Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Развитие и характер HLA-сенсибилизации при различных иммунных воздействиях
1.1 Структура и функции HLA-комплекса.
1.2 Структура, образование и динамика содержания HLA-антител .
1.3 Образование HLA-антител при беременности.
1.4 HLA-сенсибилизация при трансфузиях компонентов крови.
Глава 2. Объект и методы исследования.
2.1 Объект исследования.
2.2 Методы исследования .
Глава 3. Закономерности образования антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости при гемокомпонентной терапии .
3.1 Анализ уровня, специфической направленности и динамики содержания антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости.
3.2 Выявление факторов, влияющих на развитие сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости .
Глава 4. Антилимфоцитарные аутоантитела у пациентов, получающих гемокомпонентную терапию и являющихся потенциальными реципиентами почечного трансплантата .
Глава 5. Закономерности образования HLA-антител в результате беременностей.
Глава 6. Значение HLA-антител при проведении гемокомпонентной терапии и подборе аллогенного почечного трансплантата (обсуждение результатов).
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Структура, образование и динамика содержания HLA-антител
- Методы исследования
- Выявление факторов, влияющих на развитие сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости
- Антилимфоцитарные аутоантитела у пациентов, получающих гемокомпонентную терапию и являющихся потенциальными реципиентами почечного трансплантата
Введение к работе
Актуальность проблемы Обеспечение иммунологической безопасности переливания компонентов крови является актуальной задачей трансфузионной медицины. К сожалению, в клинической практике ЛПУ пока еще широко применяются трансфузии гемокомпонентнов, не обедненных лейкоцитами. Антигены главного комплекса гистосовместимости представлены на лейкоцитах и тромбоцитах и являются главной причиной аллоиммунизации к ним [52, 207]. Известно, что только лейкофильтрация снижает уровень лейкоцитов в эритроцитной массе и свежезамороженной плазме ниже иммуногенного - 1x10(6) клеток на трансфузию [38].
Одним из осложнений, требующим проведения профилактических мероприятий, является развитие негемолитических реакций, возникающих вследствие несовместимости по антигенам системы HLA [118, 170]. У больных, которым выполняются повторные гемотрансфузии, могут возникать фебрильные реакции и крапивница [48, 65], а также некардиогенный острый отек легких [34, 207]. Известно также, что при наличии HLA-сенсибилизации у больных развивается рефрактерность к переливанию тромбоцитов [18, 54, 57]. Наличие HLA-антител у реципиента аллотрансплантата почки способно вызвать гиперострое и острое отторжение [66, 121, 171].
Одной из групп пациентов, часто получающих трансфузии гемокомпонентов, являются больные хронической почечной недостаточностью. У этих больных развивается нефрогенная анемия, основным патогенетическим механизмом которой является снижение выработки эритропоэтина пораженными почками, а также кровопотери, связанные как с гемодиализом, так и желудочно-кишечные кровотечения вследствие эрозий и язв и нарушений гемокоагуляции. Ургентные ситуации с резким снижением гемоглобина требуют неотложной коррекции синдрома анемии с использованием донорских эритроцитов [35, 43, 69]. Кроме того, у данных больных развиваются нефротический синдром и гипопротеинемия [22, 64]. В широком использовании до сих пор применяется свежезамороженная плазма как средство коррекции гипопротеинемии у этих больных.
Известно, что при проведении идентичной гемокомпонентной терапии у различных пациентов, часть из них активно и быстро вырабатывают HLA-антитела, а часть, напротив, не отвечают на сенсибилизирующие воздействия [75, 186]. Так как система HLA играет важную роль в формировании иммунного ответа, представляется актуальным изучение связи HLA-фенотипа с возникновением и выраженностью сенсибилизации.
В свою очередь наличие HLA-сенсибилизации у потенциальных реципиентов почечного аллотрансплантата значительно затрудняет, а порой делает невозможным подбор совместимого донора [169, 177]. Однако известно, что у некоторых сенсибилизированных больных положительная реакция их сыворотки с лимфоцитами предполагаемого донора почечного трансплантата может быть обусловлена не HLA-антителами, а антилимфоцитарными аутоантителами, относящимися к классу IgM [93, 123, 160, 186]. Выявление таких антител позволит провести им аллотрансплантацию почки, так как сенсибилизация, связанная с наличием IgM антител, не оказывает отрицательного воздействия на трансплантат и при положительной перекрестной пробе на индивидуальную совместимость (кросс-матч), обусловленной IgM антителами, пациент может участвовать в дальнейшем подборе данного донора.
