Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Эффективность и безопасность АРВТ при терапии оппортунистических инфекций 10
1.1.1 Сложности, возникающие при начале АРВТ при установлении инфекционного процесса, обусловленного оппортунистическими инфекциями у терапевтически «наивных» пациентов 10
1.1.2 Сложности, возникающие при установлении инфекционного процесса, обусловленного оппортунистическими инфекциями у пациентов, принимающих АРВТ 14
1.2 Терапия оппортунистических инфекций в случае беременности.. 15
1.3 Подходы к специфической профилактике СПИД-ассоциированных инфекций 16
1.4 Перспективы терапии антителами в сверхмалых дозах 21
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 30
2.1 Характеристика групп больных, выбор сроков исследования 30
2.2 Оценка общего состояния ВИЧ-инфицированных больных до и после приема препарата «Анаферон» 33
2.3 Иммунофенотипирование лимфоцитов 37
2.4 Определение уровней цитокинов методом иммуноферментного анализа 38
2.5. Определение вирусной нагрузки 39
2.6. Статистическая обработка данных 46
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 47
3.1 Влияние «Анаферона» на субпопуляционный состав циркулирующих лимфоцитов 47
3.2 Влияние «Анаферона» на концентрации цитокинов в периферической крови 51
3.3 Влияние «Анаферона» на вирусную нагрузку ВИЧ в сыворотке крови 55
3.4. Влияние «Анаферона» на качество жизни ВИЧ-инфицированных 56
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 59
Выводы 76
Практические рекомендации 77
Список литературы 78
- Сложности, возникающие при начале АРВТ при установлении инфекционного процесса, обусловленного оппортунистическими инфекциями у терапевтически «наивных» пациентов
- Подходы к специфической профилактике СПИД-ассоциированных инфекций
- Определение уровней цитокинов методом иммуноферментного анализа
- Влияние «Анаферона» на концентрации цитокинов в периферической крови
Введение к работе
Актуальность проблемы
C середины 90-х годов прошлого века доступность антиретровирусной терапии (АРВТ) послужила причиной улучшения прогноза у большого числа ВИЧ-инфицированных пациентов, как в высокоразвитых государствах, так и в странах с ограниченными экономическими возможностями. [Navin T.R., 2000; Braitstein P., 2006; Price P., 2001]. Путем подавления репликации ВИЧ, АРВТ позволяет восстановить иммунную систему, как в качественном, так и в количественном выражении [Abubakar I., 2007; Battegay M., 2006] снижая, таким образом, риск возникновения оппортунистических инфекций (ОИ) и неоплазий [Egger M., 2002; Navin T.R., 2000]. Снижена заболеваемость и смертность от 15 из 26 СПИД-ассоциированных заболеваний. Тем не менее, риск возникновения оппортунистических инфекций остается значительным, особенно в течение первых месяцев лечения [Lawn S. D., 2008]. Частота случаев инфекции вирусом папилломы человека, вызывающей неоплазии и вирусом гепатита С не изменилась после появления АРВТ [Veiga A.P., 2006]. Оппортунистические инфекции являются основной причиной смертности среди ВИЧ-инфицированных больных, при том, что проведение АРВТ порой затруднено вследствие непереносимости препаратов. Начиная с 1989 года, предпринимаются попытки создания рекомендаций по профилактике оппортунистических инфекций у ВИЧ-инфицированных пациентов. Первые рекомендации касались профилактики инфекций, вызванной Pneumocystis jiroveci (ранее известной как Pneumocystis carinii) и Mycobacterium avium [Hermsen E. D., 2004]. Хотя влияние первичной профилактики на выживаемость было значительным, высокоактивная антиретровирусная терапия оказалась еще более эффективным способом предотвращения оппортунистических инфекций, что привело к пересмотру рекомендаций по профилактике ОИ в 2001 году [Hermsen E. D., 2004]. Клинические исследования показали, что первичная и вторичная специфическая профилактика ОИ должна быть прекращена в большинстве случаев, поскольку препараты для профилактики ОИ обладают рядом побочных эффектов [Dworkin M.S., 2000]. Кроме того, излишняя нагрузка лекарственными средствами увеличивает потенциал лекарственной токсичности, риск лекарственных взаимодействий, выработку устойчивых микроорганизмов, также увеличивается и стоимость лечения [Furrer H., 1999; Green H., 2004; Lopez Bernaldo de Quiros J.C., 2001; Mussini C., 2000]. Несмотря на неполное восстановление иммунной системы при терапии противовирусными средствами, иммунная система по-прежнему продолжает защищать пациентов от инфекций, в то время как необоснованное назначение профилактических антимикробных препаратов приводит к отсутствию комплаентности пациентов вследствие полипрагмазии и лекарственной непереносимости [Hermsen E. D., 2004]. Однако полная элиминация оппортунистических инфекций по-прежнему остается непреодолимой задачей. Спектр и относительные частоты оппортунистических инфекций не изменились. Пневмоцистная пневмония и инфекция Mycobacterium avium до сих пор распространены [Kaplan J., 2000]. По-прежнему остается необходимой профилактика ОИ у пациентов, которые некомплаентны к АРВТ, для которых невозможно начало АРВТ, или в случае развития устойчивости вируса к антиретровирусным препаратам [Hermsen E. D., 2004].
