Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. Современная модель патогенеза ревматоидного артрита и ее место в клинической практике 10
1.1.Иммуногенетические основы предрасположенности к развитию ревматоидного артрита: состояние проблемы 11
1.2.Феномен молекулярной мимикрии и его место в патогенезе ревматоидного артрита. 12
1.3. Особенности гуморального звена иммунитета и его место в формировании картины аутоиммунного синдрома у больных ревматоидным артритом 13
1.4.Цитокины и их роль в патогенезе ревматоидного артрита 17
1.5.Особенности клеточного звена иммунитета и его место в формировании картины аутоиммунного синдрома у больных ревматоидным артритом 23
1.6. Механизмы апоптоза и их значение для патогенеза ревматоидного артрита. 30
1.7. Особенности современной модели иммунопатогенеза ревматоидного артрита и ее значение для клинической практики 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Клиническая характеристика обследованных больных 35
2.2.О6ъем и характеристика материала лабораторного исследования 45
2.3.Сывороточные концентрации антигенов и антител 46
2.4. Сывороточные концентрации иммуноглобулинов 46
2.5. Количественное определение циркулируюпщх иммунных комплексов в периферической крови 46
2.6.Количественное определение сывороточных криоглобулинов 46
2.7.Исследование субпопуляционного состава клеток периферической крови 46
2.8.Исследование содержания в крови Thl- и ТЬ2-клеток и определение их функциональной активности 59
2.9.Исследование функциональной активности Т- и В-лимфоцитов 59
2.10. Общелабораторные и клинико-инструментальные исследования 60
ГЛАВА 3.Результаты собственных исследований 61
3.1. Серологическая характеристика больных ревматоидным артритом 61
3.2. Субпопуляционный спектр клеток крови у больных ревматоидным артритом 66
3.2.1.Субпопуляционный спектр клеток крови больных ревматоидным артритом, фенотип I и фенотип II 68
3.2.2.Субпопуляционный спектр клеток крови больных ревматоидным артритом, фенотип III 83
3.2.3.Субпопуляционный спектр клеток крови больных ревматоидным артритом, фенотип IV 88
3.3.Больные с 1М-РФ~-вариантом течения ревматоидного артрита 91
3.4.Наиболее значимые корреляции межкластерных взаимосвязей 92
Глава 4.Обсуждение результатов 93
Выводы 102
Практические рекомендации 104
Список литературы 105
- Особенности гуморального звена иммунитета и его место в формировании картины аутоиммунного синдрома у больных ревматоидным артритом
- Особенности современной модели иммунопатогенеза ревматоидного артрита и ее значение для клинической практики
- Клиническая характеристика обследованных больных
- Серологическая характеристика больных ревматоидным артритом
Введение к работе
В последние годы наблюдаются серьезные нарушения иммунной системы при самых разных заболеваниях, в том числе, аутоиммунной природы. Свидетельством этому является неуклонный рост числа больных с данной патологией и склонность к затяжному течению и хронизации. По статистическим данным ВОЗ [1999 год] системные аутоиммунные заболевания составили около трети от общего числа нозологии в клинике внутренних болезней. Большое социальное значение таких болезней, в том числе ревматоидного артрита, определяется не только их распространенностью, но и развитием у значительного числа больных стойкой нетрудоспособности [4,53]. Таким образом, ревматоидный артрит, относящийся, по классификации А. Ройта, к системным [органонеспе-цифическим] аутоиммунным заболеваниям, представляющий собой поражение суставов преимущественно воспалительного характера, может рассматриваться одной из наиболее информативных клинических и экспериментальных моделей системной аутоиммунной патологии.
Важнейшим фактором в развитии ревматоидного артрита считают клеточное звено иммунитета, а также систему межклеточных [кооперативных] взаимодействий, контролируемых как набором клеточных инструментов регуляции, так и факторами гуморальной природы [аутоантителами, сетью цитоки-нов и др.]. Так, например, активированные цитокинами СВ4+-лимфоциты [клетки-хелперы] стимулируют образование плазматических антителопродуци-рующих В-лимфоцитов, приобретающих в условиях аутоиммунной патологии функции «фабрики» по производству ревматоидных факторов.
