Введение к работе
Актуальность темы
Разработка современных прогностических критериев эффективности лечения гепатита С при ВИЧ-инфекции и новых методов лабораторной диагностики эффективности терапии являются наиболее актуальной проблемой в современной медицине. Поиск наиболее эффективных вариантов терапии вирусных гепатитов приобретает все большую актуальность в современной медико-биологической науке и практическом здравоохранении в связи с возросшей заболеваемостью, широким распространением среди трудоспособного населения, недостаточной эффективностью современных методов профилактики [Николаева Л.И.,2012]. Прогнозировать характер течения вирусных заболеваний среди ВИЧ-инфицированных пациентов, выявлять предрасположенность к развитию хронических форм инфекции, отсутствие молекулярных технологий предупреждения развития осложнений; дегенеративных, фибротических и опухолевых процессов [Kelleher T.B.,2005] представляется нерешенной задачей. У ВИЧ-инфицированных пациентов, имеющих коинфекцию вирусом гепатита С, иммунная система оказывается неспособной элиминировать вирус HCV, что позволяет ему длительно реплицироваться в гепатоцитах и ряде других клеток, приводя к хронизации инфекции. В противовирусную терапию гепатита С в настоящее время входит комбинация интерферона и рибавирина [Fried MW.,2002]. Одним из аспектов эффективности такого лечения по-видимому является иммуностимулирующий эффект, который может быть недостаточно эффективным у пациентов с ВИЧ инфекцией и связан с иммунным статусом на разных стадиях течения ВИЧ-инфекции.
Актуальным аспектом лечения гепатита С у ВИЧ инфицированных остается недостаточная эффективность противовирусной терапии, а также отсутствие четких предикторов эффективности лечебных мероприятий применительно к конкретному пациенту. Установлено, что характер и направленность изменений продукции и рецепции цитокинов не зависят от этиологического варианта вирусной инфекции и согласуются с концепцией типовых механизмов развития инфекционного процесса. Определено, что некоторые полиморфизмы в промоторных регионах генов цитокинов обладают протективным эффектом в отношении HCV-инфекции [Арсентьева Н.А.,2012]. Взаимосвязь развития хронического вирусного гепатита С с полиморфизмом промоторных участков таких генов делает актуальным поиск иммуногенетических критериев эффективности лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Цель исследования
Целью настоящей работы является оптимизация алгоритма обследования пациентов с ВГС/ВИЧ-инфекцией на основе оценки иммуногенетического профиля для повышения эффективности противовирусной терапии.
Задачи исследования
-
Исследовать зависимость эффективности терапии гепатита С от иммунного статуса и вирусной нагрузки РНК ВИЧ у ВИЧ-инфицированных пациентов в процессе лечения.
-
Оценить распределение аллельных вариантов генов системы интерферона AZIN1 (A/G), IFN (С/G), MxA (G/T), TLR4(C/T), в точках полиморфизма у ВИЧ инфицированных пациентов, проходящих лечение от гепатита С с разной эффективностью терапии.
-
Оценить распределение аллельных вариантов генов клеточного гомеостаза TRPM5 (C/T), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), в точках полиморфизма у ВИЧ инфицированных пациентов, проходящих лечение от гепатита С с разной эффективностью терапии.
-
Оценить распределение аллельных вариантов иммунорегуляторных генов IL 28b (rs8099917, rs12979860) и IL-10 (1082А/G, 592C/A) в точках полиморфизма у ВИЧ инфицированных пациентов, проходящих лечение от гепатита С с разной эффективностью терапии.
-
Разработать алгоритм прогноза течения гепатита С при ВИЧ-инфекции на основе иммуногенетических параметров и данных анамнеза.
Новизна исследования
Проведено комплексное исследование особенностей функционирования различных звеньев специфического иммунитета у пациентов с ВГС/ВИЧ-инфекцией в зависимости от эффективности лечения гепатита С.
