Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Некоторые аспекты взаимодействия ВИЧ с иммунной системой человека 14
1.1 Характеристика ВИЧ 17
1.2 Патогенез ВИЧ-инфекции 20
1.3. Взаимодействие ВИЧ с клетками иммунной системы 25
1.4. Роль у8-Т-клеток 36
1.5. Проточная цитометрия при исследовании иммунного статуса у ВИЧ-инфицированных лиц 45
1.6. Определение вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц методом полимеразной цепной реакции с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (Real-time PCR) 48
Глава 2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Иммунологические методы исследования 59
2.2. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 65
2.3. Статистические методы исследования 67
Глава 3. Сравнительный анализ показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня Т-хелперов (CD3+4+) 69
3.1. Анализ показателей лейкограммы у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня CD3+4+ л имфоцитов 71
3.2. Анализ показателей иммунофенотипирования лимфоцитов и уровня вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня CD3+4+ лимфоцитов 71
Глава 4. Сравнительный анализ показателей иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от вирусной нагрузки 77
4.1. Анализ показателей лейкограммы у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки 78
4.2. Анализ показателей иммунофенотипирования лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки 79
Глава 5. Анализ взаимодействий между показателями Т-лимфоцитарного звена иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц 85
5.1. Анализ взаимодействий между показателями Т-лимфоцитарного звена иммунной системы среди всех обследованных ВИЧ-инфицированных лиц 85
5.2. Анализ взаимодействий между показателями Т-лимфоцитарного звена иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки 92
Заключение 108
Выводы 121
Практические рекомендации 123
Список литературы 124
- Проточная цитометрия при исследовании иммунного статуса у ВИЧ-инфицированных лиц
- Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
- Анализ показателей иммунофенотипирования лимфоцитов и уровня вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня CD3+4+ лимфоцитов
- Анализ показателей иммунофенотипирования лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки
Введение к работе
Актуальность проблемы
yS-T-лимфоциты впервые были описаны Brenner М. et al. (1986) как гетерогенная субпопуляция Т-клеток с Т-клеточным рецептором, состоящим из у- и 8-цепей (ySTcR) (Kuziel W.A. et al., 1987; Bucy P., et al. 1988; Hein W.R., Mackay C.R., 1991). У людей и многих животных большинство Т-клеток экспрессируют Т-клеточный рецептор, состоящий из а- и Р-цепей, и лишь небольшое количество Т-клеток несет Т-клеточный рецептор с у- и 8-цепями. В отличие от ар-Т-клеток, у8-Т-клетки напрямую распознают белковые и небелковые фосфолиганды без участия главного комплекса гистосовместимости. у8-Т-клетки участвуют в антимикробном иммунитете и обладают эффекторными функциями.
Роль у5-Т-клеток в иммунных процессах при различных заболеваниях и их взаимодействие с другими клетками организма до сих пор остаются до конца невыясненными. Но уже накопилось достаточно информации, которая доказывает необходимость существования подобной популяции клеток (Caccamo N., 2006; Girardi М., 2006; Kastuta М., 2006). Количественное содержание уб-Т-клеток в организме невелико и варьирует в зависимости от локализации. у8-Т-клетки редко обнаруживаются в селезенке, пейеровых бляшках и паренхиме лимфатических узлов и широко распространены среди клеток периферической крови и афферентных и эфферентных лимфатических сосудах. у8-Т-клетки являются главной популяцией Т-клеток в эпителии нелимфоидных тканей, включая кожу, кишечник, легкие, язык и органы репродуктивной системы. Их популяция в тимусе и периферической крови взрослого человека составляет всего 1—5% или 5—10% от всех Т-лимфоцитов, а 90—95% Т-клеток крови представляют собой ар-Т-
клетки (Itohara S. et al., 1990). Известно, что yS-T-лимфоциты вовлечены в механизмы местной иммунной защиты при ВИЧ- и цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции и при определенных бактериальных инфекциях, включая Лайм-боррелиоз (Dechanet J. et al., 1999). Так же оказалось, что у5-Т-клетки оказывают цитотоксическое действие с участием механизмов апоптоза (Pawelec G. et al., 1989; Boullier S. et al. 1997). Предполагается, что цитотоксическая активность у8-Т-клеток может быть стимулирована внутриклеточными патогенами, некоторыми бактериями и простейшими, включая М. tuberculosis, Y. enterocolitica, Т. gondii, а также некоторыми вирусами (вирус простого герпеса, вирус Эпштейна—Барр, вирус иммунодефицита человека).