Во время беременности происходит HLA-сенсибилизация женщин чужеродными для организма матери антигенами отца, экспрессироваными на тканях плода [19, 67, 107]. Эти антитела сохраняются в крови женщины обычно более длительный период, чем антитела, возникающие при трансфузиях компонентов крови [12, 45]. В литературе имеются сведения о зависимости развития HLA-сенсибилизации у женщин от числа беременностей и родов в анамнезе [9, 29, 45]. Однако в настоящее время нет четких данных о сроках выработки HLA-антител у женщин во время беременности и связи их с беременностями, прерванными на ранних сроках.
В силу изложенного изучение динамики развития аллосенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости при проведении гемокомпонентной терапии и у женщин во время беременности являются актуальными вопросами иммуногематологии, изучение которых позволит установить закономерности образования HLA-антител как при проведении гемокомпонентной терапии потенциальным реципиентам почечного трансплантата, так и в результате беременностей, в том числе прерванных на раннем сроке, у женщин, и разработать рекомендации для профилактики сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости.
Цель исследования: изучение закономерностей образования HLA-антител при проведении гемокомпонентной терапии потенциальным реципиентам почечного трансплантата и при беременности.
Задачи исследования:
Изучить частоту HLA-сенсибилизации у пациентов с хронической почечной недостаточностью, получающих нелейкофильтрованные гемокомпоненты: эритроцитную массу и свежезамороженную плазму.
Установить факторы риска развития сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости у больных, получающих гемокомпонентную терапию.
Изучить частоту встречаемости аутоантител и изменение их содержания в ди
На основании выявленных закономерностей образования аутоантител и изменения их содержания в динамике разработать схему иммунологического обследования потенциальных реципиентов почечного трансплантата.
Изучить сроки выработки антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости во время беременности и провести анализ зависимости широты HLA-сенсибилизации от числа беременностей в анамнезе.
Научная новизна работы Установлено, что факторами риска развития сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости, являются, кроме увеличения количества трансфузий гемокомпонентов, иммуногенетические особенности больных и женский пол.
Показано, что у значительной части пациентов, имевших в анамнезе гемотрансфузии и являющихся потенциальными реципиентами почечного трансплантата, антилимф оцитарные антитела представлены антителами класса IgM, которые не оказывают отрицательного воздействия на приживление трансплантата.
Получены новые научные данные о закономерностях образования HLA-антител при беременности: антитела к антигенам I класса главного комплекса гистосовместимости формируются в I триместре беременности, и даже искусственно прерванная на ранних сроках беременность является сильным сенсибилизирующим воздействием, приводящим к активной выработке длительно персистирующих в организме антител.
Практическая значимость работы
Разработан алгоритм выявления HLA-антител в сыворотках больных, находящихся на гемодиализе и получающих гемокомпонентную терапию. Разработаны рекомендации по профилактике HLA-сенсибилизации и осложнений, обусловленных несовместимостью крови донора и реципиента по HLA-антигенам, у больных с наличием HLA-антител.
Внедрен в клиническую практику метод определения антилимфоцитарных аутоантител и разработан алгоритм обследования и мониторинга содержания этих антител в сыворотках потенциальных реципиентов почечного трансплантата, позволяющий повысить эффективность подбора совместимого донорского органа для этих больных.
Разработаны рекомендации по профилактике образования HLA-антител у женщин, получающих гемокомпонентную терапию и имеющих в анамнезе беременности, в том числе прерванные на раннем сроке. Эти рекомендации позволят повысить эффективность гемокомпонентной терапии у этих больных, в том числе при переливании концентрата тромбоцитов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту: Факторами риска развития сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости являются трансфузии гемокомпонентов, содержащих лейкоциты в дозе, превышающей 1x10(6) клеток на трансфузию, наличие в генотипе специфичностей А25 и DRB1*03 и гаплотипа A1,B8,DRB1*03, а также женский пол. Высокосенсибилизированные пациенты встречаются в 3 раза чаще среди женщин, чем среди мужчин.