Изучена взаимосвязь полиморфизма генов ключевых цитокинов с течением вирусного гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Проведена оценка корреляции и взаимосвязи между генотипом ключевых цитокинов с неэффективной ПВТ и особенностями иммунного статуса при смешанной ВГС/ВИЧ-инфекцией.
Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования
-
Разработан клинико-диагностический алгоритм, включающий комплекс определенных генетических и иммунологических маркеров, что позволит прогнозировать результат ПВТ, и уровень прогрессии вирусного гепатита С.
-
Диагностический алгоритм позволит индивидуализировать терапию для каждого пациента со смешанной ВГС/ВИЧ - инфекцией, вследствие чего увеличится время и качество жизни ВИЧ инфицированных пациентов с хроническим гепатитом С.
-
Полученные данные используется при подготовке студентов и интернов, на курсах ФУВ на кафедре клинической лабораторной диагностики ВолгГМУ
Личный вклад
Проведено обследование 80 ВИЧ-инфицированных пациентов с коинфекцией вирусным гепатитом С, получающих противовирусную терапию рибавирин + ПЕГ-интерферон-альфа. При обследовании больных использованы современные лабораторные методы исследования, в том числе иммунологическое исследование субпопуляций лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD69, CD25), определение вирусной нагрузки методом ПЦР (РНК ВИЧ, ВГС), биохимическое определение ферментов (активность АЛТ, АСТ), генотипирование ВГС, определение полиморфизмов генов цитокинов (AZIN1 (A/G), IFN (С/G), MxA (G/T), TLR4(C/T), TRPM5 (C/T), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), IL 28b (rs8099917, rs12979860) и IL-10 (1082А/G, 592C/A)). Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Эффективность противовирусной терапии гепатита С ВИЧ-инфицированных пациентов определяется уровнем вирусной нагрузки ВИЧ и степенью активации CD4+CD25+ Т-лимфоцитов совместно с вирусологическим и биохимическим критериями у ВИЧ-инфицированных пациентов низким.
-
Индивидуальные особенности функционирования в системе генов интерферона играют важную роль в эффективности лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов.
-
Различия в регуляции внутриклеточного гомеостаза у ВИЧ-инфицированных пациентов оказывают влияние на эффективность противовирусной терапии гепатита С.
-
В качестве благоприятных прогностических признаков эффективности терапии пегилированным интерфероном- и рибавирином выступают аллельные варианты иммунорегуляторного гена IL-10 (1082A/G).
-
Установленная связь полиморфизмов генов цитокинов с достижением устойчивого вирусологического ответа является основой для получения оценки прогноза эффективности лечения, что позволит в ранний период терапии, еще до получения вирусологического ответа индивидуализировать и оптимизировать терапию гепатита С.
Апробация работы
Апробация диссертации проведена на межкафедральном совещании кафедр: клинической лабораторной диагностики, иммунологии и аллергологии, молекулярной биологии и генетики ГБОУ ВПО ВолгГМУ города Волгограда 13.06.2013 г.
Материалы работы были представлены на научно-практической врачебной конференции «Инновационные технологии в лабораторной диагностике» (Волгоград, 2009), 68-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2010), 69-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2011), III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), Первой всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), 71-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2013)
Публикации
По материалам работы опубликовано 7 печатных работ, из них 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, посвящённой результатам собственного исследования, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 15 рисунками.
Библиографический указатель содержит 149 источников, из них 17 на русском, 132 на иностранном языке.
Материалы и методы
В основу работы положены клинические и лабораторные исследования, выполненные с 2008 по 2012 годы в период лечения больных на базе ГКУЗ «ВО ЦПБ СПИД и ИЗ».
Исследуемая группа состояла из 80 ВИЧ-инфицированных пациентов (возраст от 20 до 50 лет) с коинфекцией вирусом гепатита С и стадией ВИЧ IIIБ - IVА. Все пациенты получали противовирусную терапию. Наличие ВИЧ-инфекции и вирусного гепатита С подтверждались с помощью иммуноферментного анализа и качественного ПЦР.
