Введение к работе
Актуальность проблемы
Твердофазный иммунохимический сэндвич-метод определения антигенов белковой природы широко используется в различных областях биологии и медицины, в том числе для выявления маркеров вирусных инфекций [Егоров, 1991; Khan and Findlay, 2010]. Традиционная схема сэндвич-метода включает несколько стадий. Во-первых, на твердую фазу адсорбируют моноклональные антитела (МКА), специфичные в отношении одного из эпитопов тестируемого антигена (иммобилизованные антитела). Затем поверхность твердой фазы инкубируют со смесью определяемого антигена и меченых (детектирующих) антител. Иммобилизованные и меченые антитела направлены, как правило, к разным эпитопам определяемого антигена. В результате иммунной реакции на поверхности твердой фазы образуется трехслойный комплекс: [иммобилизованные антитела - антиген - меченые антитела], называемый сэндвичем. В таком иммунном комплексе концентрация определяемого антигена пропорциональна концентрации меченых антител, детектирующий агент которых (например, фермент) обеспечивает регистрируемый сигнал (окрашивание). Сэндвич-метод с использованием пары МКА к разным эпитопам антигена называют двухсайтным.
Благодаря высокой чувствительности, специфичности и относительной простоте исполнения сэндвич-метод нашел широкое применение для скрининга образцов донорской крови на возможную зараженность вирусом гепатита В, а также для ранней диагностики этого заболевания [Лобзин с соавт., 2006]. Вместе с тем, чувствительность тест-систем, производимых ведущими компаниями, варьирует в пределах 0,036 - 0,408 МЕ/мл [H. Scheiblauer et al., 2009]. Важнейшим фактором, определяющим чувствительность сэндвич-метода, является концентрация активных антигенсвязывающих сайтов антител адсорбированных на поверхности твердой фазы. При прямой (пассивной) сорбции МКА на поверхность иммунных планшетов около 90 - 99 % антител может утерять способность связывать антиген в результате денатурации и неправильной ориентации молекул [Butler, 2004; Liu et al., 2010]. Для сохранения активности иммобилизуемых антител был предложен ряд подходов, предполагающих непрямую сорбцию МКА на поверхность твердой фазы (например, через стрептавидин-биотиновые мостики). Однако пассивная адсорбция по-прежнему остается весьма распространенным способом иммобилизации антител в силу ее простоты и дешевизны. Таким образом, поиск новых методических приемов, позволяющих в максимальной степени сохранить антигенсвязывающую активность иммобилизуемых МКА и тем самым увеличить чувствительность тест-систем, является весьма актуальной задачей.
Цель исследования:
Конструирование иммуноферментного сэндвич-метода определения HВsAg, основанного на прямой сорбции МКА на поверхность иммунных планшетов и обладающего высокой аналитической чувствительностью; совершенствование метода путем увеличения антигенсвязывающей активности иммобилизуемых МКА путем их адсорбции при различных значениях рН (в том числе экстремально кислых рН).
Задачи исследования:
1. Получить панель гибридомных клеточных линий – продуцентов высокоаффинных моноклональных антител к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg).
2. Отобрать высокоаффинные МКА, эффективно взаимодействующие с HBsAg серотипов adw и ayw.
3. Подобрать пары МКА (иммобилизуемых и меченых), сочетание которых обеспечивает обеспечивающих высокую аналитическую чувствительность сэндвич-метода.
4. Проанализировать эффективность отобранных МКА в сэндвич-методе после иммобилизации сорбируемых антител на поверхность иммунных планшетов при кислых, нейтральных и щелочных значениях рН.
5. Подобрать условия сэндвич-метода, обеспечивающие обнаружение HBsAg в сыворотке крови больных, инфицированных вирусом гепатита В, в концентрациях »0,02 нг/мл (для n=5).
Научная новизна исследования
Получена гибридома (18С8) – продуцент уникальных МКА. Антигенсвязывающая активность МКА 18С8 увеличивается более чем в два раза при их адсорбции на поверхность иммунных планшетов в жестких условиях (рН 2,8), в сравнении с адсорбцией при нейтральном значении рН (7,5). Использование МКА 18С8 позволило сконструировать и внедрить в производство сэндвич-метод тестирования HBsAg в сыворотке крови, обеспечивающий минимальную достоверно определяемую концентрацию антигена (для n=5) на уровне 0,013 – 0,017 МЕ/мл. В дополнение к этому метод позволяет определять в сыворотке HBsAg серотипов: аyw2, аyw3varА, аyw3varB, аdr и аdw.
Практическая значимость
Получена высокочувствительная диагностическая тест-система с высокими аналитическими свойствами для выявления HBsAg в крови.
Обнаруженный феномен увеличения антигенсвязывающей активности некоторых МКА при их адсорбции на поверхность иммунных планшетов в "жестких" условиях (рН 2,8) может быть полезен в практической иммунохимии, в частности, при конструировании сэндвич-методов, предназначенных для идентификации инфекционных агентов и других имеющих диагностическое значение белков (гормонов, маркеров инфаркта миокарда, онкомаркёров и т.п.). Наряду с этим описанный феномен может использоваться в конкурентном анализе при создании диагностических систем для тестирования стероидных гормонов и других низкомолекулярных лигандов. Феномен заслуживает дальнейшего изучения, как с теоретической точки зрения, так и в практическом аспекте.
Положения, выносимые на защиту
1. На основе полученной в работе панели МКА к HBsAg сконструирован сэндвич-метод определения HBsAg в сыворотке крови, обладающий высокой аналитической чувствительностью. Минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg в сыворотке крови для сконструированного метода составила 0,013 – 0,017 МЕ/мл
2. В ходе оптимизации адсорбции МКА на твердую фазу (полистироловые планшеты) были обнаружены антитела, биологическая активность которых сохранялась значительно лучше после иммобилизации при кислых значениях рН (2,8) по сравнению с сорбцией при рН 7,5 и 9,5. В случае МКА 18С8, обладавших наибольшей ацидофильностью, минимальная достоверно определяемая концентрация HBsAg уменьшалась в 7 – 10 раз. Использование МКА 18С8, адсорбированных при рН 2,8, позволило сконструировать вышеупомянутый сэндвич-метод.
3. Изменение рН адсорбции МКА не влияло на общую поверхностную концентрацию антител на поверхности иммунных планшетов.
4. Описанный в настоящей работе простой методический прием, который заключается в использовании буферных растворов с низким значением рН для адсорбции антител на полистироловую поверхность планшетов, может быть рекомендован для оптимизации как конкурентных, так и сэндвич-методов определения антигенов.
Внедрение результатов работы в практику
Материалы диссертации в 2011-12 гг. использовались в педагогическом процессе (лекциях и семинарских занятиях) кафедр вирусологии и эпидемиологии ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Апробация работы
Работа была доложена на международной конференции "Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями" (Санкт-Петербург, 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, 2 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК.
Апробация диссертации состоялась 2 марта 2010 года на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