Существенную роль у8-Т-клетки играют в противоинфекционном иммунитете. Высказано предположение, что они создают первую линию защиты в очаге бактериальной инфекции, сдерживая ее распространение до развития иммунного ответа, основанного на распознавании антигена оф-Т-клеток в комплексе с молекулами HLA, так как у5-Т-клетки распознают антигены без предварительного процессирования и участия молекул HLA комплекса, в отличие от сф-Т-лимфоцитов (Kozbor D. et al., 1989; Hayday A.C., 2000). Дальнейшие исследования выявили, что у8-Т-клетки высокочувствительны к фосфоантигенам (пирофосфатам и фосфомоноэстерам, конъюгированным нуклеотидным остаткам), которые могут продуцировать микобактерии, грамотрицательные, грамположительные кокки, токсоплазма и некоторые растения (Schoel В. et al., 1994; Fournie J.J., Bonneville M., 1996; Poquet Y. et al., 1998). Кроме того, у5-Т-клетки могут распознавать поверхностные антигены на определенных опухолевых клетках, таких как клетки лимфомы Беркитта.
Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу того, что для более полной характеристики Т-клеток пациента анализ следует
проводить не только по таким специфическим и безусловно важным при
ВИЧ-инфекции маркерам как CD3+, CD3+4+ и CD3+8+, но и по
наличию субпопуляций сф-Т-клеток и yS-T-клеток. Важность
определения последних очевидна при ВИЧ-инфекции,
сопровождающейся длительной персистенцией антигена в организме на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной системы, для уточнения стадии заболевания, контроля эффективности проводимой антиретровирусной терапии, прогноза развития и течения заболевания.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось изучение характера изменений как зависимого, так и независимого от главного комплекса гистосовместимости (МНС) Т-лимфоцитарного иммунного ответа у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня содержания в крови Т-хелперов (CD3+4+) и вирусной нагрузки (ВН) на организм.
Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
Изучить изменения состояния Т-лимфоцитарного звена иммунитета у больных ВИЧ-инфекцией в зависимости от уровня содержания в крови Т-хелперов и вирусной нагрузки.
Оценить реакцию субпопуляций Т-лимфоцитов, несущих TcR а|3 и уб, на изменение вирусной нагрузки и уровня Т-хелперов.
Оценить взаимосвязь между основными показателями Т-лимфоцитарного звена иммунитета в зависимости от уровня антигенной нагрузки на организм.
Положения, выносимые на защиту
У ВИЧ-инфицированных лиц при различной степени вирусемии выявляются изменения параметров лимфоцитов, более выраженные у пациентов с высокой вирусной нагрузкой (более 100000 копий/мл), заключающиеся в падении общего числа Т-лимфоцитов, внутри популяции которых наблюдается снижение относительного уровня Т-хелперов и повышение относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, сопровождающееся снижением соотношения CD3+4+/CD3+8+, а также падение относительного и абсолютного числа клеток двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов.
У ВИЧ-инфицированных пациентов при снижении в крови уровня Т-хелперов наблюдается снижение абсолютного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов и абсолютного количества двойной позитивной субпопуляции Т-лимфоцитов.
У ВИЧ-инфицированных лиц при снижении содержания в крови Т-хелперов и повышении вирусной нагрузки наблюдается падение абсолютных чисел Т-лимфоцитов, несущих как еф-, так и уб-TcR.
У ВИЧ-инфицированных пациентов формируются положительные корреляционные взаимосвязи между абсолютным количеством уб-Т-лимфоцитов и абсолютными уровнями Т-лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов и популяции двойных негативных Т-лимфоцитов. При высокой вирусной нагрузке (более 100000 копий/мл) у ВИЧ-инфицированных лиц формируется обратная корреляционная связь абсолютного уровня уб-Т-лимфоцитов с уровнем виремии.
Научная новизна
Впервые изучено состояние Т-лимфоцитарного звена иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц с определением характера
изменений внутри субпопуляции Т-лимфоцитов в зависимости от наличия сф- или y8-TcR. Определен характер изменений среди двойных негативных и позитивных субпопуляций Т-лимфоцитов в зависимости от уровня антигенной (вирусной) нагрузки на организм. Это позволило выяснить особенности реакции лимфоцитов на массированную антигенную атаку на организм и выявить значимость этих нарушений в формировании данной патологии. Помимо этого, изучено изменение данных показателей в зависимости от уровня содержания в крови ВИЧ-инфицированных Т-хелперов, как основных клеток-мишеней вируса иммунодефицита человека и важного критерия прогрессирования заболевания.