В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании патогенеза ревматоидного артрита, а также в разработке современных технологий и средств иммунодиагностики, иммуномониторинга и иммунопрогнозирования, составивших, по мнению большинства исследователей, основу современных
б программ лечебно-реабилитационных и лечебно-профилактических мероприятий в клинике ревматоидного артрита [9,51,216].
Иммунокомпетентные клетки, в частности, играют при различных формах ревматоидного артрита значительную роль в развитии суставных и висцеральных [системных] поражений, определяя, в конечном счете, специфику дезорганизации и характер структурных перестроек в пораженных тканях. Так, важнейшую роль в патогенезе ревматоидного артрита играют аутореактивные Т-клетки, определяющие уровень и объем разрушений в тканях суставов, а ключевую функцию активации в отношении аутореактивных Т-клеток выполняет одна из двух субпопуляций Т-клеток-хелперов - ТЫ-лимфоциты. Следует подчеркнуть при этом, что способность аутореактивных Т-клеток к активации во многом определяет развитие аутоиммунных нарушений при ревматоидном артрите, причем одна из самых важных ролей в регуляции функциональной активности практически всех клеточных клонов, участвующих в формировании аутоиммунного ответа, принадлежит ранним активационным антигенам и антигенам дендритных клеток [ДК], определение которых имеет большое значение для оценки общей функциональной активности Т-лимфоцитов.
Из вышеперечисленного следует, что одним из наиболее перспективных подходов к изучению нарушений иммунорегуляпии при различных патологических состояниях у больных с ревматоидным артритом является исследование поверхностного фенотипа иммунорегуляторных и эффекторных клеток в периферической крови. В современной экспериментальной и клинической иммунологии важное место занимает анализ периферической крови с использованием моноклональных антител к различным антигенам лимфоцитов. В литературе имеются данные об участии в патогенезе ревматоидного артрита основных субпопуляций лимфоцитов: CD3+ [зрелые Т-лимфоциты], CD4+ [хелперно-индукторные Т-клетки], CD8+ [супрессорно-цитотоксические Т-лимфоциты], CD72+ [В-лимфоциты]. Однако, полученные в этих работах результаты проти-
воречивы, и, представляя несомненный научный интерес, пока не отражают состояния иммунной системы у этих больных.
В связи с этим серьезный фундаментальный и большой практический интерес представляет изучение, наряду с популяционным составом, поверхностной экспрессии антигенов лимфоцитов, свидетельствующей об активации иммунной системы. Высокая информативность и практическая ценность такого подхода уже была показана при ряде заболеваний: бронхиальной астме, рассеянном склерозе и других. Однако он практически не был использован при изучении состояния иммунной системы у больных с ревматоидным артритом.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является выявление патогенетически и диагностически значимых иммунофенотипических маркеров клеточных субпопуляций периферической крови, определяющих степень тяжести и прогноз у больных с различными клиническими вариантами течения ревматоидного артрита.
Задачи исследования
Изучить особенности субпопуляционного спектра клеток крови при различных клинических вариантах течения ревматоидного артрита.
Исследовать характер ассоциативности и возможные корреляции между содержанием отдельных субпопуляций клеток [или клеточных кластеров] периферической крови и клиническими особенностями течения ревматоидного артрита.
3. Оценить патогенетическую и клинико-диагностическую значимость
выявленных корреляций у больных с различными вариантами течения ревма
тоидного артрита.
4. Разработать и внедрить в клиническую практику дополнительные кри
терии оценки прогнозирования и течения ревматоидного артрита.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное исследование субпопуляционной архитектоники клеток периферической крови у больных с различными вариантами течения ревматоидного артрита, по итогам которого внесены уточнения в некоторые звенья иммунопатогенеза ревматоидного артрита. Выявлена ассоциативная взаимосвязь между определенными наборами [кластерами] субпопуляций клеток крови и клиническими вариантами течения ревматоидного артрита.
