Механизмы иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции и вирусного гепатита С на оригинальных моделях гуманизированных мышей Ковалев, Григорий Игоревич

Введение к работе

доцент Т.Е. Кузнецова

Актуальность

В последние десятилетия медицинским работникам различных специальностей приходится иметь дело с особым видом инфекционных заболеваний. Данные инфекции, как правило вирусной этиологии, не вызывают в большинстве случаев яркой клинической симптоматики во время и непосредственно после инфицирования, но их возбудители, проникая в клетки и реплицируясь в них, приводят к длительной персистенции инфекции, что проявляется тяжелыми хроническими заболеваниями, приводящими к инвалидизации и смерти значительного числа пациентов (Dustin L.B., 2007; Kallings L.O., 2008). Прежде всего, речь идет о инфекциях, возбудителями которых являются вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус гепатита С (ВГС) и вирус гепатита В (ВГВ), вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) и другие герпесвирусы (например, вирус саркомы Капоши). Ряд нозологий, вызываемых указанными вирусами, включает СПИД, хронический гепатит с исходом в цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному, лимфомы, саркомы и т.д. (Хаитов Р.М., 1992; Bruno S., 2008).

Вовлечение иммунной системы играет основную роль в патогенезе указанных заболеваний. Иммунопатогенез данных заболеваний многогранен. Во-первых, для многих вирусов иммунные клетки являются мишенями и местом репликации, что приводит к прямой и опосредованной гибели клеток или их патологическому функционированию (Giorgi J.V., 1987; Siegal F.P., 2001; Oswald-Richter K., 2004; Joshi A., 2004). Во-вторых, указанные вирусы обладают уникальной способностью уклоняться от иммунного ответа путем многочисленных механизмов (Bowen D.G., 2005; Dustin L.B., 2007). В-третьих, инфицирование приводит к неконтролируемой активации иммунной системы, являющейся ключевым фактором в патогенезе тяжелейших иммунологических и онко-гематологических заболеваний (Giorgi J.V., 1993; Dustin L.B., 2007). Расшифровка всех уровней патогенеза позволит развивать иммунопатогенетическую терапию и профилактику данных заболеваний. Серьезным лимитирующим фактором в изучении иммунопатогенеза этих патологических процессов является тот факт, что данные инфекции строго специфичны для человека, в связи с чем использование классических моделей животных крайне ограничено. Например, экспериментальное изучение приматов, несмотря на их важную роль в подобных исследованиях, имеет ряд существенных недостатков (Bukh J., 2004), таких как значительные отличия патогенеза и манифестации данных инфекций от таковых у человека, дороговизна и наличие этических проблем. Использование же малых животных – мышей, как моделей системной инфекции практически невозможно в связи с тем, что указанные вирусы не в состоянии проникать в клетки грызунов, реплицироваться в них и вызвать адекватный инфекционный процесс и иммунный ответ.

Поскольку необходимость адекватных моделей животных для экспериментальной медицины очевидна, в последние три десятилетия ведутся работы над ксенотрансплантацией тканей человека лабораторным животным, в особенности мышам, как наиболее универсального представителя экспериментальных моделей (McCune J.M., 1988; Mosier D.E., 1998, Tary-Lehmann M., 1994). Наибольший прогресс в подобных исследованиях отмечается в последнее десятилетие, в связи с появлением эффективных иммунодефицитных мышей-реципиентов человеческих тканей (Lock R.B., 2002; Traggiai E., 2004; Gimeno R., 2004), что позволило создание гумманизированных мышей (“humanized mice (hu-mice)” (англ.)) – иммунодефицитныx животных, обладающих человеческими клетками, тканями, органами и системами, трансплантированными и развившимися впоследствии. “Гуманизация” мышей, особенно с использованием трансплантации клеток-предшественниц тканей человека позволяет экспериментально исследовать человеческие физиологические и патологические процессы in vivo, что без подобных моделей было бы невозможно (Shultz L.D., 2007).

Цель работы

Определить иммунопатогенетические механизмы развития ВИЧ- инфекции и вирусного гепатита С в разработанных оригинальных моделях гуманизированных мышей с трансплантированными клеточными линиями иммуногемопоэза и гепатопоэза человека.

Задачи исследования

1. Разработать адекватную мышиную модель человеческого гемопоэза и системной инфекции, позволяющую изучать механизмы вирусной репликации и иммунного ответа при ВИЧ и других инфекциях.

2. Доказать адекватность патогенеза экспериментальной ВИЧ-1 инфекции в данной модели патофизиологическим процессам в организме человека при ВИЧ-1 инфицировании.