Впервые показано, что в ответ на рост антигенной нагрузки не происходит пролиферативной активности уб-Т-лимфоцитов, а, напротив, наблюдается их угнетение наряду с другими субпопуляциями Т-лимфоцитов, что ведет к истощению иммунной реактивности организма и, соответственно, прогрессированию заболевания.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о характере иммунологических нарушений внутри Т-лимфоцитарного звена иммунитета у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня Т-хелперов и ВН.
Выявленные нарушения внутри популяции Т-лимфоцитов, как основных клеток-мишеней при ВИЧ-инфекции, и оценка их патогенетического значения, позволят в дальнейшем более четко прогнозировать прогрессирование заболевания и оценивать эффективность проводимой антиретровирусной терапии в зависимости от уровня содержания Т-хелперов в крови, а также от антигенной
нагрузки, от количества у5-Т клеток, двойной негативной и двойной позитивной субпопуляций Т-лимфоцитов как свидетелей дезорганизации работы иммунной системы при ВИЧ-инфекции.
Апробация работы
Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г. Санкт-Петербург, 2008), I научно-практической конференции «Оптимизация высшего медицинского и фармацевтического образования: менеджмент качества и инноваций» (г. Челябинск, 2010), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология — практическому здравоохранению» (г. Москва, 2010), II Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 2010).
Апробация диссертации была проведена на совместном заседании НИИ иммунологии, кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики, кафедры иммунологии и аллергологии, ЦНИЛ ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в научных журналах и изданиях, определенных ВАК.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Указатель литературы включает 141 источника, из них 25 отечественных и 116 иностранных. Иллюстрации представлены 22 таблицами и 5 рисунками.
Проточная цитометрия при исследовании иммунного статуса у ВИЧ-инфицированных лиц
Проточная цитометрия как современная технология быстрого измерения характеристик клеток появилась в результате естественного развития традиционных гистохимических и цитохимических методов анализа, направленных в сторону их автоматизации. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностики, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д. (Полетаев А.И., 1989; Зуева Е.Е., 2003; Хайдуков СВ., ЗурочкаА.В., 2008)
Проточная цитометрия базируется на арсенале цитохимических флуоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток, их антигенов и внутриклеточных процессов. От классической цитохимии проточную цитометрию отличает высокая производительность. Исследуются выборки от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую достоверность результатов. В свою очередь от классической биохимии и молекулярной биологии современную цитометрию отличает возможность анализировать не усредненные молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные параметры для каждой клетки (Sack U. et al., 2006).
Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики: -во-первых, этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу, а при использовании ДНК-цитометрии (Шмаров Д.А., Козинец Г.И., 2004) и генотипу входящих в них клеток. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитометрии связано в первую очередь именно с анализами такого рода (Луговская С.А. и др.,2005). во-вторых, это способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10"J - 10" , что возможно благодаря его огромной производительности (Di Nicola М. et al., 1993; Luider J. et al., 2004). Так, современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 10000 клеток в секунду (Shapiro Н.М., 1995).
Основной принцип проточной цитометрии: через проточную ячейку движется постоянный ток изотонического раствора под определенным давлением, который называется «обжимающим». Внутри проточной ячейки находится зонд, с которого подается образец, содержащий клетки. Условия подобраны таким образом, что за счет разницы давления в зонде и «обжимающей» жидкости происходит гидродинамическое фокусирование струи в струе, и клетки за счет этого выстраиваются друг за другом. В определенном месте клетки пересекают луч света, и здесь происходит считывание информации (Shapiro Н.М., 1995).
С помощью проточной цитометрии можно измерять следующие параметры: во-первых, это рассеяние света под малыми углами (1-10 ). Этот параметр используется при измерении размеров клеток. Во-вторых, измерение рассеяния света под углом 90. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднородности или гранулярности цитоплазмы. И, наконец, третий параметр - это измерение интенсивности флюоресценции изучаемого объекта. Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволяет судить о морфологических характеристиках клеток, что приводит к возможности типирования клеток без применения флюоресцентных красителей, что особенно ценно при работе с периферической кровью.