Практическая значимость
Разработаны дополнительные иммунологические критерии диагностики и прогнозирования течения ревматоидного артрита и установлены субпопуляци-онные клеточные маркеры высокого риска развития внесуставных [висцеральных] форм патологии. Предложенные дополнения к существующей концепции иммунопатогенеза ревматоидного артрита позволят более точно выявлять пре-дикаторы неблагоприятных исходов заболевания для установления прогноза и дальнейшей тактики лечения. Определение субпопуляционной патоархитекто-ники крови у больных с ревматоидным артритом может служить дополнительным иммунологическим критерием, позволяющим уточнить степень активности, оценить тяжесть состояния и прогнозировать течение заболевания с риском развития висцеральных [внесуставных] форм синдромальной патологии. Результаты исследований могут быть использованы в практическом здравоохранении для диагностики и мониторинга больных с теми или иными вариантами течения ревматоидного артрита и найти широкое применение в общетерапевтической и клинико-иммунологической практике.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Риск прогрессирования ревматоидного артрита и формирования внесуставных [висцеральных] форм синдромальной патологии характеризуется появлением определенных субпопуляций клеток, определяющих в значительной степени особенности патогенеза и клиническую картину заболевания.
Впервые определены количественные параметры субпопуляционного спектра клеток крови у больных с различными клиническими вариантами течения ревматоидного артрита и установлена их взаимосвязь с конкретными формами иммунопатологии.
Установлена выраженная ассоциативная взаимосвязь как между определенными наборами [кластерами] субпопуляций клеток крови и клиническими вариантами течения ревматоидного артрита [клинико-кластерная ассоциативность], так и между кластерами или группами кластеров [межкластерная ассоциативность], что имеет не только патогенетическое значение, но и существенную клиническую ценность при ведении больных с ревматоидным артритом.
Апробация работы
Основные положения и выводы диссертации представлены и обсуждены на III Всемирном Конгрессе по «Клинической патологии и реабилитации в медицине» (Патайя, Таиланд, 4-11 февраля 2005г.), X Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2006» (Санкт-Петербург, май 2006г.), научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Волгоград-Москва, май 2006г.).
Положения и выводы диссертации доложены на межкафедральной конференции с участием кафедр Астраханской государственной медицинской академии и врачей ГКБ №3 г.Астрахани 18 января 2007г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 8 работ отечественных и 240 иностранных авторов. Объем работы 126 печатных страниц, включая 16 таблиц, 2 рисунка, 9 диаграмм, 3 клинических примера больных.
Особенности гуморального звена иммунитета и его место в формировании картины аутоиммунного синдрома у больных ревматоидным артритом
Особый интерес в патогенезе ревматоидного артрита представляет сеть водорастворимых иммуномедиаторов, относящаяся к гуморальному звену иммунитета - аутоантител, цитокинов, адгезионных молекул [адгезинов] и др., среди которых значительное место занимают аутоантитела, ряд ревматоидных факторов и циркулирующие иммунные комплексы [48,53,108,109,111 ].
С идентификацией в крови больных ревматоидного фактора и циркулирующих иммунных комплексов связаны первые указания на важную роль ауто-антител против компонентов синовиальных оболочек в индукции воспалительного процесса [5,6].
Синдром гиперактивации В-звена выражается в увеличении в крови числа большинства субпопуляций В-лимфоцитов, снижении их чувствительности к Т-супрессивным воздействиям, повышении экспрессии ряда рецепторов на поверхности В-лимфоцитов, увеличении спонтанной и индуцированной бласт-трансформации В-лимфоцитов, нарастании числа антителообразующих плазматических клеток и титров секретируемых этими клетками аутоантител, повышении количества циркулирующих иммунных комплексов и др.
