Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .
1. Ширус папилломы человека (ВПЧ) 13
1.2 Папилломавирусная инфекция (ПВИ) 29
1.3 Рак шейки матки (РШМ) 42
1.4 Программы цервикального скрининга 49
ГЛАВА 2. Материалы и методы .
2.1 Общая характеристика проведенных исследований 54
2.2 Кольпоскопия расширенная 55
2.3 Цитологический метод исследования 64
2.4 Морфологическое исследование 69
2.5 Исследования на ДНК вируса папилломы человека высокого риска 70
ГЛАВА З. Результаты проведенных исследований .
3.1 Результаты молекулярно - биологического тестирования на наличие ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска 79
3.2 Результаты кольпоскопических исследований 83
3.3 Результаты цитологических исследований 97
3.4 Результаты морфологических исследований 103
ГЛАВА 4. Клинические аспекты алгоритмов диагностики .
4.1 Скрининговая функция ВПЧ - тестирования 106
4.2 Особенности папилломавирусной инфекции и концепция ВПЧ-тестирования 107
4.3 ВПЧ-тестирование и другие методы выявления предраковой патологии 109
4.4 Алгоритмы использования ВПЧ-тестов в диагностике предрака и рака шейки матки 111
4.5 Генотипирование ВПЧ 115
4.6 Требования к тестам, используемым для выявления ДНК ВПЧ высокого риска 116
4.7 Пациенты и вид клинического материала для исследования на ДНК вируса папилломы человека высокого риска 118
Заключение 119
Выводы 125
Практические рекомендации 126
Список литературы 127
- Папилломавирусная инфекция (ПВИ)
- Цитологический метод исследования
- Результаты цитологических исследований
- Алгоритмы использования ВПЧ-тестов в диагностике предрака и рака шейки матки
Введение к работе
Актуальность проблемы. За последнее десятилетие накоплен большой фактический материал по вопросу гистофизиологии и патологии шейки матки (Кондриков Н.И.,1997, Кулаков В.И.,2000). Особой сложностью ранней диагностики характеризуются онкопроцессы, связанные с папилломавирусной инфекцией гениталий (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения, цервикальная интраэпителиальная неоплазия) (Bosch Xavier,1995,Манухин И.Б.1998, Минкина Г.Н.2004).
В течение последнего десятилетия отмечается неуклонный рост частоты генитальных заболеваний, вызванных вирусами папилломы человека (Роговская С.И. 2000). Папилломавирусная инфекция гениталий трансмиссивное заболевание, передающееся половым путем. Ранее наиболее известными практическим врачам, проявлениями ВПЧ инфекции гениталий были остроконечные кондиломы аногенитальной области. Частота их выявления по данным министерства здравоохранения РФ составляла 20,3 случая на 100 тысяч женщин детородного возраста (Роговская С.И. Прилепская В.Н.2003). По данным ВОЗ, в 1999 году общее число случаев генитальной папилломавирусной инфекции составило 30 млн. человек, а за последние годы возросло в 10 раз. Установлена четкая связь между возникновением рака шейки матки (плоскоклеточная карцинома), вульвы, и персистенцией у женщин папилломавирусов высокого канцерогенного риска (Munoz N.et al.2003, Куевда Д.А., Шипулина О.Ю.2007). Доля рака шейки матки среди злокачественных опухолей репродуктивной системы составила 16,2 %, а в России ежегодно регистрируется 12,3 тысячи новых случаев рака шейки матки (Аксель Е.М., Давыдов М.И.2002).В 95% случаев выявления рака шейки матки у женщин детородного возраста регистрируется наличие папилломавирусов высокого канцерогенного риска (Прилепская В.Н.2004,Минкина Г.Н.2005). Характерной особенностью папилломавирусной инфекции гениталий является поражение лиц молодого возраста (Адаскевич В.П.,2001).За последние 10 лет средний возраст заболевших раком шейки матки снизился с 58 до 55лет, а у женщин до 29 лет заболеваемость возросла в 2 раза.