В последние годы накоплены факты, демонстрирующие свойства инновационного отечественного препарата «Анаферон» облегчать течение различных вирусных инфекций, что делает перспективным его применение в качестве профилактического и лечебного средства у ВИЧ-инфицированных больных в составе комбинированной терапии [Чуйкова К. И., 2006; Перевощикова Н. К., 2006]. «Анаферон» - препарат, содержащий антитела к человеческому -интерферону, зарегистрированный как лекарственное средство (противовирусное и иммуномодулирующее) Росздравнадзором в 2009 г. и разрешен к клиническому использованию, в том числе у детей от 1,5 лет жизни. «Анаферон» влияет на процессы иммунорегуляции, способствует активации противовирусного иммунитета и стимулирует выработку основных цитокинов, и как следствие имеет перспективы для применения в комплексной терапии при ВИЧ-инфекции как для профилактики и лечения острых респираторных заболеваний и оппортунистических инфекций у ВИЧ-инфицированных, так и как средство усиливающее эффективность АРВТ [Sherstoboev E.Y., 2003; Лыткина И. Н., 2004; Ревякина В.А., 2006]. Таким образом, представляется актуальным изучение влияния «Анаферона» на показатели, характеризующие иммунную реактивность среди ВИЧ-инфицированных.
Цель исследования
Обосновать возможности применения препарата «Анаферон» в комплексном лечении СПИД-ассоциированных заболеваний и ОРВИ на основании клинико-лабораторных показателей состояния иммунной системы у ВИЧ – инфицированных больных.
Основные задачи исследования
1. Исследовать влияние препарата «Анаферон» на состав субпопуляций лимфоцитов крови ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию и не получающих таковую.
2. Оценить влияние препарата «Анаферон» на содержание интерферона-гамма, интерлейкинов-2, 4 в крови ВИЧ – инфицированных больных, получающих антиретровирусную терапию и не получающих.
3. Оценить влияние «Анаферона» на количество копий РНК ВИЧ в крови у данных пациентов в динамике приема препарата.
4. Оценить влияние курсового профилактического и лечебного приёма препарата на качество жизни ВИЧ – инфицированных больных, получающих антиретровирусную терапию и не получающих таковую.
Научная новизна
В работе впервые показано влияние препарата «Анаферон» на динамику изменения субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Впервые показано, что при применении «Анаферона» изменяется профиль экспрессии цитокинов (интерферон-гамма, интерлейкины-2, 4) у ВИЧ-инфицированных пациентов. Впервые исследована динамика изменения концентрации РНК вируса иммунодефицита человека в сыворотке крови пациентов на фоне приема препарата «Анаферон». Впервые на основе клинико-лабораторных данных обоснована возможность применения «Анаферона» у ВИЧ-инфицированных пациентов на различных стадиях течения ВИЧ-инфекции.
Практическая значимость и реализация результатов исследования
Представлены практические рекомендации по профилактическому и лечебному применению «Анаферона» у ВИЧ-инфицированных больных на различных стадиях течения заболевания. Представлены практические рекомендации по мониторингу показателей иммунной системы и вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных пациентов, принимающих «Анаферон» на различных стадиях инфекции.
