбрать удобный для них метод в зависимости от предпочтений и наличия оборудования.); 2) выбор праймеров для ПЦР и оптимизация условий ОТ-ПЦР; 3) разработка методов детекции продуктов ПЦР; 4) разработка количественных стандартов. В ходе настоящей работы был проведен анализ нескольких способов экстракции РНК из плазмы крови, один из которых предполагал использование автоматической станции. Методика, основанная на высаживании РНК с помощью фенол-хлороформной экстракции и описанная Chomczynski Р. и Sacchi N. (1987), не рассматривалась изначально как возможный вариант пробоподготовки в коммерческой тест-системе, поскольку является достаточно трудоемкой, мало стандартизуемой и обладает высоким риском контаминации при переносе образца из пробирки в пробирку.
В качестве «золотого стандарта» был выбран метод экстракции НК, основанный на аффинной сорбции РНК на силикагеле после лизиса гуанидин тиоционатом (описана Boom R. и соавт. в 1990 г.). Несмотря на многоэтапность процедуры, методика является достаточно простой и позволяет получить препарат РНК максимальной чистоты.
Другая методика экстракции НК, которая была разработана, заключается в осаждении НК с помощью изопропанола после лизиса биологического материала гуанидин тиоционатом. В качестве соосадителя, при этом, используется гликоген. Данная методика часто используется в коммерческих тест-системах зарубежных производителей (например, в тест-системах фирмы «Хоффманн-Ла Рош»). В ходе разработки были выбраны оптимальная концентрация гликогена и условия осаждения.
При сравнительном анализе оба метода выделения НК продемонстрировали одинаковую эффективность экстракции РНК из плазмы крови.
Поскольку в последние годы ПЦР-исследования стали носить масштабный характер, встала проблема стандартизации и автоматизации ПЦР-анализа. К тому времени в мире было разработано огромное количество приборов, позволяющих автоматизировать как отдельные этапы анализа, так и целиком ПЦР-анализ. Единственным лимитирующим фактором в распространении таких приборов является их стоимость. Кроме того, многие производители создают автоматические приборы в «закрытом» формате, т.е. такие приборы могут быть использованы только в комплексе с определенными реактивами и/или тест-системами. В ряде случаев «закрытые» приборы позволяют осуществить всего несколько исследований, что существенно ограничивает возможности ПЦР- лаборатории. Так, например, широко представленные в России тест-системы фирмы «Хоффманн-Ла Рош» предполагают использование автоматизированных станций для проведения ПЦР-анализа (Cobas Amplicor, Cobas AmpliPrep). Помимо крайне высокой стоимости приборов, расходных материалов и реагентов для проведения анализа, для данного оборудования предлагается ограниченный спектр тест-систем. В частности, нет тест-систем для выявления ДНК провируса ВИЧ, ДНК ЦМВ в клетках крови, а также большинства других возбудителей оппортунистических инфекций.
Поэтому для решения вопроса об автоматизации ПЦР-анализа была поставлена задача найти недорогое, при этом качественное оборудование, позволяющее проводить различные исследования с использованием разного клинического материала. Для автоматизации этапа пробоподготовки была выбрана автоматическая станция для экстракции НК, которая позволяет работать не только с разнообразным клиническим материалом, но и с разными объемами этого материала. Станция называется easyMAG производства bioMerioux (Франция). В основе работы прибора лежит методика сорбции НК на силикагеле, которая зарекомендовала себя как «золотой стандарт» в методах экстракции НК. Отличительной особенностью прибора является возможность экстракции НК из клинического материала объемом до 1 мл, что позволяет на порядок повысить чувствительность метода. Для подтверждения высокой эффективности экстракции НК с помощью прибора easyMAG и возможности его использования для количественных исследований были протестированы образец СОП, его разведения и клинические образцы (32 образца плазмы крови).
В процессе адаптации прибора easyMAG было выявлено, что отношение эффективностей экстракции РНК ВИЧ и ВКО не одинаково для «ручного» и автоматического методов. В связи с этим был рассчитан коэффициент регрессии (по результатам тестирования СОП и их разведений) и введен корректирующий коэффициент в количественные результаты.
После введения корректирующих коэффициентов были проанализированы клинические образцы (табл. 7). Разница между результатами, полученными с помощью «ручного» (набор «Рибо-сорб») и автоматического (прибор easyMAG) методов экстракции НК, не превышает 0,3 lg, что свидетельствует о высокой сходимости результатов. В качестве референсных значений были использованы результаты вирусной нагрузки, полученные в тест-системе «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» фирмы Хоффманн-Ла Рош. Разница между значениями, полученными с помощью разных тест-систем, не превышает 0,5 lg, что свидетельствует об отсутствии достоверных отличий между результатами, но превышает разницу значений, полученных с помощью разных методов выделения РНК из одной тест-системы.
