Введение к работе
В последние годы становится все более очевидным, что роль антител, направленных против антигенов ЫЬА класса I (анти-ША AT), не ограничивается их участием в развитии сверхострого отторжения аллотрансплантатов. Все большее число исследователей склонны считать, что образование анти-HLA AT в пост-трансплантационный период приводит к развитию ускоренного острого, острого или хронического отторжения.
Так, Sucui-Focaet al (1991) из Колумбийского университета Нью-Йорка показали, что выживаемость почечного аллотрансплантата в течение четырех лет без анти-HLA AT составляет 73,8%, в то время как выживаемость трансплантата с анти-HLA AT -46,7 %. Для аллотрансплантата сердца четырехлетняя выживаемость трансплантата составляет 90% без анти-HLA AT и 38% с анти-HLA AT. Molbr et al (1993,1994) из Швециии получата высокую степень корреляции между присутствием донор-специфических анти-HLA AT и развитием раннего острого отторжения.
Al-Hussein et al (1994, Великобритания) показали, что донор-специфические IgG анти-HLA AT имели все больные с тяжелой формой отторжения. Более того, авторы считают, что выявление анти-HLA AT может иметь прогностическое значение, т.к. они обнаруживаются до появления клинических признаков отторжения.
Показано (Terasaki et al, 1993), что класс анти-HLA AT имеет большое значение для выживания трансплантата. Выживаемость трансплантата в течение года у больных с IgA анти-HLA AT была значительно выше (91%), чем у больных без IgA анти-HLA AT (58%). Интересны недавно опубликованные данные Lederer et al (1996) о том, что 50% больных с ранней дисфункцией ірансплантата имели предсуществующие AT к антигенам HLA класса II.
Для лучшего понимания роли анти-HLA AT в выживании трансплантата необходима более подробная информация о свойствах антител (класс, подкласс, аффинность и т.д.). Следовательно, нужны новые чувствительные и специфичные методы для их определения. Основным методом, используемым для определения анти-HLA AT является лимфоцитотоксический тест (ЛЦТ). Несмотря на появление различных его модификаций с целью повышения чувствительности, метод имеет существенные недостатки: обладает низкой чуствительностью, не определяет нефиксирующие комплемент AT, для постановки метода требуются живые клетки. Кроме того, он может давать ложно-положительные результаты за счет определения не-HLA AT. В 1983 г. Garovoy et al предложили использовать метод проточной цитофлуориметрии для определения анти-HLA AT. Метод является более чувствительный, чем ЛЦТ, позволяет определять нефиксирующие комплемент AT, а также классы и подклассы AT. Однако этот метод сохраняет один из основных недостатков ЛЦТ - для его постановки требуются живые клетки. Высокая стоимость оборудования также является недостатком этого метода.
Альтернативным методом, лишенным этих недостатков, но обладающим высокой чувствительностью и специфичностью является метод иммуноферментного анализа (ИФА).
Метод основан на использовании очищенных донорских молекул HLA, выделенных из лимфоцитов. До последнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий, т.к. выделение HLA антигенов из клеток донора является довольно сложной методической задачей, которая практически невыполнима в клинических условиях. В 1989 году Mueller-Eckhardt et al для определения анти-HLA AT разработали МАЛА (monoclonal antibody immobilization of leucocyte antigen) метод. MAILA метод основан на том, что клетки (лимфоциты, тромбоциты) инкубируются одновременно с моноклональными AT к общей детерминанте HLA молекулы (W6/32) и исследуемой сывороткой. Затем клетки промываются и солюбилизируются. После центрифугирования лизат переносится на планшет, покрытый противовидовыми антителами. Вслед за иммобилизацией комплексов МоАТ/АГ, анти-HLA AT выявляются при добавлении меченных ферментом козьих антител против IgG человека. Основным' недостатком зтого метода является использование живых клеток, что делает невозможным пост-трансплатационный мониторинг больных.
В данной работе представлен метод, который является модификацией МАЛА метода.
Целью настоящей работы является создание высокочувствительной и специфичной тест-системы на основе твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) для определения антител к антигенам гистосовместимости класса І в сыворотке человека и оценке возможности его использования в клинической практике.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
изучить условия выделения и хранения антигена HLA класса I из клеток периферической крови или спленоцитов донора без потери антигенной активности, используя отечественные моноклональные антитела ИКО-53 к мономорфной детерминанте молекулы HLA класса I;
оптимизировать условия проведения тИФА ( определить рабочие разведения антигенов, антител, коньюгатов, блокировать неспецифическое связывание);
разработать протокол постановки твердофазного иммунноферментного анализа;
изучить специфичность разработанной тест-системы;
произвести сравнительный анализ результатов, полученных
стандартным комплементзависимым
лимфоцитотоксическим методом, методом проточной флуориметрии и твердофазным иммуноферменгиым анализом;
апробировать метод твердофазного иммуиноферментного
анализа в клинике для определения уровня
предсуществующих антител, динамики уровня airra-HLA антител класса I при проведении сеансов плазмафереза и мониторинга донор-специфических апти-HLA AT класса І в пост-трансплантациоїшьій период.
Впервые в отечественной клинической практике создан
метод твердофазного иммуноферментного аналгоа для определения
уровня и классов анти-HLA AT в различных клинических ситуациях.
Метод обладает более высокой чувствительностью и
специфичностью, чем стандартный комплемептзависимый
яимфоцитотоксический " тест, поскольку позволяет определять низкие уровни аити-HLA шггител, и нефиксирующие комплемент анти-HLA антитела, неопределяемые лимфоцитотоксическим методом.
Установлено, что при длительном хранении комплекса лимфоцит/ моноклональные антитела ИКО-53 к общей детерминанте молекулы HLA (18-20 месяцев, t=-40pC) сохраняются антигенные свойства молекулы HLA.
Показано, что для фиксации антигена HLA на твердой фазе может быть применена биоспецифическая иммобилизация антигена с помощью биотинилированных ИКО-53.
Доказано, что инактивированиая (20 мин. при 60 С) кроличья сыворотка и 0,5% раствор гидролизата казеина снижают "фоновый" сигнал реакции лучше других блокирующих агентов. Установлено, что применение моноклональных анги-10-Рс-специфических антител, коньюгированных с пероксидазой хрена, позволяет максимально снизить неспецифические реакции при выявлении IgG анти-HLA антител в анализируемых сыворотках.
Показана принципиальная возможность использования разработанной тест-системы для определения предсуществующих антител, донор-специфических анти-HLA антител и оценки эффективности сеансов плазмафереза. Установлено, что в первые два месяца после пересадки аллотрансплантата почки появление донор-специфических анти-HLA антител класса I коррелирует с эпизодами отторжения, причем у реципиентов повторного трансплантата антитела появляются чаще, чем у реципиентов первичного трансплантата.
По теме диссертации опубликовано 5 работ в отечестаегаюй и зарубежной печати.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены:
-
В лаборатории типирования, Guy' s HospitalyJIoBwon, 1995г.
-
В лаборатории трансплантационной иммунологии и типирования, Oxford Transplant Centre, 1995г.
-
На объединенной научной конференции отделений НИИ Трансплантологии и Искусственных органов, 1996г.
Диссертация изложена на листах машинописного
текста, состоит из введения, обзора литературы, глав
исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована
рисунками и таблицами. Список литературы
содержит отечественных и зарубежных источников.