Ревматоидный артрит относится к аутоиммунным заболеваниям, при которых аутоантитела направлены преимущественно к экстрацеллюлярным компонентам. При этом природа аутоантигенов, составляющих при ревматоидном артрите основную мишень для атаки со стороны соответствующих аутоантител и цитотоксических механизмов, до сих пор остается незвестным. По мнению Дорнера и Бурместера [53,62], антителопродуцирующие В-лимфоциты относятся к категории эффекторных инструментов весьма пристального интереса со стороны не только иммунологов, но и врачей-терапевтов. Лечебные схемы с использованием технологии элиминации из кровотока активных В-лимфоцитов приобретают все большее значение и составляют сегодня объект стратегического интереса как альтернативный подход к лечению ревматоидного артрита.
Одним из маркеров заболевания является ревматоидный фактор, который, будучи аутоантителом против гомологичных Fc-фрагментов IgG, может сам принадлежать к трем различным изотипам, а именно IgG, IgA и IgM. На основании серодиагностических критериев ревматоидный артрит с наличием или отсутствием в периферической крови IgM-РФ классифицируется как IgM-РФ серопозитивный или IgM-РФ-серонегативный. IgA-РФ, являясь критерием активности процесса, может также служить маркером ранних (доклинических) стадий ревматоидного артрита [7,53, 55,149,240].
Среди аутоантител при ревматоидном артрите доминируют: аутоантитела к антиперинуклеарному фактору, антикератиновые аутоантитела, антинейтро-фильные аутоантитела и др. В серопрогностическом отношении зарекомендовавшие себя как высоко информативные- частота выявления таких аутоантител коррелирует с тяжестью заболевания и скоростью прогрессирования ревматоидного артрита.
Аутоантитела к коллагену II типа, аннексину V, калпастатину и др. обнаруживаются, помимо ревматоидного артрита, при остеоартрозе и других ревматических заболеваниях [53, 55,149].
Среди предполагаемых аутоантигенов, способных участвовать у больных ревматоидным артритом в механизмах клеточной и антителоопосредованной цитотоксичности, наибольшее значение имеют коллаген П типа, протеоглика-ны, антигены хряща, белки теплового шока [хитшоковые протеины], другие компоненты суставов [115,117,118,163,211,233].
Аутоантитела при ревматоидном артрите могут быть следствием индукции со стороны эндогенного или мимикрирующего антигена и далее подвергаться процессу созревания с формированием более высоких порогов аффино-сти в отношении антигена-мишени посредством соматических мутаций и переключения изотипа. Среди механизмов, ведущих к появлению в кровотоке аутоантител с патогенными идиотинами, важную роль играют процессы химической модификации молекул аутоантигена непосредственно в очаге воспаления, что определяет возможность рождения неоэпитопов [антигенных детерминант с принципиально иной специфичностью], прошедших стадию посттрансляционного редактирования и приобретающих в этой связи свойства аутоантигенно-сти. Ярким примерам формирования аутоантигенов такого рода является появление в кровотоке больных ревматоидным артритом IgG-РФ, а также формиро 16 вание неоэпитопов за счет образования цитруллинированных или дезаминиро-ванных аргининовых остатков в структуре нативных белков, которые зарекомендовали себя с очень высокой степенью клинической информативности и надежности в лабораторной диагностике ревматоидного артрита [106,211,224,245].
В реализации механизмов гуморального иммунитета важнейшее место заняли и мембранные рецепторы типа FcyR, содействующие аутоиммунной атаке на сустав. При этом активация В-клетки обусловлена перекрестным связыванием антигена с поверхностным рецептором, результатом чего является активация киназ.
Важную роль в прогрессировании аутоиммунного процесса при ревматоидном артрите играют специфические аутоантитела IgG-изотипа, причем цито-токсическая активность сывороток в отношении мишеней определяется не только аффинностью и идиотипическим спектром аутоантител, но и соотношением в популяции таких аутоантител высоко- и низкоавидных фракций, когда высокоавидные антитела IgG-изотипа поливалентно связываются с эпитопами антигенов и ведут к реализации эффекторных функций антител.
Особенности современной модели иммунопатогенеза ревматоидного артрита и ее значение для клинической практики
Тщательный сравнительный анализ существующих на сегодняшний день гипотез ревматоидного артрита и глубокая оценка интегративных составляющих этих гипотез позволила предложить многостадийную современную модель патогенеза, предусматривающую интерференцию целого ряда функциональных механизмов иихотдельныхпетель [9, 33, 38, 51, 53, 61, 69, 99, 107, 198, 206, 208, 216,220,225,230,246].