Пациенты были включены в исследование при соблюдении следующих условий:
Критерии включения пациентов в исследование:
- пациенты со смешанной ВГС/ВИЧ инфекцией;
- возраст 18-60 лет;
- приверженность лечению
- подписанное информированное согласие
Критерии исключения из исследования:
- пациенты, не соблюдающие режим противовирусной терапии;
- туберкулез в анамнезе;
- беременность и лактация;
- социально незащищенные группы пациентов
Выбор сроков исследования иммунологических, биохимических и вирусологических параметров у пациентов проводили на основании стандартных схем обследования пациентов с вирусным гепатитом С (до начала ПВТ, при начале лечения, через 1,3,6 и 12 месяцев лечения).
Материалом для исследования служила кровь, собранная из вены утром натощак, до приема медикаментов, физиопроцедур и рентгенологического обследования, в пробирки с антикоагулянтом 3% ЭДТА.
Методы исследования:
I. Оценка иммунного статуса и молекулярно-генетический анализ:
-
Подсчет лейкоцитов и лейкоцитарной формулы .
-
Фенотипирование лимфоцитов крови (CD3, CD4, CD8, CD69, CD25) .
-
Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ключевых генов цитокинов (AZIN1 (A/G), IFN (С/G), MxA (G/T), TLR4(C/T), TRPM5 (C/T), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), IL 28b (rs8099917, rs12979860) и IL-10 (1082А/G, 592C/A)).
II. Определение эффективности противовирусной терапии:
-
Анализ данных амбулаторного наблюдения пациентов с ВГС/ВИЧ-инфекцией.
-
ПЦР исследование для количественного определения ВИЧ и ВГС.
-
Генотипирование ВГС методом ПЦР.
-
Биохимический анализ крови (определение активности АЛТ, АСТ)
Подсчет лейкоцитов и лейкоцитарной формулы проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex KX-21
Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США), c использованием моноклональных антител к поверхностным рецепторам лимфоцитов СD3+, CD4+,CD8+, CD69+, CD25+, меченные FITC, РЕ, APC, PerCP (Becton Dickinson, США).
Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ключевых генов цитокинов (AZIN1 (A/G), IFN (С/G), MxA (G/T), TLR4(C/T), TRPM5 (C/T), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), IL-10 (1082А/G, 592C/A)) и IL 28b (rs8099917, rs12979860) проводили с использованием наборов для определения полиморфизмов генов цитокинов («Литех», Москва) и «ИммуноГенетика IL28B» (ДНК-Технология, Москва) методом полимеразной цепной реакции с электрофорезной детекцией и детекцией в режиме «реального времени» на приборе IQCycler (BioRad) соответственно.
Определение вирусной нагрузки, выявление и дифференциация генотипов вируса гепатита С проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией на приборе IQCycler (BioRad) с использованием набора реагентов «АмплиСенс ВИЧ-Монитор-FRT», «АмплиСенс HCV-Монитор-FRT», «АмплиСенс HCV-генотип-FL».
Определение активности АлАт (АсАт) выполнялось на полуавтоматическом биохимическом анализаторе HUMALYZER 2000 (HUMAN, Германия) кинетическим методом согласно рекомендациям IFCC (Международная Федерация по Клинической Химии).
Статистический анализ
Для статистической обработки результатов использовались компьютерные программы Microsoft Excel 2007, Statsoft Statistica 8.0.
Количественные данные, подчиняющиеся закону нормального распределения, описывались с помощью средней арифметической величины и стандартного отклонения (M±). Если распределение данных отличалось от нормального, они описывались значением медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q1, Q3). Качественные величины описывались частотой встречаемости (%). Для анализа параметрических выборок с нормальным распределением использовался t-критерий Стьюдента, а для непараметрических использовался U-критерий Манна-Уитни [Кобзарь А. И.,2006, Реброва О. Ю.,2002]. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Оценка относительного риска и доверительных интервалов рассчитывались по Вульфу в программе Statsoft Statistica 8.0.