Использование генотипических методов определения лекарственной устойчивости вич для совершенствования арв терапии и эпидемиологического надзора за первичной резистентностью ВИЧ
При неэффективности проводимой терапии необходимо принять меры по установлению степени приверженности пациента АРВ терапии (есть ли перерывы в приеме препаратов) или указаний на нарушение всасывания препарата. Следует учитывать, что введение вакцин, суперинфекция ВИЧ и острые инфекционные заболевания (туберкулез, пневмококковая пневмония) могут провоцировать увеличение показателя вирусной нагрузки. При отсутствии перечисленных факторов проводят исследование на наличие устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам.
Помимо описания показаний к исследованию на вирусную нагрузку (которые по сути мало отличаются от зарубежных рекомендаций (Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-Infected Adults and Adolescents, 2011.)) для качественного проведения подобных исследований необходимо было разработать алгоритм проведения самого исследования с описанием грамотной интерпретации результатов. Подобных рекомендаций за рубежом не существует.
При проведении количественных измерений с помощью молекулярно-генетических методов большое значение имеет качество выполненного исследования. Для проведения контроля качества в обязательном порядке должны использоваться контрольные образцы. Чаще всего в тест-системах представлено 2 положительных контрольных образца (ПКО) с высокой и низкой концентрацией РНК ВИЧ. Эти контроли должны быть протестированы вместе с клиническими образцами независимо от числа исследуемых образцов. Анализ полученных результатов должен начинаться с анализа именно контрольных образцов, и только потом можно приступать к анализу клинических образцов. Для каждого контрольного образца определена концентрация РНК ВИЧ в препарате фирмой-производителем. Эта концентрация, а точнее ее диапазон, указывается на специальном вкладыше, прилагаемом к тест-системам, или непосредственно в инструкции. Результаты вирусной нагрузки, полученные в ходе каждого исследования для положительных контролей, должны укладываться в указанный диапазон. В противном случае нельзя гарантировать качество проведенного исследования, и поэтому нельзя доверять значениям вирусной нагрузки, полученным для клинических образцов.
Еще одним важным контрольным образцом в ходе исследований является отрицательный контрольный образец (ОКО), который выполняет функцию контроля за ложноположительными результатами. В случае получения позитивного результата для ОКО все результаты, полученные в ходе данного исследования должны быть забракованы, поскольку в такой ситуации речь может идти как о спорадической контаминации в процессе выполнения отдельных этапов анализа, так и о тотальной контаминации реактивов. В создавшихся условиях проводить повторное исследование возможно только после выявления источника контаминации и проведения работ по его устранению.
Следующим важным этапом анализа является оценка качества проведенного исследования для каждой тестируемой пробы. Для этого используется внутренний контрольный образец (ВКО), который добавляется в каждую исследуемую пробу. В большинстве количественных тестов используется количественно охарактеризованный ВКО, с помощью которого производится расчет концентрации РНК ВИЧ в исследуемой пробе, т.е. ВКО выполняет функцию количественного стандарта. В некоторых тест-системах ВКО играет только роль контроля качества, а точнее контроля за ложноотрицательными результатами. Но независимо от назначения ВКО в конкретной тест-системе, качество прохождения ВКО для каждой пробы должно соответствовать заданным требованиям.
Только после вышеперечисленных этапов анализа можно переходить к количественному анализу клинических образцов. При получении количественных результатов необходимо обращать внимание на линейный диапазон, в котором работает тест-система. Значения вирусной нагрузки, не укладывающиеся в этот диапазон, должны быть представлены не в виде абсолютных величин, а в виде значения «болыпе»/«меньше». В ряде случаев образцы могут быть перетестированы после предварительного разведения (если было получено значение выше верхнего порога) или после дополнительного концентрирования вируса (если было получено значение меньше нижнего порога). Для концентрирования вируса существует несколько подходов: ультрацентрифугирование большого объема плазмы крови (например, 1 мл) либо проведение анализа непосредственно из 1 мл плазмы. Для ультрацентрифугирования используются соответствующие центрифуги, при этом процедура анализа увеличивается как минимум на 1 час. При непосредственном исследовании больших объемов плазмы анализ не удлиняется по времени, однако чаще всего для этого используются автоматические станции для экстракции НК. Работа вручную с большими объемами клинического материала значительно увеличивает риск контаминации от пробы к пробе, поэтому такой способ пробоподготовки не желателен в клинической лаборатории.
Проведение исследования на вирусную нагрузку осуществляют в лабораториях молекулярных методов, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот. Устройство лаборатории изложено в Методических Указаниях «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I—IV групп патогенносте» (2009).