Установлено, что у 25% больных, находящихся на хроническом гемодиализе и получающих нелейкофильтрованную эритроцитную массу и свежезамороженную плазму, антилимфоцитарные антитела представлены аутоантителами класса IgM, а у 44% - смешанными (IgM и IgG) антителами. Характерными особенностями динамики IgM антител в организме, в отличие от IgG, являются значительные колебания их содержания.
Проведение пробы с дитиотреитолом, выявляющей наличие антилимфоцитарных аутоантител класса IgM, параллельно с проведением обычной пробы на совместимость донора и реципиента, позволяет значительную часть реципиентов отнести к группе пациентов с отсутствием сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости и продолжать для них подбор совместимого донора.
Антитела к антигенам I класса главного комплекса гистосовместимости формируются уже в первом триместре беременности, а частота образования этих антител у женщин зависит от количества беременностей в анамнезе, в том числе и искусственно прерванных на ранних сроках, и варьирует от 10% у первобеременных до 35% у женщин с 7 и более беременностями в анамнезе.
Апробация материалов диссертации: Основные положения диссертации были представлены на Российской научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (2002, Санкт-Петербург), на Юбилейной научной конференции молодых ученых Северо-западного региона (2004, Санкт-Петербург), на Научной конференции "Клиническая трансплантация органов" (2005, Москва), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006, Санкт-Петербург).
Публикации:
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Внедрение результатов исследования в практику: Результаты проведенного исследования внедрены в практику Республиканского центра иммунологического типирования тканей ФГУ «Российского НИИ гематологии и трансфузиологии Росмедтехнологии» и в практику Городской лаборатории иммуногенетики и серологической диагностики г. Санкт-Петербурга.
Личный вклад автора:
Автором лично выполнено исследование на наличие HLA-антител сывороток рожениц и больных, находящихся на гемодиализе и получающих гемокомпонентную терапию; проведено исследование антигенов HLA I класса и генов HLA II класса с помощью КЗЛЦТТ и ПЦР; внедрена методика определения антилимфоцитарных аутоантител с помощью ДТТ; проведены статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследования.
Структура, образование и динамика содержания HLA-антител
Все антитела представлены иммуноглобулинами и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигенами. Известны пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgG, IgD, IgE и IgM. Основную массу сывороточных иммуноглобулинов (70-80%) составляет IgG; IgA - 10-15%; IgM - 5-10%; иммуноглобулины класса Е и D встречаются в сыворотках только примерно в 0,2% [103]. При этом IgG присутствует также в экстраваскулярной жидкости, некоторое количество IgM можно обнаружить в эпителиальных секретах, а очень незначительная часть этих крупных молекул может диффундировать в интерстициальную жидкость. Основная часть IgA находится в слизистых секретах в виде полимерных молекул, где они имеют большое физиологическое значение: благодаря их существованию слизистый эпителий эффективно предохраняется от бактериальных и вирусных инфекций. Большая часть IgE присутствует в виде мономеров, тесно связанных с мембраной базофильных гранулоцитов, которые несут рецептор с высоким аффинитетом, взаимодействующий с Сн4 тяжелой цепи IgE. IgE ответственны за реакции иммунной системы при гиперчувствительности немедленного типа. Подавляющее большинство молекул IgD представляют собой мембранные иммуноглобулины нестимулированных В-клеток.
Иммуноглобулины представляют собой гликопротеины с молекулярной массой от 150 до 900 кД. Молекула антитела состоит из четырех полипептидных цепей - двух идентичных цепей из 214 аминокислот (легкие цепи-L) и двух идентичных цепей из 440 аминокислот (тяжелые цепи-Н). Расположенный ближе других к N-концу каждой цепи домен представляет собой участок наибольшей вариабельности аминокислотной последовательности. Эти N-терминальные домены, названные вариабельными (VL - для легких цепей, VH - для тяжелых), определяют антигенную специфичность молекулы иммуноглобулина. Остальные три (или четыре) домена тяжелых и один домен легких цепей называют константными доменами и обозначают как CL и Сні, Сн2, СнЗ, и Сн4. Пять изотипов тяжелых и два изотипа легких цепей определяются аминокислотами константных доменов. Каждая легкая цепь соединена дисульфидной связью с одной тяжелой цепью. Один или более дисульфидных мостиков связывают между собой две тяжелые цепи на участке между Сні и Сн2 - области, где молекула обладает существенной гибкостью, названной "шарнирной" областью. Такие дисульфидные связи между цепями в высокой степени устойчивы к "расщепляющему" действию агентов.