В диагностике и прогнозировании заболеваний, обусловленных иммунодефицитом, в частности при ВИЧ-инфекции, чрезвычайно важное значение имеет определение точных относительных и абсолютных концентраций Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD3+CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+) для уточнения стадии заболевания и принятия решения о назначении пациенту терапии. Это исследование проводится с помощью проточной цитометрии одно-платформенным методом, при котором подсчет абсолютных значений осуществляется непосредственно на цитометре (Зурочка А.В., Хайдуков СВ., 2007). Данный подход устраняет необходимость гематологического анализатора для подсчета абсолютного количества клеток и позволяет увеличить сроки хранения образцов до 72ч, значительно уменьшает внутрилабораторную и межлабораторную вариабельность абсолютных показателей CD3+, CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток. В настоящее время 3-хцветный анализ с гейтированием по CD45+ (моноклональные антитела к панлейкоцитарному маркеру) и одно-платформенным методом является стандартной методикой для исследования иммунного статуса у ВИЧ-инфицированных больных. В клеточную суспензию, подготовленную к анализу, добавляется суспензия специальных частиц Flow Count, которые по показателям флуоресценции сильно отличаются от клеток. Концентрация этих частиц заранее известна. Проводится счет клеток и частиц Flow Count в полученной суспензии. Этот счет завершается, когда через проточную кювету прошел определенный объем жидкости и в этом объеме насчитано определенное количество частиц. Исходя из известного количества клеток интересующей нас субпопуляции в том же объеме, подсчитывается концентрация клеток этой субпопуляции.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
Определение вирусной нагрузки проводилось методом полимеразной цепной реакции на автоматизированной системе для анализа нуклеиновых кислот Abbott m2000rt, позволяющей осуществлять флуоресцентную детекцию результатов в реальном времени, имеющим 5 каналов детекции, автоматическую обработку данных и многоуровневый контроль качества результатов. Для проведения исследования по определению вирусной нагрузки ВИЧ была использована плазма крови. Цельная кровь в количестве не менее 5 мл собиралась в одноразовую пробирку с K3EDTA (1,5+0,15 мг на 1 мл крови). После взятия пробирка с кровью перемешивалась переворачиванием 3-4 раза и хранилась при температуре +2 - 8 С не более 6 часов. Плазма крови была отобрана не позднее 6 часов после взятия крови. Для этого пробирка с цельной кровью центрифугировалась при 800-1600g в течение 20 минут. Пробоподготовка осуществлялась с использованием системы ABBOTT Tm ТМ Sample Preparation и включала несколько этапов. 1. Лизис - вносили в каждую пробирку с исследуемым материалом по 100 мкл реагента mMicroparticles, 2,4 мл буфера mLysis, перемешивали и помещали в термостат на 20 минут при температуре 50С. Далее удаляли лизат. 2. Промывка — в каждую пробирку добавляли 700 мкл буфера mWashl и ресуспендировали. Помещали пробирки в магнитный штатив на 1 минуту. Удаляли из пробирок жидкость. Повторяли процедуру отмывки 3 раза. 3. Элюция - в каждую пробирку добавляли 25 мкл буфера mElutoin и ресуспендировали. Помещали пробирки в термостат на 20 минут при температуре 75С. Добавляли в каждую пробирку 63 мкл буфера mWash2, ресуспендировали и помещали в магнитный штатив на 1 минуту. Собирали элюат и помещали в чистую пробирку. Интерпретация результатов. Результаты интерпретировались на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла "Ct" в соответствующей графе в таблице результатов. В процессе Realime PCR необходима постановка ДНК-калибраторов ВИЧ и ВКО для построения калибровочной кривой, с помощью которой осуществляется расчет концентрации ДНК ВИЧ и ВКО в исследуемых образцах. Построение калибровочной кривой и расчеты концентрации ДНК осуществлялись с использованием программного обеспечения используемого прибора. Результаты исследований обрабатывались на ПК под управлением операционной системы Windows ХР с применением пакета прикладных программ "Statistica for Windows 6.0" (Боровиков В., 2003).
Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами, с определением средней арифметической вариационного ряда (М) и ошибки средней арифметической (т) Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде М±т, где М - средняя арифметическая, m - стандартная ошибка средней.