Результаты исследования используются в учебной практике на кафедре клинической фармакологии и интенсивной терапии с курсом аллергологии и иммунологии ФУВ, на кафедре иммунологии и аллергологии и на кафедре инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета.
Положения, выносимые на защиту
1. Применение «Анаферона» сопровождается изменением содержания субпопуляций Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов, приводя к значимому увеличению абсолютного количества CD4 лимфоцитов.
2. Применение «Анаферона» сопровождается увеличением экспрессии цитокинов (интерлейкина-2, 4, интерферона-гамма), причем наиболее заметные изменения наблюдаются среди пациентов, находящихся в стадии 4В ВИЧ-инфекции.
3. Среди пациентов, у которых наблюдали снижение концентрации РНК ВИЧ в периферической крови, среднее снижение вирусной нагрузки более выражено в группе пациентов, принимавших «Анаферон». Количество пациентов, у которых наблюдалось снижение вирусной нагрузки, также больше среди больных, принимающих «Анаферон» совместно с АРВТ.
4. Прием «Анаферона» ассоциирован с повышением качества жизни пациентов, что отразилось в улучшении восприятия ими своего состояния, а именно с субъективным снижением подверженности простудным заболеваниям и улучшением эмоционального состояния.
Апробация работы
По теме диссертационной работы опубликовано 3 печатные работы, из них 2 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов докторских и кандидатских диссертаций. Основные результаты работы доложены и обсуждены на VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 26-28 апреля 2009 г), на окружном совещании главных врачей региональных центров по профилактике и борьбе со СПИД Южного федерального округа, посвященного 20-летию образования службы профилактики ВИЧ/СПИДа (г. Волжский, 6-7 октября 2009 г) и на итоговых научных конференциях ВолГМУ (2008, 2009 гг.).
Объем и структура диссертации
Сложности, возникающие при начале АРВТ при установлении инфекционного процесса, обусловленного оппортунистическими инфекциями у терапевтически «наивных» пациентов
В случае развития острой инфекции, ожидается, что начало АРВТ должно улучшить функции иммунной системы и способствовать быстрому излечению от ОИ. Начало АРВТ считается эффективным в случае, если отсутствует или недоступна специфическая эффективная терапия; например, криптоспоридиоз, микроспоридиоз, прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия (ПМЛ) могут быть элимированы или, по меньшей мере, стабилизированы при назначении АРВТ [13, 45, 128]. Что касается саркомы Капоши, старт АРВТ может привести к полному излечению даже при отсутствии специфической терапии саркомы [97]. Старт АРВТ в начале острой оппортунистической инфекции также имеет явные преимущества; при раннем начале такой терапии, повторное возникновение инфекции менее вероятно, чем в случае отсроченной АРВТ.
Тем не менее, существует и ряд недостатков раннего начала АРВТ. В случае тяжелого течения заболевания, абсорбция антиретровирусных препаратов часто снижается, и это приводит к тому, что концентрация препаратов в крови становится субтерапевтической; это, в свою очередь ведет к развитию лекарственной устойчивости вируса. Токсическое действие АРВТ может быть принято за проявления болезни, или токсическое действие других препаратов, используемых для лечения ОИ. Сложно также предугадать лекарственные взаимодействия между антиретровирусными препаратами и средствами для лечения оппортунистических инфекций. Почечная или печеночная недостаточность, часто развивающаяся в течение острой инфекции приводит к тому, что становится сложным подбор оптимальной дозировки антиретровирусных препаратов. Наконец, может развиться воспалительный синдром восстановления иммунитета (ВСВИ), вызывающий клинические симптомы, неотличимые от других клинических состояний [32, 136, 106].