Вирусы папилломы человека относятся к широко распространенной и гетерогенной группе вирусов. Эпидемиологическими исследованиями последних лет показано, что к группе высокого риска принадлежат типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82. Типы 26, 53 и 66 относятся к категории предположительно высокого риска. К группе низкого риска принадлежат типы 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81. Остальные типы относятся к категории неустановленного риска и чаще всего не ассоциированы с развитием патологий (Munoz N. et al. 2003 Куевда Д.А., Шипулина О.Ю.2006).
Обращает на себя внимание так же тот факт, что инфицированность ВПЧ в 10 раз выше, чем частота клинических проявлений инфекции (Куевда Д.А.2006).
Развитие рака шейки матки не является молниеносным процессом. По данным ВОЗ переход тяжелой дисплазии в рак in situ длится в среднем 3 – 8 лет. Таким образом, врач располагает достаточным временем для обнаружения начальных форм поражения, вот почему проблема диагностики паплломавирусной инфекции остается одной из актуальных задач практической гинекологии. Однако поздняя диагностика, отсутствие скрининговых программ выявления этиологического фактора, приводит к неудовлетворительным результатам лечения патологических процессов шейки матки.
Цель исследования: Оценить значение метода полимеразной цепной реакции в ранней диагностике папилломавирусной инфекции гениталий, как основного этиопатогенетического фактора развития злокачественных новообразований шейки матки.
Задачи исследования:
1. Оценить диагностическую ценность метода полимеразной цепной реакции для раннего выявления папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста.
2. Определить чувствительность и специфичность метода полимеразной цепной реакции, для выявления ВПЧ высококанцерогенных типов, как основного этиопатогенетического фактора развития диспластических процессов и рака шейки матки.
3.Выявить частоту обнаружения папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста при использовании данного метода.
4.Установить преимущества и оценить эффективность метода полимеразной цепной реакции в рамках диагностического скрининга женского репродуктивного населения.
Научная новизна исследования.
Установлено, что использование метода ПЦР диагностики у женщин детородного возраста позволяет выявлять ВПЧ даже при отсутствии клинических признаков патологии шейки матки и существенно расширяет показания к проведению дополнительных методов обследования.
Доказано, что при проведении таких дополнительных методов исследования как кольпоскопия, цитология, биопсия, поводом к которым была положительная реакция на ДНК ВПЧ, удается выявлять предраковые процессы шейки матки на доклинических стадиях заболевания.
Установлено, что возможность селективной диагностики различных типов вирусов позволяет выявлять те из них, при которых вероятность возникновения тяжелых дисплазий и рака шейки матки наиболее высока.
В масштабах диспансерного обследования женщин детородного возраста методами скринингового отбора, включая результаты ПЦР диагностики с использованием тест – системы “АмплиСенс ВПЧ высокого риска” удается выявить патологические процессы шейки матки у значительно большего количества пациентов и применить современные методы лечение (криодеструктивные, лазерохирургические, радиохирургические) на ранних стадиях развития заболевания, включая доклинические формы.
Практическое значение работы.
Практическое внедрение метода ранней диагностики папилломавирусной инфекции гениталий дает возможность выявления этой патологии у женщин репродуктивного возраста на доклинических стадиях заболевания, и предупреждать развитие злокачественных процессов шейки матки.
Результаты работы существенно дополняют представления о клинических, кольпоскопических, цито и гистологических проявления ВПЧ инфекции гениталий.
Разработанный алгоритм обследования больших групп женщин детородного возраста с использованием скринингового подхода и формированием групп повышенного онкологического риска позволяет оптимизировать тактику лечения вирус положительных изменений шейки матки.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.По данным обследования женщин детородного возраста, с применением ПЦР диагностики, у 40% из них выявляются различные типы паплломавирусной инфекции, а у 93% из всех инфицированных выявлены типы вирусов высокого канцерогенного риска.
2.При последующем использовании клинических и лабораторных цитологических методов исследования изменения эндоцервикса под действием онкотропных вирусов удается обнаружить на стадиях вирусоносительства.
3.Комплексное лечение патологии шейки матки обусловленное папилломавирусной инфекцией на ранних стадиях заболевания позволяет предупредить переход легкой степени дисплазии шейки матки в тяжелую, и развитие рака шейки матки в дальнейшем.