Объем выборок был недостаточен для применения любого из параметрических способов анализа, поэтому мы воспользовались непараметрическим аналогом. Согласно литературным данным (Гланц С, 1999г.), при применении непараметрических критериев при нормальном распределении их чувствительность составляет примерно 95% от чувствительности их параметрических аналогов, и непараметрические критерии дают больше шансов выявить реально существующие различия. Достоверность отличия оценивалась по U -критерию Mann-Whitney, статистически значимыми считались изменения при р 0,05.
Корреляционный анализ был выполнен в рамках программы «STATISTICA for Windows 6.0.» с использованием модуля «Nonparametrics. Correlations Spearman» («Непараметрические. Корреляции Спирмена»). Для выделения статистически достоверных коэффициентов корреляции принят уровень значимости р 0,05. Представленные цифровые данные были округлены до второго десятичного знака.
Анализ показателей иммунофенотипирования лимфоцитов и уровня вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня CD3+4+ лимфоцитов
При анализе популяций лимфоцитов методом иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии (данные представлены в таблице 3.2.) нами выявлено значительное статистически значимое снижение общего уровня Т-лимфоцитов при
Наблюдается рост относительного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+8+), что обусловливает резкое снижение соотношения CD3+4+/CD3+8+. Но при этом мы выявили снижение абсолютного числа CD3+CD8+ лимфоцитов в группах с уровнем CD3+4+ от 200 до 499 клеток/мл и CD3+4+ менее 200 клеток/мл, что сопровождает снижение общего числа Т-лимфоцитов. Со стороны двойной позитивной субпопуляции Т-лимфоцитов в исследуемых группах прослеживается снижение абсолютного их числа по сравнению с группой лиц с уровнем CD3+4+ более 500 клеток/мл, при этом наблюдается относительный рост уровня двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов, отмечаемый во всех сравниваемых группах.
Таким образом, мы наблюдаем, что во всех исследуемых группах снижение уровня Т-хелперов сопровождается падением абсолютного уровня общего числа Т-лимфоцитов, абсолютного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, повышением относительного количества CD3+8+, как следствие падением соотношения CD3+4+/CD3+8+, снижением абсолютного уровня двойной позитивной субпопуляции, т.е. истощением всех субпопуляций Т-лимфоцитов, коррелирующим со стадией заболевания.
Внутри популяционного состава Т-лимфоцитов прослеживается перераспределение клеток за счет падения относительного уровня Т-хелперов и повышения относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов и двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов. Отсутствие снижения двойной негативной популяции Т-лимфоцитов объясняется CD4ponHocTbio вируса иммунодефицита человека.
Так как популяция Т-лимфоцитов характеризуется такими двумя вариантами в зависимости от вида TcR, как а(3- и у5-Т клетки, мы более подробно изучили их в зависимости от изменений уровня Т-хелперов.
При анализе ар1- и уб-Т-клеток (данные представлены в таблице 3.3.) мы выявили статистически значимое снижение во всех группах относительного и абсолютного уровня аР-Т-лимфоцитов, что связано также с падением общего числа Т-лимфоцитов и значительное снижение абсолютного уровня у8-Т-клеток в группах с уровнем CD3+4+ 200-499 клеток/мкл и CD3+4+ менее 200 клеток/мкл по сравнению с группой лиц с уровнем CD3+4+ более 500 клеток/мкл. При этом мы наблюдаем рост уровня ВН, коррелирующий со снижением уровня Т-хелперов (CD3+4+). Все это также указывает на истощение резервов иммунной системы в ответ на длительно персистирующий в организме вирус.
Таким образом, при падении уровня Т-хелперов в периферической крови наблюдается снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов, абсолютного числа моноцитов, снижение относительного и абсолютного уровней общих Т-лимфоцитов (CD3+19-), абсолютных количеств лимфоцитов с фенотипом CD3+8+, CD3+4+8+, что в конечном итоге приводит к росту количества пациентов с более тяжелыми стадиями заболевания.
Исходя из современного понимания того, что ведущим определяющим фактором в специфике иммунного ответа является антиген, нами была поставлена задача изучить изменения параметров иммунной системы у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки, чему и посвящена следующая глава нашего исследования.
Анализ показателей иммунофенотипирования лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц в зависимости от уровня вирусной нагрузки
При оценке иммунофенотипирования лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с ВН менее 100000 копий/мл, по сравнению с контрольной группой с ВН менее 150 копий/мл (данные представлены в таблице 4.2.), мы выявили достоверное повышение абсолютного числа Т-лимфоцитов (CD3+19-), за счет повышения абсолютного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+8+), что свидетельствует об активной ответной реакции иммунной системы на рост антигенной нагрузки. Помимо этого, нами установлено достоверно значимое снижение относительного числа клеток двойной негативной субпопуляции лимфоцитов (CD3+4-8-).