3. Изучить функциональные свойства Т-регуляторных клеток и их роль в ВИЧ-1 инфекции в данной гуманизированной мышиной модели.

4. Определить функциональные свойства плазмоцитоидных дендритных клеток и их роль в иммунопатогенезе ВИЧ-1 инфекции в данной гуманизированной мышиной модели.

5. Создать мульти-гуманизированную мышиную модель, позволяющую изучать патогенез гепатотропных инфекций человека, в первую очередь вирусных гепатитов С и В.

6. Изучить некоторые аспекты иммунопатогенеза инфекции вирусом гепатита С с использованием созданной модели гепатотропной инфекции.

7. Разработать подходы к созданию терапевтических вакцин для гемо-гепатотропных инфекций.

Научная новизна

1. Впервые показано, что гуманизированная мышиная ДНО-hu модель может быть использована для изучения ВИЧ-1 инфекции in vivo.

2. Впервые ДНО-hu модель была комплексно охарактеризована, с демонстрацией наличия и функциональной достаточности Т-регуляторных и плазмоцитоидных дендритных клеток человека; была изучена роль данных клеточных популяций в патогенезе ВИЧ-1 инфекции.

3. Впервые создана и охарактеризована принципиально новая гуманизированная мышиная модель (AFC8-hu HSC/Hep), являющаяся на сегодняшний день первой оригинальной гуманизированной мышиной моделью с человеческой иммунной системой и клетками печени.

4. Впервые показана возможность инфицирования AFC8-hu HSC/Hep мышиной модели вирусом гепатита С человека, с развитием персистирующей инфекции, индуцирующей ВГС-специфический иммунный ответ человека, а также поражение печени с лимфоцитарной инфильтрацией и развитием гепатита и фиброза.

5. Впервые in vivo было показано, что эктопическая экспрессия молекулы LIGHT (клеточный рецептор, индуцирующийся на активированных Т-клетках и являющийся лигандом к рецептору -лимфотоксина (LTR) и HVEM (herpes virus entry mediator)) приводит к разрешению экспериментальной инфекции в печени за счет иммуномодуляции.

Практическое значение

Основное практическое значение работы заключается в разработке и создании современной in vivo мышиной модели специфичных для человека персистирующих вирусных инфекций.

Проведенная при усовершенствованнии существующей ДНО-hu модели более углубленная характеристика позволяет использовать ее как модель для изучения ВИЧ-инфекции, включая изучение вирусологических аспектов, механизмов иммунопатогенеза всех уровней, а также вопросов профилактики, терапии и вакцинации. В настоящее время модель широко используется для оценки эффективности и поиска новых противо-ВИЧ препаратов, а также для тестирования методов профилактики трансмиссии ВИЧ.

Продемонстрированная экпериментально-индуцированная популяционная деплеция Т регуляторных (Трег) лимфоцитов позволяет использовать данный метод для изучения роли этих клеток при ряде патологических процессов, а также расширить данный подход для изучения роли других лимфоцитарных популяций.

На основе ДНО-hu модели была создана принципиально новая модель (AFC8-hu HSC/Hep), воспроизводящая гемопоэз и гепатопоэз человека, показана возможность использования ее для изучения ВГС инфекции. В настоящее время данная модель используется для изучения ВГВ инфекции, разработки и тестирования препаратов для терапии данных гепатотропных инфекций, их профилактической и терапевтической вакцинации и изучения комбинированных инфекций: ВИЧ/ВГС/ВГВ. Наличие человеческой печеночной ткани в данной модели позволяет исследовать влияние алкоголя на течение инфекций ВГВ, ВГС и ВИЧ и поражений печени, а так же гепатотоксичность различных препаратов. Наличие фиброза печени в данной модели, являющегося результатом вирус-индуцированной патологии иммунной системы, позволяет изучать патогенез и терапевтические тактики при данной патологии.

Нами были получены данные, демонстрирующие терапевтический иммуномодуляционный эффект эктопической экспрессии молекулы LIGHT при экспериментальной персистирующей инфекции печени. Следовательно, данный подход может быть использован для создания терапевтических вакцин, обладающих противовирусным эффектом.

Положения, выносимые на защиту

5. 1. Гуманизированная ДНО(RAG2/C-/-)-hu мышиная модель, сконструированная путем трансплантации CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека новорожденным иммунодефицитным RAG2/C-/- мышам, является эффективной мышиной in vivo моделью иммуногемопоэза человека и может быть использована для изучения патогенеза и терапии ВИЧ-1 инфекции.