Личное участие соискателя в разработке проблемы.
Автором лично было обследовано 130 женщин детородного возраста, включенных в исследование. В ходе сбора материала для диссертационной работы соискателем были освоены методики: кольпоскопия, цитологические исследования мазков методом Папаниколау и Лейшмана, этапы проведения ПЦР диагностики в условиях лабораторного комплекса.
Внедрение результатов в практику.
Результаты исследования внедрены в практику работы хирургического отделения городской больницы №40,НККДО ФГУН «Центрального НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, гинекологического отделения ФГУ “Поликлиники консультативно- диагностической” УДП РФ.
Апробация диссертации.
Основные материалы диссертации доложены на:
1.5 –ая Всероссийская Научно – практическая конференция “Генодиагностика инфекционных болезней” Москва 2004.
2.Научно – практическая конференция, посвященная 30 кафедры хирургических болезней № 1 с курсом оперативной хирургии и 25 – летию клинической базы (Москва МГМСУ и ГКБ№ 40).
3. 6 –ая Всероссийская Научно – практическая конференция с международным участием “Молекулярная диагностика” Москва 2007.
Публикации.
Основное содержание диссертационного исследования отражено в 5 печатных работах соискателя, перечень которых представлен в конце автореферата, в том числе 2 работы в журналах рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Объем и структура работы.
Папилломавирусная инфекция (ПВИ)
Папилломавирусная инфекция (ПВИ) может проявляться трех формах: клинической, субклинической и латентной [28,72 ,65].
Клиническая форма ПВИ проявляется у пациентов в виде симптомов видимых непосредственно, без привлечения дополнительных методов исследования. Проявлением клинической формы являются генитальные бородавки (кондиломы), а так же развившийся рак шейки матки [28,72 ,65]. Рак шейки матки считается одним из наиболее важных и социально значимых терминальных клинических проявлений папилломавирусной инфекции, потому в следующей главе данная патология будет рассмотрена более детально.
В настоящее время условно выделяют экзофитные и эндофитные формы кондилом, которые могут сочетаться между собой либо быть единичным проявлением инфекции.
Экзофитные формы ПВИ принято называть остроконечными кондиломами. Они представляют собой фиброэпителиальные образования на поверхности кожи и слизистых, с тонкой ножкой, реже - широким основанием в виде одиночного узелка или в форме множественных выростов, напоминающих цветную капусту или петушиные гребни. Их поверхность покрыта многослойным плоским эпителием, нередко с ороговением. В подлежащей соединительной ткани могут возникнуть явления воспаления, расстройства микроциркуляции и отеки, что способствует присоединению вторичной инфекции. Диагностика крупных кондилом, как правило, затруднений не вызывает. Кондиломы небольших размеров на вульве, влагалище и шейке матки нередко можно увидеть только с помощью кольпоскопа.
Генитальные кондиломы локализуются в основном в местах возможной мацерации: малые половые губы, влагалище, шейка матки, устье уретры, область ануса, кожные покровы. Исследования последних десятилетий свидетельствуют о том, что 85% пациенток с типичными ОК вульвы и промежности имеют дополнительные очаги ВПЧ-инфекции во влагалище или шейке матки и почти у каждой четвертой из них выявляют ассоциированные с нею заболевания - цервикальные внутриэпителиальные неоплазии различной степени тяжести. При этом наиболее уязвимой для ВПЧ является зона трансформации - место стыка многослойного и цилиндрического эпителия на шейке матки.
Проявления ПВИ могут быть представлены также гистологическими разновидностями эндофитных кондилом (плоских, инвертирующих и атипических) на шейке матки, которые еще носят название субклинических форм.
Субклиническая форма не сопровождается видимыми невооруженным глазом симптомами, но может быть выявлена при кольпоскопии, цитологическом или гистологическом исследовании ткани [63,72 ,66]. Морфологические изменения шейки матки, вызываемые ВПЧ, представляют собой спектр предраковых поражений, которые, в свою очередь, обозначаются как церви-кальная интраэпителиальная неоплазия (cervical intraepithelial neoplasia — CIN) или дисплазия, способная прогрессировать в плоскоклеточную карциному [28,67].