Принципиальным для данной модели является доминирующее участие механизмов наследственного иммунитета на ранних и предранних стадиях развития ревматоидного артрита, когда активация таких механизмов [макрофаги, тучные клетки и др.] влечет за собой индукцию процессов воспаления в синовиальных оболочках суставов. На этом этапе в составе синовиальных оболочек пораженных суставов обнаруживаются агонисты toll-подобных рецепторов [протеогликаны, микробные ДНК и др.], что можно в перспективе отнести к иммуноморфологическим критериям ревматоидного артрита.
Альтернативным механизмом для предранних стадий ревматоидного артрита служит утилизация аутоантителами собственных Fc-рецепторов [например, в составе РФ или антицитруллиновых аутоантител] для реализации механизмов антителоопосредованной аутоагрессии [227]. В фазе прогрессирования заболевания механизмом, определяющим развитие аутоиммунного воспаления в суставе, является комбинация иммунодефицита и аутоиммунного синдрома, что проявляется в поражении функции NK-клеток, формировании дисбаланса цитокинов с одной стороны и Th- и Ts-клеток, с другой, в также в интенсивном образовании аутоантител.
При этом не исключено участие в патогенезе ревматоидного артрита механизмов иммунологического старения [immunological ageing or senescence], признаком чего является аккумуляция в синовиальных оболочках дефектных Т-клеток, позволяющих избегать контроля со стороны механизмов аутотоле-рантности [84].
Вместе с тем, случаи необъяснимой деструкции суставов и связочного аппарата в отсутствии клинических признаков синовиита позволяет предположить существование у таких больных особых форм ревматоидного артрита, протекающих по типу неопластической дегенерации ткани [203]. В пользу такой гипотезы свидетельствует тот факт, что синовиальные клетки от больных ревматоидным артритом способны пролиферировать in vitro в отсутствие какой-либо якорной подложки, не реагируя при этом ни на один сигнал контактного ингибирования роста и дифференцировки [96,169]. В доказательство гипотезы описан также феномен обратной дифференцировки синовиальных клеток под действием избыточной экспрессии ряда эмбриональных генов, в частности, онкогена \vnt5A, который способен усиливать секрецию ИЛ-15 в составе синовиальных клеток от больных ревматоидным артритом [202,203,234]. Более того, наблюдаемые при ревматоидном артрите функциональные дефекты в синовиальных клетках [т.н. микросателлитная нестабильность генома] могут быть связаны с соматическими мутациями в онкогенах, таких как, например, опухолевый супрессор р53, приводящих к экспрессии запредельных количеств ИЛ-6 и активации локального аутоиммунного воспаления [72,97,187,242].
Еще одним подтверждением вышеизложенного служит участие ангиоге-неза в увеличении объема и тканевой массы синовиальных оболочек, что характерно для неоплазий [234]. Не исключено, однако, что идентифицированные у больных ревматоидным артритом мутации в структуре регуляторных генов являются результатом заболевания, а не его первопричиной, хотя способны менять течение патологического процесса в ту или иную сторону. Для разработки в ближайшем будущем высокоэффективных технологий иммуногенодиагностики и иммуногенотерапии следует учитывать ряд ключевых факторов, определяющих патогенез ревматоидного артрита, а именно: [а] тип клеток, участвующих в развитии данной патологии (лимфоцит, макрофаг или синовиальная клетка микроокружения) и проявляющих дефекты апоптоза или пролиферации; [б] природа клеточного или тканевого дефекта [избыточная пролифера ция, дефектный апоптоз или нарушения клеточного цикла]; [в] участие регуляторных молекул-индукторов [про- и антивоспалитель ные воспалительные цитокины, FasL и др.], контролирующих экспрессию акти ваторных генов; [г] участие регуляторных молекул-ингибиторов или молекул трансдукторов пролиферации [семейство Bcl-2, NF-KB И др.], а также супрессо ров апоптоза. Таким образом, суммируя вышеизложенное, следует признать, что большинство диагностических тестов различной сложности не оказало пока существенного влияния на прогнозирование течения ревматоидного артрита. Это требует поиска и внедрения других, дополнительных методик, позволяющих заподозрить неблагоприятное течение заболевания с быстрым эрозированием суставов и появлением экстраартикулярных признаков. Проведение таким пациентам более подробных иммунологических тестов и последующее назначение лечебных и профилактических мероприятий позволит в некоторой мере улучшить прогноз и, как следствие этого, снизить уровень смертности вследствие этой патологии. Возможно, что внедрение методик прогнозирования течения и диагностики неблагоприятного варианта ревматоидного артрита как исследование субпопуляционного состава клеток периферической крови путем иммунофенотипирования, будет в какой-то мере способствовать этому.