Термин «воспалительный синдром восстановления иммунитета», ВСВИ, используется для описания группы клинических синдромов, ассоциирующихся с восстановлением иммунной системы и чаще всего связанных с микобактериальными инфекциями (туберкулез и диссеминированная инфекция, вызванная Mycobacterium avium-intracellular ё), а также с другими инфекционными агентами (пневоцистная пневмония, токсоплазмоз, гепатит В и С, ЦМВ-инфекция, инфекция, вызванная вирусом варицелла-зостер, криптококковая инфекция, гистоплазмоз, ПМЛ) [37, 106, ПО, 35, 99, 138, 77, 95, 24, 52, 33, 83]. Проявления ВСВИ разнообразны и точно не определены; обычно они характеризуются лихорадкой и осложнением течения установившейся ОИ. Клинические проявления ВСВИ могут касаться тех же участков локализации, что и ОИ, или же вызывать схожую симптоматику в локализациях, нетипичных для ОИ. Симптомы ВСВИ могут быть представлены началом иммунного ответа на ранее нераспознаваемый патогенный микроорганизм. Как правило, ВСВИ развивается в течении 4-8 недель после начала АРВТ, при этом сохраняется высокая вирусная нагрузка и малое количество CD T клеток. Однако синдром может проявиться спустся много недель после начала АРВТ, при этом может возникать в секвестрированных участках тела (кости).
Диагноз ВСВИ является сложной клинической задачей и включает в себя дифференциальный диагноз с прогрессирующей ОИ (включая развития устойчивости к антимикробной терапии), с развитием новой ОИ, органной недостаточности, или с токсическим действием лекарственных средств. Терапия ВСВИ остается эмпирической. На данный момент не существует исследований, подтверждающих какие-либо оптимальные сроки применения нестероидных и/или стероидных препаратов или приостановления АРВТ. Для стихания воспаления могут потребоваться недели и даже месяцы. ВСВИ может привести к резкому ухудшению прогноза, например в случае развития криптококкового менингита [122, 63].
Принимая во внимание вышеперечисленные причины, до сих пор не достигнуто договоренности об оптимальных сроках начала АРВТ при развитии ОИ. Тем не менее, в одном из недавно опубликованных рандомизированных клинический исследований, показано, что раннее начало АРВТ (в течение 2-х недель после начала лечения от ОИ) является хорошим прогностическим признаком в отношении выживаемости и течения инфекции; исключением является туберкулез [141]. Большинство инфекций, представленных в исследовании, включало в себя пневмоцистную пневмонию и инвазивные бактериальные инфекции, а также криптококковые, другие грибковые инфекции, и диссеминированную инфекцию, вызванная Mycobacterium avium-intracellular е. Результаты, таким образом, показывают, что при отсутствии противопоказаний, раннее начало АРВТ показано для большинства пациентов с острой ОИ, кроме случаев заболевания туберкулезом. Другими факторами, которые следует принимать во внимание для решения о начале АРВТ, являются уровень иммуносупрессии, доступность эффективной специфической терапии для лечения ОИ, риск возниконовения лекарственных взаимодействий, развития ВСВИ и комплаентность пациента. Хотя в случае пневмоцистной пневмонии, криптоспоридиоза, мироспоридиоза, ПМЛ, саркомы Капоши и инвазивных инфекций риск раннего начала АРВТ перевешивает риски, обусловленные другими факторами, вопрос о раннем назначении АРВТ остается спорным. Нет данных о профилактическом действии АРВТ; специфическая профилактика ОИ также остается нерешенной задачей и должна назначаться с учетом индивидуальных особенностей каждого пациента, что крайне осложняет подход к решению этой задачи [57].
Как только АРВТ начата, восстановление иммунной системы происходит в две фазы. Быстрое увеличение циркулирующих CD4± клеток, в первую очередь клеток памяти происходит в течение первых месяцев после начала терапии. [108]. ВИЧ устанавливает состояние воспаления, при котором лимфоциты привлекаются в лимфоузлы, архитектура которых служит «ловушкой» для этих лимфоцитов. После начала ВААРТ, происходит подавление воспалительной реакции, и лимфоциты возвращаются в периферический кровоток, вызывая стремительное увеличение количества циркулирующих CD4± клеток [26]. Вторая фаза характеризуется более сдержанным увеличением количества Т-лимфоцитов, вызванная продукцией и созреванием новых, наивных Т-лимфоцитов, имеющих потенциал к распознаванию новых антигенов. [57]. Существует гипотеза, что увеличение количества наивных клеток происходит при увеличении их продукции в тимусе, либо при делении в экстратимических очагах размножения, которые более не подавляются ВИЧ-индуцированным цитопатическим действием. Увеличение количества CD4± клеток происходит постоянно в течение как минимум двух лет терапии, однако функционирование иммунной системы так и не возвращается к нормальным показателям [26].