Два идентичных N-концевых фрагмента, сохраняющих специфичность антитела, называются Fab-фрагментами. Fab-фрагмент участвует в связывании антигена и структурно представляет легкую цепь в паре с тяжелой цепью Сні домена иммуноглобулина. Соединенные С-концевые участки тяжелых цепей представляют собой фрагмент молекулы, утративший специфические свойства антитела и способный к кристаллизации, его называют Fc-фрагментом. Fc-фрагмент участвует в проведении сигнала внутрь клетки, который генерируется в результате связывания антигена с Fab-фрагментом и активирует клетки, несущие Fc-рецепторы.
Дисульфидные связи могут также объединять иммуноглобулины-мономеры друг с другом в зависимости от присутствия определенных аминокислот в константных доменах данных молекул иммуноглобулинов. Интактный четырехцепочечный мономер иммуноглобулинов взаимодействует с двумя молекулами антигена, по одной молекуле на каждый Fab-фрагмент. До тех пор, пока дисульфидные связи соединяют легкие цепи с тяжелыми, один Fab-фрагмент способен связываться только с одной молекулой антигена. Изолированные легкие цепи или вариабельные участки тяжелых цепей по отдельности неспособны эффективно взаимодействовать с антигеном [73, 175].
При Т - зависимом иммунном ответе Т-хелперы праймируются патогеном после его процессинга внутри антиген-представляющей клетки. В-лимфоциты захватывают внутрь клетки комплекс поверхностного иммуноглобулина с патогеном. Попавший внутрь клетки патоген деградирует до пептидов, которые затем могут быть представлены на поверхности В-лимфоцита в совокупности с МНС II класса праймированным ранее тем же антигеном Т-хелперам. В результате В-лимфоцит получает сигнал к пролиферации и последующей дифференцировке в антитело-продуцирующие плазматические клетки. В процессе межклеточных контактов активированные Т-хелперы продуцируют ИЛ-4 - В-клеточный ростовой фактор, который способствует пролиферации В-клеток и образованию клеточных клонов. Т-хелперы участвуют также в дифференцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки, продуцируя ИЛ-5, -6, -10, и -13. При Т-независимом гуморальном ответе В-лимфоциты непосредственно активируются под действием антигена и дифференцируются в плазматические клетки. В-клеточный антигенный рецептор представлен поверхностным иммуноглобулином, который состоит из экстрацеллюлярной, трансмембранной и цитоплазматической частей, часть Fc фрагмента погружена в клетку. В подавляющем числе случаев В-клеточный рецептор представлен поверхностными IgD и IgM. После связывания антигена экстрацеллюлярно расположенным Fab фрагментом возникает сигнал, который проводится в клетку трансмембранной и интрацеллюлярной частями рецептора. В результате этого В-клетка преактивируется и подготавливается к синтезу ДНК и делению.
Методы исследования
Определение антигенов HLA 1-го класса проводили методом стандартного комплементзависимого лимфоцитотоксического теста.
Для выделения лимфоцитов использовали обработанную антикоагулянтом периферическую кровь больных, которую разводили эквивалентным объемом солевого раствора PBS (1:1); наслаивали на градиент плотности и центрифугировали при 2000 об/мин (800g) в течение 20 мин. Далее снимали слой лимфоцитов, находящихся на границе с плазмой и градиентом плотности, разводили перенесенные клетки PBS раствором и отмывали их дважды центрифугированием при 1500 об/мин (60-100g) в течение 10 мин и один раз при 2000 об/мин (800g) в течение 1 мин. Выделенные лимфоциты ресуспендировали в растворе PBS.
Для серологического HLA-типирования антигенов класса I использовали стандартные наборы, содержащие сыворотки против соответствующих HLA антигенов локусов А и В, а также положительный и отрицательный контроли. В каждую лунку типирующей панели вносили 1 мкл лимфоцитарной суспензии и инкубировали при температуре 22С в течение 30 минут. По истечении времени добавляли 5 мкл кроличьего комплемента и инкубировали при температуре 22С в течение 60 минут. Далее добавляли 3 мкл 5% эозина, выдерживали 3 минуты и фиксировали 37% (рН 7,2) раствором формалина в объеме 5 мкл и осуществляли считывание результатов HLA-типирования с помощью микроскопа после оседания лимфоцитов.