Клиническая характеристика обследованных больных
В качестве тонирующих моноклональных антител были использованы моноклональные антитела фирм «Протеиновый контур", Coulter Clone [анти-CD14 Му-4], DAKO Cytomation [CD3, CD19, CD20, CD5, CD25, CD22, CDllc, CD23, CD38, CD21 [CR2] и др.] и Becton-Dickinson [anti-Leu-4 [CD3], anti-Leu-За [CD4], anti-Leu-2a [CD8],anti-Leu-llb [CD16], ami-Leu-12 [CD19], antiCRgd и др.], а также антитела, полученные от проф. А.Ю. Барышникова [РОНЦ РАМН] и доктора А.Н. Филатова [Институт иммунологии], зарегистрированные на международном рынке, и антитела, специально приготовленные в лаборатории Института микробиологии Калифорнийского университета [Сан-Франциско, США], например, CD86+19+, CD86+14+, CD158a+, CD158b+ и CD2+CD150, CD27+, CD28+, CD36+, CD37+, CD40+, CD44+, CD60+, CD62L+, CD63+, CD68+, CD69+, CD81+, CD82+, CD94+, CD95+. Часть образцов крови была помечена сложными комбинациями антител с трехцветной меткой: CD 14 (Му-4)/CD16 (Leu-1 lc)/CD4(Leu-3a); CD14/CD4/anti-HLA-DR; CD14/CD4/CD13 (Leu-M7), CD14/CD4/CDllb [Leu-15] и др. Anti-CD4 и анти-СБ8, используемые в отдельных исследованиях, были связаны с перидинхлорофилл протеином [PerCP], CD 14, CD45RO и CD45RA - с ФИТЦ, остальные - с ФЭ.
При анализе субпопуляционного состава NK-клеток поверхностные фенотипы анализировали с использованием многоцветной иммунофлюоресценции. Часть из таких типирующих антител, например, анти-Уа24 [клон С15] и анти-Vhll [клон С21], предназначенные для идентификации и подсчета NK клеток, получены от д-ра С. Порселли, д-ра Л.Метелитцы и д-ра Т.Элбейка [UCSF, СА, USA и Keck University, С A, USA]. Используемые антитела отличались низким уровнем неспецифического окрашивания и высокой разрешимостью [при достаточной плотности анализируемой популяции клеток определялось менее 0,01% детектируемых по двойной метке клеток].
Подсчет NK-клеток методом проточной цитометрии с использованием антител РЕ-6В11; свежевыделенные из периферической крови или замороженные при -95С мононуклеарные клетки инкубировали с 100% человеческой сывороткой в течение 12 мин. и окрашивали антителами РЕ-6В11 [BD Biosciences, США] и FITC-анти- РЕ-6В11 [Beckman-Coulter, США].
Далее подсчет клеток проводили на питометре с использованием гейтинга на субпопуляции лимфоцитов. 6В11-позитивные события среди общей популяции лимфоцитов отмечались как РЕ-6В11+ области [а], и их распределение среди других субпопуляций оценивалось с помощью реактивности на анти-СОЗ и анти- РЕ-6В11 антитела [б], используя цветовую модальность на трехмерной томограмме [программное обеспечение EXPOk 32, Beckman-Coulter, США].