Классификация, предложенная Национальным институтом по изучению рака США (The Bethesda system, 1988 г., пересмотрена в 1991 г.), выделяет две категории плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (squamous intraepithelial lesions - SIL): низкой (low grade) и высокой (high grade) степени тяжести (соответственно L-SIL и H-SIL) [21]. Клеточные элементы, которые трудно поддаются классификации, именуются как атипические клетки плоского эпителия неопределенного значения (atypical squamous cell undetermined significance - ASCUS) [21]. Однако считать ASCUS поражением, занимающим место перед LSIL, т. е. ранним поражением ниже уровня дисплазии, является ошибочным. ASCUS является не биологической сущностью, а гетерогенной группой, включающей в себя как легкие атипии, так и карциномы [45,66].
Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени тяжести (L-SIL) объединяют цитологические изменения, указывающие на слабую дисплазию (CIN I) и ВПЧ-индуцированные морфологические изменения (койлоцитотическая атипия). Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степени тяжести (H-SIL) включают умеренную дисплазию (CIN II), тяжелую дисплазию и карциному in situ (CIN III). SIL высокой степени тяжести встречаются значительно более редко. Хотя SIL высокой степени тяжести более часто прогрессируют в рак по сравнению с SIL низкой степени тяжести, они могут спонтанно регрессировать [66].
Латентная форма не может быть диагностирована кольпоскопически, цитологически и гистологически. Однако присутствие ВПЧ в биоптатах шейки матки при латентной форме инфекции можно определить по наличию ДНК-вируса. Для этой цели чаще всего применяются методики на основе по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) или на основе гибридизации (HybridCapture). Эти методы так же позволяют определить генотип вируса, что имеет значение для прогноза дальнейшего развития заболевания [66].
Цитологический метод исследования
Всем 130 обследуемым женщинам было проведено цитологическое исследование с окраской по методу Лейшмана. Мазки в исследуемой группе ВПЧ положительных женщин окрашивались двумя методиками по Лейшману и Папаниколау.
Цитогический метод является одним из основных в диагностике предопухо-левых и злокачественных процессов женских половых органов. Совпадение цитологических заключений с результатами морфологических исследований влагалищной части шейки матки (П1М) отмечается в 79,2—93,4% случаев.
Достоинства цитологического метода: 1) безболезненность и безопасность получения материала; 2) возможность исследования патологического очага в динамике как до, так и после лечения; 3) возможность диагностики злокачественного процесса в самой начальной стадии; 4) небольшие финансовые затраты.
Недостатком цитологического метода является невозможность установления признаков инфильтративного роста в связи с отсутствием в цитологическом материале тканевого субстрата.
При проведении цитологической диагностики учитывались клинические данные, особенности и место получения материала. При исследовании цитологического препарата вначале определялся характер патологического процесса — воспалительный, реактивный, злокачественный, выяснялась тканевая принадлежность клеток. Затем устанавливалась гистогенетическая принадлежность обнаруженных клеток. По составу клеточных элементов цитологического препарата проводилась дифференциальная диагностика злокачественных и доброкачественных процессов. Определение степени выраженности признаков атипии клеток являлось основным в установлении доброкачественности и злокачественности процесса.
Мазки брались нами до бимануального исследования и кольпоскопии; наиболее целесообразно их взятие во вторую фазу менструального цикла. Используемые инструменты должны быть стерильными и сухими, поскольку вода и дезинфицирующие растворы разрушают клеточные элементы.
Материал для цитологической диагностики получали соскобом содержимого и получением мазка-отпечатка.
Исследуемый материал получали с трех участков: с экзоцервикса, с участка на границе плоского многослойного эпителия (МПЭ) и цилиндрического эпителия цервикального канала и из нижней трети эндоцервикса. Содержимое брали путем легкого соскоба и наносили на два предметных стекла. Для этого использовали специальные цитощеточки (Cytoprep и cervix brash) (рис 3.).
Мазки для цитологического исследования обрабатывали гематологическим методом окраски (по Лейшману) и гистологическием (по Папаниколау).