Восстановление иммунных функций происходит у каждого пациента неодинаково. Предикторами увеличения количества CD4± клеток являются вирусная нагрузка и количество CD4± клеток до начала ВААРТ [80]. Более высокая вирусная нагрузка и резкое падение СВ4±-клеток предполагают менее эффективный ответ на терапию [113, 94]. Считается, что быстрое снижение вирусной нагрузки приводит к тому, что количество жизнеспособных лимфоцитов становится меньше, поэтому нарастание количества CD4± после начала ВААРТ происходит замедленно [57]. Достоверно точно неизвестно, насколько время начала ВААРТ влияет на скорость восстановления иммунных функций, поскольку пока еще не изучены долговременные последствия раннего начала терапии [87].
Подходы к специфической профилактике СПИД-ассоциированных инфекций
Первый феномен, названный автором О.И.Эпштейном феноменом бипатии, наблюдается при одновременном (сочетанием) введении лекарственного средства в двух формах - обычной и гомеопатической. Проявляется он в модуляции (изменении) биологической активности лекарственного средства на самых различных уровнях: молекулярно-биохимическом, синаптическом, молекулярно-клеточном, системном [147, 150, 154, 194, 41]. На клиническом уровне воздействие лекарственного средства при бипатическом способе введения можно характеризовать как более мягкое, щадящее. Более того, потенцированная форма лекарственного средства активирует ряд адаптивных реакций при воздействии этого же препарата в токсических дозах (феномен системной адаптации О.И.Эпштейна) [197, 199].
Второй модифицирующий феномен, открытый О.И.Эпштейном, М.Б.Штарком, Т.М.Воробьевой на нейробиологической модели, заключается в том, что антитела в сверхмалых дозах (потенцированные антитела) к эндогенному регулятору (антигену) не подавляют активность молекулы, а напротив, модифицируют ее.
В последние годы накоплены факты, демонстрирующие "стабилизирующее" воздействие естественных антител на ряд известных регуляторных молекул [144, 197]. Возможно, модулирующее влияние антител в потенцированной форме на активность естественных антител и определяет их "мягкое", "щадящее", сбалансированное терапевтическое воздействие.
В результате доклинических исследований выявлено, что потенцированные антитела к гамма-интерферону человека (анти-ИФН), вошедшие в состав разрабатываемого препарата "Анаферон", обладают свойствами иммуномодулятора: стимулируют гуморальный иммунный ответ (повышают функциональную активность АОК в селезенке, титр специфических антител в сыворотке) [123]. Анти-ИФН эффективны при вторичном иммунодефицитном состоянии, в частности, на фоне иммуносупрессии цитостатиком циклофосфаном. Препарат стимулирует реакции клеточного иммунитета - активизирует функцию Т-эффекторов (выражается в усилении реакции гиперчувствительности замедленного типа); повышает способность Т-лимфоцитов селезенки продуцировать у-интерферон; повышает соотношение в селезенке соотношение CD4±/CD8±. Антитела к интерферону-гамма влияют и на фагоцитарное звено иммунитета - усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов за счет увеличения процента активных фагоцитов; оказывают умеренное стимулирующее влияние на функциональную активность NK клеток [121]. Таким образом, потенцированные антитела к гамма-интерферону обладают комплексным влиянием на все звенья иммунной системы, включая регуляторные и эффекторные клетки, а также фагоцитарное звено [184, 170].