Положительный результат оценивали по числу прокрашенных лимфоцитов, что указывало на наличие антигена соответствующей специфичности. В том случае, если клетки после проведения реакции оставались жизнеспособными (неприкрашенными), то это указывало на отсутствие антигена соответствующей специфичности. В таблице 2.5 представлена шкала оценки лимфоцитотоксического теста.
Геномную ДНК для исследования выделяли из мононуклеарных клеток стабилизированной EDTA периферической крови, свежей или свежезамороженной и сохраняемой при -20С.
Кровь в количестве 500,0 мкл центрифугировали, при 13000g в течение 1 минуты в пластиковой пробирке типа "Eppendorf". Затем эритроциты удаляли путем обработки осадка 500,0 мкл лизирующего буфера (0,32М сахарозы, ЮтМ трис-HCl рН 7,5, 5mM MgCl2, 1% тритона Х-100) с последующим центрифугированием при 13000g в течение 1 минуты. Процедуру лизиса повторяли до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась совершенно прозрачной (до 6 раз). После окончательного удаления надосадочной жидкости при помощи автоматического дозатора, к осадку добавляли 60,0 мкл буфера (50 mM КС1, 10 тМ трис-HCl рН 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20), содержащего 250 мкг/мл протеиназы К, и ресуспендировали. Инкубировали с ферментом в течение 60 минут при +55С. Инактивацию протеиназы после инкубации проводили нагреванием пробирки на водяной бане при +95С в течение 10 минут. После остывания конденсат осаждали центрифугированием при 13000g в течение 10-15 секунд.
Определение HLA-DRB1 генов проводили с помощью наборов реагентов «НПФ ДНК-Технология» (Москва). Отличительной особенностью примененного метода является использование во время одной амплификации смеси нескольких пар праймеров (в наборе содержится 10 видов смесей), образующих в ходе ПНР продукты различной длины. Это позволяет амплифицировать одновременно различные аллельные варианты исследуемого гена и идентифицировать их по соотношению ПЦР-продукта со стандартным маркером длин ДНК (PUC 19). Двухстадийная схема амплификации обеспечивает надежность и специфичность реакции. Амплификацию проводили на амшшфикаторе "ТЕРЦИК" той же фирмы. Общий объем реакционной смеси для амплификации в одной пробирке на всех этапах составлял 10 мкл, включая 4 мкл готовой смеси для амплификации, 5 мкл прилагаемого разбавителя №1, 1 мкл исследуемой ДНК и 1 единицу термостабильной Taq-полимеразы.
Продукт, полученный в ходе амплификации, определяли методом горизонтального электрофореза в окрашенном бромистым этидием 3,3%-ом агарозном геле в ультрафиолетовом свете (310 нм). «Карманы», в которых присутствует специфический PCR продукт (и отсутствует или присутствует слабый внутренний позитивный контроль) указывали на присутствие специфических генов у тестируемого индивидуума. Специфичность продукта амплификации на всех этапах исследования оценивали в соотношении со стандартным маркером длин ДНК (PUC-19) (таблицы 2.6 и 2.7).
Определение HLA-антител в сыворотках рожениц проводили путем скрининга сывороток, полученных из ретроплацентарной крови. Определение HLA-антител в сыворотках, полученных из крови потенциальных реципиентов почечного трансплантата, проводили 1 раз в 3 месяца. При проведении гемотрансфузий образцы сывороток больных исследовали через 14 дней.
Исследование антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости проводили в стандартном комплементзависимом лимфоцитотоксическом тесте, используя панель донорских лимфоцитов, состоящей из клеток, выделенных из крови 60-ти доноров с установленным HLA-фенотипом. Клеточная панель была подобрана таким образом, чтобы были максимально широко представлены все известные HLA-антигены.
Выявление факторов, влияющих на развитие сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости
Для того чтобы определить, влияет ли на выработку антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости нозологическая форма заболевания, в результате которой у этих больных развилась хроническая почечная недостаточность, мы провели анализ частоты выработки антител в зависимости от патологии, приведшей к поражению почек. В таблице 3.2 показан уровень HLA-сенсибилизации у больных с различной патологией, приведшей к хронической почечной недостаточности.