В группе лиц с ВН более 100000 копий/мл в сравнении с контрольной группой, наоборот, прослеживается падение абсолютного числа Т-лимфоцитов. Помимо этого, внутри популяции наблюдаются значительные изменения, а именно: двукратное падение относительного и абсолютного содержания Т-хелперов (CD3+4+) при одновременном повышении относительного уровня цитотоксических лимфоцитов (CD3+8+), что обусловило резкое падение коэффициента CD3+4+/CD3+8+ по сравнению как с пациентами контрольной группы, так и с ВИЧ-инфицированными лицами с ВН менее 100000 копий/мл (что коррелирует с данными Gougeon MX. et al., 1996; Покровского B.B. и др.,1999; Chouquet С. et al., 2002). Однако, при этом абсолютное число цитотоксических лимфоцитов (CD3+8+) достоверно ниже, чем у пациентов с ВН менее 100000 копий/мл, но не отличается от пациентов в группе контроля, что свидетельствует об истощении иммунологической реактивности организма при значительной антигенной нагрузке.
Со стороны двойной негативной субпопуляции лимфоцитов прослеживается падение как относительного, так и абсолютного уровней, причем последний снижается практически в два раза как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой пациентов с ВН менее 100000 копий/мл.
Таким образом, при иммунофенотипировании лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с различной ВН мы выявили некоторые изменения параметров лимфоцитов, более выраженные у пациентов с высокой ВН. С повышением ВН прослеживается четкая тенденция к снижению абсолютного и относительного числа Т-хелперов и повышению относительного уровня цитотоксических лимфоцитов (CD3+8+), за счет чего происходит более чем двукратное снижение соотношения CD3+4+/CD3+8+, что свидетельствует о формировании дисбаланса клеток иммунной системы с истощением функциональных резервов Т-хелперов при массивной антигенной атаке. Помимо этого, выявлено повышение абсолютного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов в группе лиц с ВН менее 100000 копий/мл при снижении абсолютного числа их в группе с высокой ВН по сравнению с пациентами с антигенной нагрузкой менее 100000 копий/мл. Также мы выявили, что с повышением ВН происходит падение относительного и абсолютного числа клеток двойной негативной субпопуляции Т-лимфоцитов.
С целью более полной характеристики Т-звена мы провели анализ сф- и уб-Т клеток (данные представлены в таблице 4.3.).
При этом выявилось снижение абсолютного уровня а(3-Т-лимфоцитов в группе лиц с высокой ВН (более 100000 копий/мл) как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой лиц с ВН менее 100000 копий/мл за счет падении общего чиста Т-лимфоцитов, а также достоверно значимое снижение относительного и абсолютного уровня у5-Т клеток при высокой ВН, причем абсолютное число их падает практически в два раза. Отсутствие изменений количества сф- и у5-Т-лимфоцитов при ВН менее 100000 копий/мл можно расценивать как один из механизмов развития ВИЧ-инфекции, когда отсутствует потребность в низкодифференцированных лимфоцитах и не накапливаются вирус-специфические Т-лимфоциты.
Таким образом, при повышении вирусной нагрузки наблюдается: снижение абсолютных уровней гранулоцитов и лимфоцитов, падение абсолютного количества общих Т-лимфоцитов (CD3+19-), относительного и абсолютного уровней Т-хелперов (CD3+4+), абсолютного числа цитотоксических лимфоцитов (CD3+8+), снижение соотношения CD3+4+/CD3+8+, относительного и абсолютного чисел двойной негативной популяции лимфоцитов (CD3+4-8-), абсолютных количеств а(3- и уб-субпопуляций Т-лимфоцитов. Это влечет за собой прогрессирование иммунной недостаточности по всем субпопуляциям Т-звена, проявляющейся снижением силы иммунного ответа вплоть до его полного отсутствия против целого ряда микроорганизмов, и развитию более тяжелых стадий ВИЧ-инфекции и приводит у ВИЧ-инфицированных к развитию оппортунистических инфекций.
Для оценки взаимосвязи между основными показателями Т-лимфоцитарного звена иммунной системы в зависимости от уровня ВН на следующем этапе исследования мы применили корреляционный анализ.