Иммунотропные свойства сверхмалых доз антител к гамма-интерферону На основании показанной ранее способности антител к эндогенным регуляторным молекулам при введении их в сверхмалых дозах (СМД), полученных с использованием технологии потенцирования, не блокировать, а модулировать физиологическую активность молекулы [196, 143, 149, 166], in vivo и in vitro было изучено иммунотропное действие препарата Анаферон, содержащего СМД антител к гамма-интерферону человека (СМД анти-IFN гамма) [192]. Показано, что СМД анти-IFN гамма стимулируют гуморальный иммунный ответ, в том числе на фоне иммуносупрессии и в условиях введения минимальных доз антигена: повышают функциональную активность антителообразующих клеток в селезенке и титры гемагглютининов в сыворотке; активизируют функцию Т-эффекторов, что выражается в усилении реакции ГЗТ; повышают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов перитонеального экссудата за счет увеличения процента активных фагоцитов [151, 198]. При курсовом введении СМД анти-IFN гамма увеличивали спонтанную и стимулированную фитогемагглютинином выработку Т-лимфоцитами мышей эндогенного IFN гамма [121, 127]. При добавлении в культуру человеческих мононуклеаров СМД анти- IFN гамма оказывали умеренное комитогенное действие, стимулируя пролиферацию как Т-, так и В лимфоцитов, повышали продукцию IL-1 как в стимулированном, так и в спонтанном варианте; при определенных условиях усиливали функциональную активность NK-клеток [193, 88, 89]. Показано, что СМД анти-IFN гамма оказывали профилактическое и лечебное действие при гриппозной инфекции у мышей в виде снижения концентрации вируса гриппа в легких животных. Первичная клиническая оценка препарата у детей с подтвержденным этилогическим диагнозом "грипп" показала, что прием «Анаферона» способствует значимому сокращению длительности лихорадочного, интоксикационного и катарального синдромов [190, 0]. Назначение детям анаферона детского в ранние сроки заболевания способствовало быстрой ликвидации всех симптомов инфекционного процесса, в том числе повышенной температуры тела, интоксикации, катаральных явлений. При сравнительном анализе клинических показателей в исследуемых группах было показано, что в группе пациентов, принимавших «Анаферон детский», более быстро купировались симптомы интоксикации в сравнении с группой, принимавшей арбидол, и значительно быстрее по сравнении с группой, принимавшей иммунал. Наиболее выраженные отличия наблюдались при оценке миалгии, лихорадочного периода, наличия головной боли и степени адинамии. Анализ лабораторных показателей не выявил достоверно значимых изменений, колебания которых соответствовали фазности развития инфекционного процесса.
Определение уровней цитокинов методом иммуноферментного анализа
Определение субпопуляционного состава циркулирующих лимфоцитов периферической крови является одним из главных и важнейших исследований при оценке иммунного статуса.
Фенотипирование циркулирующих лимфоцитов периферической крови выполняли с помощью метода проточной цитофлюорометрии с использованием стандартной панели, состоящей из антител к мембранным антигенам CD3, CD4, CD8 меченных флюорохромами FITC, РЕ.
Принцип метода основывается на способности меченных флуорохромом моноклональных антител избирательно связываться с определенными рецепторными структурами, специфичными для разных субпопуляций лимфоцитов. Подсчет меченых лимфоцитов определяется за счет флуоресценции освещенного светом определенной длины волны флуорохрома, которая регистрируется прибором.
Оборудование: проточный цитофлюориметр FACSCount (Becton Dickinson, США), вортекс (Elmi, Латвия), лабораторная посуда, автоматические пипетки и дозаторы. Реактивы: Набор реагентов FACSCount Reagent Kit Фиксирующий раствор - 5% раствор формальдегида на фосфатно-солевом буфере. Ход определения: В каждую из двух пробирок с реагентами вносили по 50 мкл цельной крови. Встряхивали в вертикальном положениив течение 5 сек. Инкубировали пробирки при комнатной температуре (20-25С) в течение 1-2 часов. Затем вносили по 50,мкл фиксирующего раствора в каждую пробирку с реагентами, встряхивали на вортексе в вертикальном положении 5 сек. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре. 2.4 Определение уровней цитокинов методом иммуноферментного анализа Концентрацию цитокинов определяли с использованием тест-систем «BioSource» (Invitrogen, США) Принцип метода определения цитокинов -твердофазный иммуноферментный метод. Определенный тип антител иммобилизирован на внутренних поверхностях ячеек планшетов. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекулы IL-2 находился в виде конъюгата с биотином. Определяющим компонентом являлся конъюгат пероксидазы хрена со стрептовидином, имеющим высокое сродство с биотином. Оборудование: многоканальный анализатор Dynex DSX (США), автоматическое промывающее устройство для планшет BioRad, автоматический шейкер-инкубатор (Elmi, Латвия), автоматические пипетки и дозаторы, лабораторная посуда. Реагенты: Иммуноферментная тест-система BioSource ELISA. Выполнение анализа: В лунки полистиролового планшета добавляли по 100 мкл сыворотки, 50 мкл инкубационного буфера и по 50 мкл биотинового конъюгата. Все инкубировали в течение 2 часов на шейкере при комнатной температуре. По окончании инкубации промывли промывочным буферам в течение 4 минут. После добавляли по 100 мкл рабочего раствора стрептавидина и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Также промывали буфером и стабилизировали раствором хромогена по 100 мкл с инкубацией в 30 минут. Реакцию останавливали стоп-реагентом. Учет результатов: Измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре с использованием длины волны 450нм. Выстраивали систему линейных координат: по оси ординат - значение оптической плотности, по оси абсцисс - значения концентрации IL-2 в пкг/мл. Строили график на основании значений оптической плотности, полученных для колибровочных проб IL-2. По построенному графику определяли значения концентрации IL-2 для исследуемых образцов. 2.5 Определение вирусной нагрузки Для определения количества вируса иммунодефицита человека 1-типа использовали наборы СОВ AS AMPLICOR HTV-1 MONITOR Kit, version 1,5 для автоматического ПЦР-анализатора COBAS AMPLICOR (Roche, Швейцария). Набор является тестом амплификации нуклеиновой кислоты in vitro для количественного определения вируса иммунодефицита человека 1-типа, его РНК формы, в клинических образцах. Тест использует полимеразную цепную реакцию для амплификации нуклеиновой кислоты и гибридизацию нуклеиновой кислоты для количественного определения РНК ВИЧ-1 в плазме, выделенной из цельной крови. Принцип метода: Тест основан на пяти процессах: подготовка образца; обратной транскрипции мишенной кДНК, использующей специфические праймеры для ВИЧ-1; гибридизации продуктов амплификации с олигонуклеотидными пробами специфическими к мишени; детекция продуктов амплификации связанных с пробами колорометрическим методом. В данном тесте обратная транскрипция и амплификация ВИЧ-1 в присутствии количественного стандарта РНК протекают одновременно. Реагенты реакционной смеси (MASTER MIX) содержат биотинилированную пару праймеров специфичную для ВИЧ-1 и ВИЧ-1 Количественного Стандарта РНК. Количество ВИЧ-1 РНК определяется, используя КС. КС-неинфекционный РНК-транскрипт, который содержит идентичные места связывания как в РНК ВИЧ-1, так и в уникальном районе КС отличного от ВИЧ-1 ампликона. КС с известным количеством копий вносится в каждый образец во время приготовления образца, а далее присутствует в реакции обратной транскрипции, ПНР амплификации, гибридизации и детекции, т.е. присутствует на всех этапах реакций. COBAS AMPLICOR анализатор определяет уровень РНК ВИЧ-1, сравнивая сигналы от ВИЧ-1 РНК и от КС для каждого образца. КС отражает любой ингибирующий эффект и контролирует процесс амплификации, чтобы точно количественно определить значение каждого образца.
Влияние «Анаферона» на концентрации цитокинов в периферической крови
Перед началом и по окончании исследования, для анализа качества жизни ВИЧ-инфицированных, всем пациентам раздавали опросник, содержащий ряд вопросов, касающихся субъективной оценки своего состояния. Как выяснилось, больные были довольны проводимым лечением и общим соматическим состоянием. По анализу результатов опроса было выявлено некоторое улучшение качества жизни пациентов, отражающееся в улучшении восприятия ими своего здоровья и эмоционального состояния. Остальные параметры, характеризующие качество жизни, не изменились либо изменились незначительно в сравнении с исходными значениями. Нежелательных лекарственных реакций у пациентов, принимавших «Анаферон», не наблюдалось.