Из данных, представленных в таблице, видно, что частота образования антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости практически не различается между этими группами больных. Таким образом, патология, приведшая к хронической почечной недостаточности, не влияет на выработку антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости.
Далее мы изучили зависимость возникновения HLA-аллоиммунизации от интенсивности гемокомпонентной терапии. Известно, что количество трансфузий компонентов крови может являться определяющим в инициации иммунного ответа и, соответственно, в связи с ростом количества гемотрансфузий частота сенсибилизации связана с длительностью заболевания. Поэтому, чтобы определить связь между уровнем аллосенсибилизации и числом трансфузий гемокомпонентов, мы проанализировали зависимость HLA-сенсибилизации от длительности нахождения на гемодиализе у больных, получающих гемокомпоненты (ЭМ и СЗП). Как видно из таблицы 3.3, у больных с длительным сроком нахождения на гемодиализе частота HLA-сенсибилизации увеличилась от 13,8% до 47,2%. Такая картина объясняется тем, что с увеличением срока нахождения на гемодиализе растет количество гемотрансфузий, а соответственно, увеличивается и частота, и длительность сенсибилизирующего воздействия гемокомпонентов (ЭМ и СЗП).
Таким образом, мы подтвердили, что образование антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости зависит от количества трансфузий компонентов крови.
Поскольку в литературе имеются данные об возрастном снижении активности иммунной системы, то далее мы изучили влияние возраста на образование антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости. В таблице 3.4 представлена зависимость HLA-сенсибилизации от возраста среди больных.
Из данных, представленных в таблицах видно, что у больных в возрасте до 25 лет частота HLA-сенсибилизации составила 38,5%, у больных в возрасте от 26 до 55 лет - 38,1%, а у больных старше 55 лет - 37%. Таким образом, у больных разного возраста частота образования антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости практически не различалась.
Возможно, что увеличение с возрастом длительности заболевания, а соответственно, и предшествующих переливаний компонентов крови, не позволяет в полной мере оценить зависимость частоты HLA-сенсибилизации от возраста. Поэтому мы попытались сравнить частоту HLA-сенсибилизации в зависимости от возраста у пациентов с одинаковой длительностью гемодиализа, чтобы исключить влияние на них числа гемотрансфузий. Но так как мы не смогли сформировать количественно сопоставимые группы обследуемых, то не можем ни опровергнуть, ни подтвердить влияние возраста больного на частоту выработки HLA-антител.
Для того чтобы определить у кого выше риск развития HLA-сенсибилизации: у мужчин или у женщин, мы сравнили образование антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости у мужчин и женщин (таблица 3.5).
При сравнении данных в таблице 10 можно отметить, что среди 312 обследуемых женщин 126 (40,4%) имели HLA-антитела, а среди 435 мужчин -157 (36,1% ). Таким образом, у женщин уровень сенсибилизации незначительно выше, чем у мужчин: 40,4% vs 36,1%.
Далее мы изучили соотношение мужчин и женщин в каждой группе сенсибилизированных. Распределение мужчин и женщин по уровню HLA-сенсибилизации представлено на рисунке 3.6.
Из представленных данных видно, что среди женщин выше уровень сенсибилизации к антигенам главного комплекса гистосовместимости, так как среди них значительно больше высокосенсибилизированных больных, чем среди мужчин: 32,5% vs 12,7% (х2= 16,21, р 0,001). Таким образом, высокосенсибилизированные пациенты встречаются практически в три раза чаще среди женщин, чем среди мужчин. Очевидно, что это связано с возможной предшествующей сенсибилизацией женщин HLA-антигенами плода во время беременности и, соответственно, более интенсивной выработкой антител на антигенное воздействие при проведении гемокомонентной терапии.
Так как система HLA играет важную роль в формировании иммунного ответа, мы исследовали связь HLA-фенотипа с возникновением и выраженностью сенсибилизации и определили имеется ли генетическая предрасположенность к выработке антител к HLA-антигенам. Нами было изучено распределение специфичностей HLA I и II класса у больных с целью установления HLA-маркеров, влияющих на возникновение сенсибилизации к тканевым антигенам.
