Введение к работе
з
Актуальность темы
Образование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) является естественным процессом завершения гуморального иммунного ответа организма на антиген. Вместе с тем, существует группа заболеваний, объединенная общим названием «болезни иммунных комплексов» или «гиперчувствительность III типа» (по классификации Gell-Coombs (Coombs, Gell, 1975)). В их основе лежат воспалительные эффекты, индуцированные комплексами антиген-антитело. Повышение уровня ЦИК отмечено при многих заболеваниях: аутоиммунных, инфекционных, онкологических и т.д. (Сгосе et al, 1985; Floege, Feehally, 2000; Jancar, Crespo, 2005; Krapf et al., 1990; Mok, Lau, 2003; Muratsugu, 2005; Nydegger, 2007; Song, Kang, 2010; Vlock, Kirkwood, 1985; Wang et al, 2003). Нередко они играют важную патогенетическую роль в развитии этих заболеваний, оказывая повреждающее воздействие на различные органы и ткани. Одним из существенных факторов, имеющих значение для проявления патогенности ЦИК, является их размер (Nangaku, Couser, 2005; Oda et al., 2009; Schrieber, 1984; Sedlacek, 1980; Theofilopoulos, Dixon, 1980). От размера иммунного комплекса зависят его важнейшие биологические свойства - способность активировать комплемент и взаимодействовать с Fc-рецепторами, что в конечном итоге определяет безопасное удаление агрегатов системой мононуклеарных фагоцитов. Кроме того, разные классы иммуноглобулинов формируют различные по свойствам иммунные комплексы (Floege, Feehally, 2000; Lucisano Valim, Lachmann, 1991; Peng et al., 2005). Поэтому оценка размерности и состава ЦИК представляет собой несомненный интерес.
Следует отметить, что, несмотря на довольно большое количество методов определения иммунных комплексов, среди них до сих пор отсутствует универсальный, позволяющий оценить весь спектр ЦИК и их характеристики. Кроме того, широко распространенный в отечественной клинической практике турбидиметрический метод оценки преципитации сыворотки крови при определенной концентрации полиэтиленгликоля-6000 (Digeon et al., 1977; Haskova et al., 1978), вообще обходится без определения иммунного компонента, идентификация которого, согласно рекомендациям ВОЗ, является необходимой при детекции ЦИК (WHO Scientific Group, 1977). Вместе с тем, методы, позволяющие определять размеры агрегатов - микроскопические, хроматографические, седиментационные, электрофоретические, светорассеяния и др. (Константинова и соавт., 1986; Easterbrook-Smith, 1993; Haakenstad et al., 1982; Kelly et al., 1980; Khlebtsov et al, 2004; Cooper, Moore, 1983; Stachura et al, 1981; Szabo et al, 1977; Tung et al, 1981), - мало адаптированы для клинической практики. Возможно, одним из подходов на пути появления относительно информативного и доступного для лабораторной практики метода определения ЦИК, учитывающего физико-химические характеристики ком-
плексов и идентифицирующего его составляющие, является комбинирование методов, основанных на различных свойствах иммунных агрегатов.
Цель работы - разработка и обоснование простого и доступного для клинической лабораторной практики метода определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов.
Основные задачи исследования:
На основе создания модельных иммунных комплексов и использования стандартизованных по размерам латексных частиц оценить возможность применения спектротурбидиметрического метода для определения размеров нерастворимых иммунных комплексов.
Провести спектротурбидиметрическое исследование размеров агрегатов модельных иммунных комплексов, образованных в присутствии полиэти-ленгликоля-6000 различных концентраций, для переноса полученных результатов в область клинических исследований.
Апробировать метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов. С помощью данного метода оценить отличия в их качественном и количественном составе у здоровых и больных людей.
Адаптировать предлагаемый метод определения циркулирующих иммунных комплексов для использования в клинической лабораторной практике, представить протокол проведения анализа.
Научная новизна
Впервые на основе спектротурбидиметрического метода определены размеры иммунных комплексов, преципитированных в полиэтиленгликоле-6000 (ПЭГ). Представлена закономерность формирования преципитатов в среде с ПЭГ. Показано, что с возрастанием концентрации ПЭГ в растворе увеличение среднего размера преципитируемых частиц обусловлено включением более мелких по размерам комплексов в состав первичного агрегата, осаждаемого при меньшей концентрации ПЭГ. Установлено, что использование двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) позволяет дифференцировать иммунные комплексы по размерам. На основе разработанного метода показана возможность определения содержания иммуноглобулинов классов М, G и А в составе дифференцированных по размерам ЦИК, вьщеленных из сывороток крови здоровых доноров, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями. Впервые метод спектротурбиди-метрии применен для непосредственного исследования нативных сывороток крови. В результате у пациентов с ревматоидным артритом установлена прямая связь между уровнем ревматоидного фактора и размером преципитируемых из сыворотки крови частиц.
Теоретическое и практическое значение работы
Представлена новая концепция поведения иммунных комплексов в растворе ПЭГ. На основе данной концепции и метода спектротурбидиметрии обосновано применение двух концентраций ПЭГ (3% и 4%) для дифференцирования иммунных комплексов по размерам. Показано, что ПЭГ в возрастающих концентрациях увеличивает размер иммунных агрегатов за счет включения дополнительно осаждаемых белковых структур в первичный надмолекулярный комплекс. Создан доступный для лабораторной практики метод определения ЦИК, отражающий размерные характеристики комплексов и количественное содержание иммуноглобулинов в их составе. Получены новые данные о содержании иммуноглобулинов классов М, G и А в составе дифференцированных по размерам ЦИК у здоровых добровольцев, пациентов с ревматоидным артритом и больных лимфопролиферативными заболеваниями. При этом выявлены существенные различия в составе ПЭГ-преципитатов при разных заболеваниях.
Основные положения, выносимые на защиту:
Метод спектротурбидиметрии относительно прост и достаточно информативен в оценке размеров иммунных комплексов при соблюдении определенных условий.
На основе спектротурбидиметрии получено обоснование применения двух концентраций полиэтиленгликоля-6000 для вьщеления из сыворотки крови иммунных агрегатов разных размеров.
Разработан метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов, проведена его адаптация для применения в клинической лабораторной практике.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции», Сочи, 2007; VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007; II Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008. Основные результаты проведенных исследований представлены в 10 печатных работах, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 220 источников, из них 20 отечественных и 200 зарубежных.