   2. Клетками-мишенями ВИЧ-1 инфекции являются Т регуляторные CD4⁺ клетки (Трег), что коррелирует с увеличением их апоптоза. Трег содействуют генерализации ВИЧ-1 в острой фазе заболевания.

   3. Инфицирование ВИЧ-1 плазмоцитоидных дендритных клеток вызывают деплецию CD4+ Т-лимфоцитов и нарушение иммуного ответа

   4. Гуманизированная мышиная (AFC8-hu HSC/Hep)-модель, созданная путем трансплантации гемопоэтических клеток и гепатоцитов человека является уникальной моделью для изучения патологии печени человека, в частности патогенеза и терапии инфекции ВГС и вирусиндуцированного фиброза печени.

   5. Поражение печени при ВГС инфекции у AFC8-hu HSC/Hep мышей обусловленно наличием сочетанного действия вируса и иммунного ответа хозяина. Использвание оригинальной модели ВГС-инфекции позволило установить иммунный генез фиброза печени.

   6. Генно-инженерная индукция экспресии молекулы LIGHT у негумманнизированных мышей, инфицированных гепатотропными вирусными векторами приводит к иммуно-опосредованному разрешению инфекции, что является основанием для дальнейшей разработки подобных терапевтических вакцин для терапии гепатотропных и, возможно, других персистирующих инфекций.

   Внедрение в практику

   Результаты исследования внедрены в работу ряда лабораторий Онкологического Центра Лайнебергер и Центра инфекционных болезней медицинской школы Университета Северной Каролины, Отдела инфекционных заболеваний Медицинского центра Юго-Восточного Техасского Университета, США, ФГБУ «ФНКЦ детской гематологии онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачёва» и ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Основные положения диссертации используются в новой быстроразвивающейся международной области экспериментальной медицины – “Humanized Mice”.

   Апробация диссертации

   Основные результаты работы доложены на ежегодных конференциях Американского общества гематологов (Новый Орлеан, США, 1999) и Американской ассоциации иммунологов (Новый Орлеан, США, 2002; Денвер, США, 2003 ), заседаниях научной группы иммунологов/вирусологов научного треугольника Северной Каролины (Дурам, США, 2008, 2011), 3-м Международном воркшопе по гуманизированным мышам (Питсбург, США, 2011), симпозиуме HepDART^TM 2011 (Колоа, США, 2011), VI и XIX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, Россия, 2000 и 2012 гг.), научно-клинических конференциях ФГБУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачёва» Минздравсоцразвития России (2011), Национального общества детских гематологов онкологов (Москва, Россия, 2012).

   Основные положения диссертации апробированы на совместной научно-практической конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ФГБУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачёва» Минздравсоцразвития России 27 апреля 2012 и на межлабораторной конференции Онкологического Центра Лайнебергер Университета Северной Каролины в Чапел Хилл, США 23 марта 2012 года.

   Структура и объем диссертации

   Материал изложен в одном томе на _____ страницах машинописного текста, содержит _____ таблиц и проиллюстрирован ____ рисунками. Указатель литературы включает ____ источника. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

   Похожие диссертации на Механизмы иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции и вирусного гепатита С на оригинальных моделях гуманизированных мышей

   

   Фенотипические особенности лейкоцитарных клеток больных ВИЧ-инфекциейРешетников Игорь Владимирович

   

   Совершенствование лабораторной иммунодиагностики ВИЧ-инфекцииТыргина, Татьяна Вячеславовна

   

   Комплекс молекулярно-генетических методов для мониторинга ВИЧ-инфекцииБогословская, Елена Владимировна

   Интеграционная эпидемиология инфекций с гемоконтактным механизмом передачи (ВИЧ, гепатиты В и С) в Республике Саха (Якутия)Лаптева, Ньургустана Ивановна

   

   Некоторые особенности механизмов апоптоза при ВИЧ-инфекцииКолесникова Ирина Николаевна

   

   Научное обоснование механизма развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на основе молекулярно-генетических исследованийЗверев, Сергей Яковлевич

   

   МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ И ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ПАРОДОНТИТА У БОЛЬНЫХ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙОсеева Александра Олеговна

   

   Гемоконтактные вирусные инфекции (ВИЧ-инфекция, гепатиты В и С) в стационаре скорой медицинской помощирГодков, Михаил Андреевич

   

   Клинико-эпидемиологическая характеристика сочетания ВИЧ-инфекции с гепатитом С у беременных женщин и активность перинатальной передачи возбудителей этих инфекцийКрылова Татьяна Валентиновна

   Эффективность и безопасность противовирусной терапии ВИЧ-инфекции и хронического гепатита С у больных сочетанной инфекциейКуимова, Ульяна Андреевна