Для контроля уровня неспецифического связывания антител использовали изотонические контроли иммуноглобулинов [Becton-Dickinson, США], меченные ФИТЦ, ФЭ и др. Из каждой пробы анализировали от 3500 до 5500 жизнеспособных клеток попадающих в соответствующий гейт, дискриминируемых по интенсивности свечения.
Определение СБ69+-маркера осуществляли с помощью набора "Fast-Immune" [Becton-Dickinson, США]; СБ34+-маркера - по методу A.Bohbot с со-авт. [1995] с использованием набора CEPRATE LC CD34 [CellPro, США] [30]; содержание дендритных клеток [ДК], NK-клеток [рис. 1] с учетом рекомендаций, изложенных в работах K.Willmann с соавт. [239], L.Metelitsa [147], T.Kanda с соавт. [101], T.Takamoto с соавт. [213], Барышникова А.Ю. [2] и K.Toba с соавт. [219].
В ходе цитометрии данные по прямому и боковому светорассеянию исследуемых клеток отражали на двумерных гистограммах, а именно, FSC/SSC [прямое/forward side scatter/FSC и угловое/side scatter/SSC] светорассеяние [рис.1]. Для сигнала по FSC и SSC использовали линейное усиление, с помощью которого сигналы флюоресценции усиливались до четырех [пяти] декадных логарифмических шкал.
Логическое ограничение лимфоцитарного гейта определялась по нижнему и верхнему значению лимфоцитарного пика на одномерной гистограмме и применялось к двумерным гистограммам. Моноцитарный гейт касался лимфоцитарного гейта с превышением значения SSC в 1,5 раза. Гранулоцитарный гейт касался моноцитарного гейта и распространялся вверх по оси SSC. Левая и правая границы моноцитарного и гранулоцитарного кластеров определены по соответствующим пикам на одномерных гистограммах.
При использовании одноцветного анализа с различными флюорохромами сигналы фотоумножителей FL1, FL2 и FL3 отражались на одномерных четырех декадных гистограммах. При использовании многоцветного анализа данные по каналам флюоресценции отражались на двумерных четырех декадных log/log гистограммах [FL1/FL2, FL2/FL3 и FL3/FL1]. Квадранты в этих гистограммах определяли две разделительные линии, фиксированные для всех измерений на 1/4 шкалы флюоресценции по абсциссе и ординате.
Гейтирование по лимфоцитам, моноцитам, гранулоцитам. Для анализа популяций с низкой клеточной плотностью также использовались линейно-логарифмированные гистограммы смешанного типа SSC/FL. Анализ полученных данных заключался в определении положения кластера клеток в многомерном пространстве в ходе выполнения исследований методом проточной цитометрии. При выявлении на двумерной гистограмме кластера событий, позитивного по двум и более маркерам, использование трехцветной метки позволяет получить четыре варианта экспрессии третьего маркера [рис.2].
При одновременном использовании трех антител получали до восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций, расположение которых в пространстве трех четырех декадных гистограмм [FL1/F12, F12/F13, F13/F11] было строго определено.