Состояние иммунной системы анализировали по параметрам субпопуляционного состава периферической крови и цитокинового статуса у 83 пациентов с ВИЧ-инфекцией. В исследуемые группы вошли 52 мужчины и 31 женщина, средний возраст которых составил 30 лет. Диагноз ВИЧ-инфекция был подтвержден лабораторными и клиническими данными. Группа сравнения состояла из 6 мужчин и 14 женщин, средний возраст которых составил 21 год. При исследовании контрольной группы не было выявлено острых и хронических заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекции. Сроки исследования выбирали исходя из сезонных обострений сопутствующих вирусных заболеваний ВИЧ - инфицированных пациентов. Пациенты начинали принимать препарат «Анаферон» до начала обострения по двум схемам: пациенты первой и второй групп принимали «Анаферон» в профилактической дозировке 1 таблетка в сутки в течение 1,5 месяцев. Пациенты из группы №5 принимали «Анаферон» в лечебной дозировке: первые 2 часа по 1 таблетке каждые 30 минут (5 приемов), затем в течение первых суток еще 3 таблетки через равные промежутки времени, со вторых суток и далее по 1 таблетке 3 раза в день в течение 1,5 месяцев. При исследовании влияния препарата «Анаферон» на вирусную нагрузку ВИЧ-инфицированных пациентов значимых различий между группами пациентов по снижению количества копий РНК ВИЧ в крови выявлено не было. Количество пациентов, у которых отмечалось снижение вирусной нагрузки, составило от 20 до 50% в разных группах. Следует отметить, что пациенты, у которых произошло снижение вирусной нагрузки и которые принимали «Анаферон» совместно с АРВТ отличались более выраженным снижением концентрации вирусной РНК в крови, чем пациенты, не принимавшие «Анаферон». Так, среди пациентов, принимавших антиретровирусные препараты и у которых количество копий РНК ВИЧ уменьшилось, среднее снижение вирусной нагрузки составило 13,3%, а среди тех, кто принимал «Анаферон» совместно с АРВТ - 14,5%, то есть несколько выше. Изменилось и количество больных, у которых наблюдалось снижение вирусной нагрузки: в группе пациентов, находящихся на схеме «Анаферон»+АРВТ, оно составило 50%, а среди тех, кто принимал только антиретровирусные средства - 31,8%. В группе №1 (пациенты, принимавшие «Анаферон») среднее снижение вирусной нагрузки более значительно, чем в группе 3 (пациенты, не получавшие лечения). Таким образом, «Анаферон» оказывает положительный эффект на течении ВИЧ-инфекции, отражающийся как в качественных (факт снижения вирусной нагрузки), так и в количественных показателях (снижение количества копий РНК ВИЧ).
В ходе исследования иммунного статуса ВИЧ-инфицированных пациентов до начала приема препарата «Анаферон» содержание общего количества Т-лимфоцитов CD3 (рис. 1) значительно не отличалось от здоровых, исключение составили группы №2 и №5. Однако количество Т-хелперов CD4 (рис. 2), как и предполагалось, во всех группах было снижено более чем в два раза, содержание цитотоксических Т-лимфоцитов CD8 (рис. 3), напротив, в сравнении со здоровыми было значимо увеличено. Соответственно иммунорегуляторный индекс CD4/CD8 (рис. 4) по отношению к контрольной группе был снижен практически в 3 раза. Таким образом, отсутствие различий между ВИЧ-инфицированными и здоровыми по общему содержанию CD3-лимфоцитов объясняется увеличением количества СЭ8-клеток на фоне пропорционального снижения СЭ4-клеток, что является естественной картиной угнетения иммунной системы на фоне ВИЧ-инфекции.
Дальнейшее изучение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов в динамике приема «Анаферона» показало наличие значимых различий в содержании CD3 в группах №1 и №2, то есть среди пациентов, принимавших «Анаферон» в профилактической дозе (рис. 5). Отличия после курса «Анаферона» в отношении динамики количества CD4 были значимыми в группах №2 и №4 (рис. 6), таким образом, увеличение количества Т-хелперов связано с антиретровирусной терапией. Следует отметить, что в группе пациентов, принимавших «Анаферон» совместно с АРВТ, имеется тенденция к более значительному увеличению количества Т-хелперов (р=0,15). При этом количество CD8 после приема препарата не меняется ни в одной группе пациентов (рис. 7). Изменение соотношения CD4/CD8 наблюдали только в группе №2, что обусловлено более выраженным увеличением концентрации Т-хелперов (рис. 8). Таким образом, эффект «Анаферона» на количественное содержание Т-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов выражается в некотором увеличении абсолютного количества CD4-KneTOK при совместном приеме с антиретровирусными препаратами. Учитывая снижение вирусной нагрузки у пациентов, принимающих «Анаферон» совместно с АРВТ, нельзя не отметить, что увеличение количества Т-хелперов, вероятнее всего, связано с пополнением популяции этих клеток за счет здоровых (неинфицированных) клеток.