Методика окраски по Лейшману: Мазок высушивали на воздухе и опускали в краску Лейшмана на 3 мин. Затем его промывали водопроводной водой и заливали краской, которая содержит 40 мл азура, 30 мл эозина и 70 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивали 30—40 мин. После этого мазок промывали водопроводной водой, высушивали на воздухе.
Методика окраски по Папаниколау.
Этот метод основан на различной реакции клеточных структур на кислые и основные красители. Растворителем служит 95% этиловый спирт, поскольку в этом случае цветовая дифференцировка происходит лучше, чем в водном растворе. Метод Папаниколау предполагает фиксацию клеток в спирт содержащей среде. Первое окрашивание мазка по Папаниколау производилось основным красителем — гематоксилином. Активным компонентом гематоксилина являлся гематеин, который содержит ионы металлов, связывающиеся с анионами ДНК и РНК. Чистый гематеин, без металлов, является кислым красителем, связывается с аргинином ядерных протеинов. Гематоксилин окрашивает ДНК и РНК ядер и цитоплазму в синий цвет. Использовался оранжевый краситель сразу же после гематоксилина. Это кислый белковый краситель. Он проникает в плотные структуры, такие, как эритроциты, прокрашивая их. Оранжевый окрашивает пикнотические ядра, эритроциты, параке-ратозные клетки высокодифференцированной карциномы, клетки, пораженные папилломавирусной инфекцией, в желто-оранжевый цвет.
Эозин использовался после оранжевого или гематоксилина. Эозин — чистый кислый краситель, связывается в основном с протеинами ядрышек. При сочетании эозина со светлым зеленым не происходит смешения цветов цитоплазмы: часть клетки окрашивается в красный цвет, часть — в зеленый, это часто встречается при нарушении ороговения при папилломавирусной инфекции. Светлый зеленый — амфотерный краситель — содержит как основные, так и кислые группировки. Он окрашивал в основном цитоплазму промежуточных, метапластических и цилиндрических клеток.
Результат цитологического исследования мазков-отпечатков был представлен цитологом в виде описания клеточного состава.
Классификация цитологических результатов исследования по Папаниколау (PAP-smear test) получила наибольшее распространение в мире. Она включает 5 основных классов:
1 -й класс — атипических клеток нет. Нормальная цитологическая картина;
2-й класс — изменение морфологии клеточных элементов, обусловленное воспалительным процессом во влагалище и (или) шейке матки;
3-й класс — имеются единичные клетки с аномалиями цитоплазмы и ядер. Окончательный диагноз установить не удается. Требуется повторение цитологического или гистологического исследования для изучения патологически измененной ткани или органа;
Результаты цитологических исследований
Всем 130 женщинам проводился осмотр и взятие материала на цитологическое исследование. Исследуемый материал получали с трех участков: с экзо-цервикса, с участка на границе плоского многослойного эпителия (МПЭ) и цилиндрического эпителия цервикального канала и из нижней трети эндо-цервикса. Содержимое брали путем легкого соскоба и наносили на два предметных стекла. Для этого использовали специальные цитощеточки (Cytoprep cervix brash). Окраска производилась по методу Лейшмана. Мазки в исследуемой группе ВПЧ положительных женщин окрашивались двумя методиками по Лейшману и Па-паниколау.
Из 130 женщин у 34 (44,2%), имелись отклонения от нормального результата цитологического тестирования (рис. 16):
ASCUS - atypical squamous cells of undetermined significance, атипичные плоскоэпителиальные клетки неясного значения (АПКНЗ) - этот тип мазка был выявлен у 9 (11,7%) из 130 женщин (рис.17). squamous intraepithelial lesion, высокая степень внутриэпи-телиального поражения (В - ПИП), соответствует в гистологической классификации средней и тяжелой дисплазии CIN 2, CIN 3 - этот тип мазка был выявлен у 5 (6,5%) женщин из всей обследуемой группы (рис.18).
LSIL - low grade squamous intraepithelial lesion, низкая степень внутриэпите-лиального поражения (Н - ПИП), соответствует в гистологической классификации легкой дисплазии CIN1 - обнаружена у 20 (26%) пациенток всей обследуемой группы (рис.19). Рисунок 19.