Серологическая характеристика больных ревматоидным артритом
На первом этапе работы все больные ревматоидным артритом в целях серологической верификации картины аутоиммунного синдрома и подтверждения наличия у пациента системного заболевания соединительной ткани аутоиммунной природы были обследованы на содержание в крови [см. Материалы и методы]: маркеров аутоиммунного воспаления - IgG-РФ и IgM-РФ, ЦРБ, иммуноглобулинов IgG-, IgM-, IgA- и IgE-изотипов, ЦИК, sCD14, неоптерина, OPG и SDF-1; анти-В7-Н1, анти-КАЗЗ, анти-ССР, анти-Col, анти-Col II, АЯА, АКА и анти-ДНК аутоантител, иллюстрирующих наличие у пациента серологических признаков системного заболевания соединительной ткани аутоиммунной природы. Результаты этих исследований, иллюстрирующие серологическую архитектонику периферической крови у больных с ревматоидным артритом, представлены в таблице 10. Как следует из данных таблицы 10, по популяции больных ревматоидным артритом характерными являлись повышенные, по сравнению с группой клинически здоровых доноров, уровни сывороточных IgG, IgM и IgA в среднем на 12-18%, тогда как титры IgE в подавляющем числе случаев колебаний не испытывали. Аналогичный подъем серологических показателей отмечен для ЦИК - их величины возрастали у больных на 22-32% по сравнению с группой клинически здоровых доноров. В соответствии с полученными данными были выделены 4 группы больных. Группа с иммунофенотипом I - это больные с выраженным аутоиммунным синдромом, охватывающим по глубине и спектру нарушений как эффекторные, так и регуляторные звенья иммунологической реактивности. В эту группу вошли больные с длительностью заболевания не менее двух лет. Активность: П ст.- 50 чел. (51%), III ст.- 48 чел. (49%). Быстро прогрессирующее течение- 58 чел. (60%). Серопозитивный вариант- 98 чел. (100%). R- стадия: I ст.-12 чел. (12%), П ст.- 53 чел. (54%), Ш ст.- 26 чел. (26%), IV ст.- 7 чел. (8%). Экстраартикулярные проявления у больных с иммунофенотипом I: ревматоидные узелки- 98 чел., анемия- 81 чел., кожный васкулит- 61 чел., кахексия- 41 чел., лихорадка- 27 чел., перикардит- 17 чел. Все больные имели сочетание нескольких экстраартикулярных проявлений. Группа с иммунофенотипом П - это больные с умеренно-выраженным аутоиммунным синдромом, затрагивающим, в основном, эффекторные звенья иммунитета. Длительность заболевания: 4-5 лет. Активность: I ст.- 7 чел. (11%), II ст.- 45 чел. (70%), III ст.- 12 чел. (19%). Быстро прогрессирующее течение- 23 чел. (36%). Медленно прогрессирующее течение- 41 чел. (64%).Серопозитивный вариант- 59 чел. (92%).Серонегативный вариант- 5 чел. (8%). R- стадия: I ст.-17 чел. (26%), II ст.- 20 чел. (31%), III ст.- 17 чел. (26%), IV ст.- 10 чел. (17%). Экстраартикулярные проявления у больных с иммунофенотипом II: ревматоидные узелки- 29 чел., анемия- 28 чел., лихорадка- 17 чел., перикардит - 6 чел., кожный васкулит - 4 чел., кахексия - 3 чел. Группа с иммунофенотипом Ш - это больные также с умеренно-выраженным аутоиммунным синдромом, но ассоциированным с вторичным иммунодефицитом - ВИД. Длительность заболевания: 6 -8 лет. Активность: I ст. -15 чел. (68%), II ст. - 7 чел. (32%). Серопозитивный вариант по РФ - 8 чел. (32%). Серонегативный вариант по РФ - 14 чел. (68%). R- стадия: I ст.- 4 чел. (18%), П ст.- 6 чел. (27%), Ш ст.- 5 чел. (23%), IV ст.- 7 чел. (32%). Экстраарти-кулярные проявления у больных с иммунофенотипом Ш: анемия-15 чел., лихорадка- 9 чел., вторичный амилоидоз - 7 чел., кахексия - 4 чел. Группа с иммунофенотипом IV - больные без признаков иммунопатологии. Длительность заболевания: 10 лет. Активность: I ст.- 16 чел. (100%). Серонегативный вариант по РФ- 16 чел. (100%). R- стадия: IV ст.- 16 чел. (100%). Внесу ставных проявлений нет. Тенденцию к росту также обнаружили среди целого ряда сывороточных маркеров аутоиммунного воспаления [РФ-IgG и РФ-IgM, sCD14, анти-В7-Н1 аутоантител, неоптерина, OPG, SDF-1], что коррелировало с присутствием у таких пациентов ЦРБ в концентрациях определенного, сопоставимого с сывороточным уровнем маркером аутоиммунного воспаления.