Антилимфоцитарные аутоантитела у пациентов, получающих гемокомпонентную терапию и являющихся потенциальными реципиентами почечного трансплантата
Известно, что в крови пациентов могут содержаться лимфоцитотоксические антитела класса IgM (аутоантитела), не оказывающие вредного влияния на приживление трансплантата в отличие от собственно HLA-антител - IgG класса. IgM антитела обладают широкой реактивностью с собственными клетками пациента, а также с лимфоцитами большинства других индивидов и обычно не имеют клинического значения, так как не вызывают иммунологических реакций при трансфузии и трансплантации. Однако в лабораторных условиях они могут обуславливать ложноположительные реакции при постановке перекрестной пробы на индивидуальную совместимость. Получение положительных результатов при этой пробе указывают на несовместимость между реципиентом и потенциальным донором, что приводит к потери совместимого потенциального донора и отказу от проведения трансплантации. Как было указано в главе 1 модификация лимфоцитотоксического теста с использованием дитиотреитола (ДТТ), который является сульфгидрильным соединением, может обеспечить простой и быстрый метод для отличия реакции за счет IgM антител от реакции с участием IgG антител и позволит выявить истинную HLA-сенсибилизацию. Чтобы уточнить эти данные, мы с помощью данного метода изучили частоту встречаемости IgG и IgM антител и изменение их количества в динамике в сыворотках больных, имеющих антитела. На рисунке 4.1 представлено распределение IgG и IgM антител в сыворотках потенциальных реципиентов почечного трансплантата. Из данных, представленных на рисунке 4.1 видно, что из 93 сенсибилизированных больных в сыворотке 23 потенциальных реципиентов почки (24,7%) присутствуют только IgM антитела. У 29 больных (31,2%) были выявлены только IgG антитела. И, наконец, 41 реципиент (44,1%) относится к группе со смешанными IgM и IgG антителами. Далее мы исследовали распределение IgG и IgM антител у больных с разным уровнем сенсибилизации (рисунок 4.2). Из данных, представленных на рисунке 4.2 видно, что большинство больных с наличием только IgM антител (60,9%) являются низкосенсибилизированными, а 21,7% пациентов относятся к группе со средним и 17,4% - с высоким уровнем предсуществующей сенсибилизации.
Напротив, в группе больных с наличием только IgG антител более половины пациентов (55,2%) относятся к высокосенсибилизированным и меньшинство (20,7%) - к низкосенсибилизированным больным. В группе со смешанными IgM и IgG антителами 36,6% имеют средний и 48,8% - высокий уровень сенсибилизации, значительную долю которой обусловливает присутствие IgM антител. На рисунке 4.3 представлено соотношение IgG и IgM антител среди сенсибилизированных больных. Из данных, представленных на рисунке, видно, что у больных со смешанными IgG и IgM антителами в 41,5% случаев содержание IgM превалирует над IgG, у 12,2% реципиентов - одинаковое содержание и тех, и других антител, а у 46,3% содержание IgG антител значительно превышает IgM. Кроме того, нами было выявлено, что разброс соотношений IgG и IgM антител очень широк среди обследуемых реципиентов - от 1:40 до 1:1. Мы проанализировали и сравнили нозологические формы заболеваний у больных с наличием только IgM антител, у больных с присутствием и IgM, и IgG антител и у больных с наличием только IgG антител. На рисунках 4.4, 4.5 и 4.6 представлено распределение обследуемых больных с IgM, с IgG и со смешанными антителами по заболеваниям, явившимся причиной хронической почечной недостаточности. Таким образом, среди больных, у которых присутствовали как только IgM, только IgG, так и IgM и IgG антитела, преобладает хронический гломерулонефрит, как и в общей группе, но при этом у больных с наличием только IgM антител, в патогенезе всех представленных заболеваний обязательно присутствовал аутоиммунный компонент. Среди больных со смешанными антителами встречались пациенты с диагнозами, в патогенезе которых отсутствовал аутоиммунный процесс, но среди больных с наличием только IgG антител таких пациентов было больше. При исследовании динамики содержания IgM и IgG антител у пациентов с разным уровнем сенсибилизации (среди низко-, средне- и высокосенсибилизированных) использовали образцы их сывороток, взятые через 3 и 6 месяцев после первоначального исследования (рисунок 4.7).