В общей группе женщин прошедших цитологический скрининг (130 человек), 96 женщин имели нормальную цитологическую картину, а 34 женщины имели отклонения от нормы в виде атипичных плоскоэпителиальных клеток неясного значения (АПКНЗ), высокой степени внутриэпителиального поражения (В - ПИП), и низкой степени внутриэпителиального поражения (Н -ПИП) (диаграмма 7).
Группа HPV позитивных женщин составила 54 человека, и имела следующие результаты цитологического скрининга:
ASCUS - atypical squamous cells of undetermined significance, атипичные плоскоэпителиальные клетки неясного значения (АПКНЗ) - этот тип мазка был выявлен у 5 (2,7%) из 54 женщин.
HSIL - high grade squamous intraepithelial lesion, высокая степень внутриэпи-телиального поражения (В - ПИП), соответствует в гистологической классификации средней и тяжелой дисплазии CIN 2, CIN 3 - этот тип мазка был выявлен у 5 (2,7%) женщин из всей обследуемой группы.
LSIL - low grade squamous intraepithelial lesion, низкая степень внутриэпите-лиального поражения (Н - ПИП), соответствует в гистологической классификации легкой дисплазии CIN1 - обнаружена у 13 (%) пациенток всей обследуемой группы.
В группе позитивных женщин прошедших цитологический скрининг 31 имели нормальную цитологическую картину (диаграмма8).
Алгоритмы использования ВПЧ-тестов в диагностике предрака и рака шейки матки
Под данным алгоритмом следует понимать:
Проведение скринингового обследования с целью выявления лиц из группы повышенного риска развития РШМ (инфицированных ВПЧ высокого канцерогенного риска). Данное обследование проводится вне зависимости от наличия жалоб или результата визуального осмотра врачом начиная с 25-30 лет каждые 3-5 лет.
Более тщательная проверка выявленных лиц на наличие предраковой и раковой патологии с использованием инструментальных методов диагностики
Своевременное лечения предраковой патологии
Тщательное наблюдение за лицами из группы риска, но без признаков предраковой патологии.
Ведущими специалистами и рядом международных организаций (ASCCP, EUROGIN, ESIDOG и другие) предложены алгоритмы диагностики с использованием теста на ДНК ВПЧ:
... как первичного скринингового метода в дополнение к цитологии для женщин старше 30 лет.
... для разрешения сомнительных результатов цитологического исследования (ASCUS, ASC-H)
... на первом этапе скрининга для стран, где плохо организованы программы цервикального цитологического скрининга
2. Алгоритм использования ВПЧ-теста в мониторинге терапии CIN2+
Под данным алгоритмом следует понимать проведение двойного исследования цитология+ВГТЧ-тест через 6 месяцев после проведенного хирургического лечения и в случае получения двойного отрицательного результата считать пациентку полностью излеченной (в отличие от классической схемы, где для подтверждения статуса излеченности необходимо получение 4-5 отрицательных цитологических заключения)
Дополнительные возможности определения прогноза течения заболевания может дать проведение генотипирования. Необходимость генотипирования может быть оправдана так как:
1. Выявление нескольких генотипов вируса ассоциировано с менее благоприятным прогнозом течения заболевания и более высоким риском персистенции.
2. Степень онкогенности различных генотипов высокого риска не одинакова. Наибольшей онкогенностью обладают 16 и 18 типы ВПЧ, существуют рекомендации по проведению определения этих двух генотипов вируса после теста на широкий спектр типов с целью более агрессивной тактики ведения пациентов: при выявлении 16 и 18 генотипов рекомендуется сразу проводить кольпоскопическое обследование, при выявлении других типов высокого риска - сначала проводить цитологию и только при положительном результате цитологии проводить кольпоскопию.
3. Проведение генотипирования позволяет отличить реинфицирование от персистентной инфекции при повторном визите пациента. Получать подобную информацию тем более важно, так как опасность представляет именно хроническая персистентная форма инфекции, недавнее же инфицирование наиболее вероятно спонтанно излечивается. О реинфи-цировании говорит изменение спектра генотипов, о персистентной инфекции — сохранение генотипа вируса через год после первого тестирования, повторное инфицирование тем же генотипом вируса после самостоятельного излечения практически невозможно.
