Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Иммунологические аспекты привычной потери беременности 12
1.2. Методы иммунотерапии при привычной потери беременности 26
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 33
ГЛАВА 3. Клиническая характеристика обследованных женщин 50
ГЛАВА 4. Результаты собственных исследований супружеских пар с привычным невынашиванием беременности ранних сроков 57
4.1. Результатььгенетического обследования супружеских пар исследуемой. группы 57
4.2. Результаты обследованияинтерферонового статуса и тактика» подготовки к беременности-пациенток с аллоиммунными нарушениями привычного невынашивания ранних сроков 73
4.2.1. Проведение ЛИТ и оценка функционального состояния иммунной системы при подготовке к беременности женщин с привычнымневынашиванием ранних сроков 76
4.3. Течения и исходы наблюдаемых беременностей 85
4.3.1. Оценка функционального состояния иммунной системы во время беременности на фоне проведения ЛИТ у обследованных женщин 86
ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов 95
Выводы 117
Практические рекомендации. 119
Список литературы 121
- Иммунологические аспекты привычной потери беременности
- Клиническая характеристика обследованных женщин
- Результатььгенетического обследования супружеских пар исследуемой. группы
- Проведение ЛИТ и оценка функционального состояния иммунной системы при подготовке к беременности женщин с привычнымневынашиванием ранних сроков
Введение к работе
Актуальность темы
В мировой литературе большее внимание уделяется изучению иммунологических аспектов привычной потери беременности, составляющие по данным некоторых авторов практически 75-80% в генезе идиопатического привычного выкидыша-[63, 71].
Беременность предъявляет организму женщины большие требования. Для обеспечения нормального течения имплантации, роста и развития эмбриона- в первом4 триместре играют большую роль сложные комплексы иммунобиологических процессов, которые недостаточно изучены. С помощью сложного комплекса иммунологических механизмов, действующих с ранних сроков беременности; материнские организм не отторгает эмбрион, который, является полуаллогенным трансплантантом. Нарушение иммунных взаимоотношений в * системе мать — плацента — плод может служить причиной ранних прерываний беременности.
В' основе- иммунологических нарушений лежат аутоиммунные и аллоиммунные причины, которые ведут к отторжению эмбриона/плода [27].
При аутоиммунных процессах агрессия иммунной системы направлена против собственных тканей материнского организма, а плод страдает вторично. Примером аутоиммунных состояний являются системная-красная волчанка (СКВ) и антифосфолипидный синдром (АФС), которые увеличивают риск развития тромбоэмболических состояний. А примером аллоиммунных причин ведущих к привычным, потерям беременности являются совместимость супругов по системе HLA, высокий уровень NK клеток и цитокинов в эндометрии. При' аллоиммунных нарушениях организм матери проявляет иммунную, агрессию против антигенов плода, поскольку мать не может выработать антитела, защищающие плод от ее иммунной агрессии, вследствие совместимости супругов по системе HLA [27].
Согласно мнению ряда исследователей, при совместимости супругов более чем по трем антигенам системы НЬА, без проведения терапии,, риск невынашивания составляет 100% в связи с недостаточной продукцией при беременности блокирующих факторов [161].
Однако, ряд исследователей полагают, что гены, локализованные в разных частях области II класса МНС, влияют на разные аспекты репродукции, и что совместимость по антигенам HLA сама по себе не может вызвать дефекты репродуктивного процесса [140].
Повышенное содержание NK (CD3~56+16*) клеток найдено в периферической! крови ^ женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе' [40; 154, 162]. Высокий уровень CD56T клеток в* крови выше-18% во время.беременности может вызвать выкидыш.
Вг настоящее время большое внимание уделяется изучению* продуцируемых цитокинов' на системном- и локальном уровне: Многие' исследователи- установили, что эндометрий, женщин, которые не имели привычные потери беременности, продуцирует Тп2-цитокины ИЛ-4 и ИЛ-6, тогда как в эндометрии- женщин, страдающих необъяснимым привычным невынашиванием, преобладают провоспалительные Thl-цитокины ИЛ-2, ИЛ-12 и ИФН-у [134]. Данные результаты подтверждают другие авторы, которые нашли увеличение NK клеток в эндометрии у женщин с ранними потерями беременности в анамнезе [67].
Одним из методов лечения, направленных на сохранение беременности при аллоиммунных нарушениях, является активная иммунизация аллогенными лимфоцитами. Применение лимфоцитоиммунотерапии (ЛИТ) позволяет изменить состояние иммунной системы матери' в сторону преобладания ТЬ2-иммунного ответа. В целом ряде исследований показано, что ЛИТ успешно применяется в системе комплексного лечения привычного невынашивания беременности [1, 5, 20, 27, 36, 53, 56, 57, 59, 70, 85, 89, 99,
100, 109]. При условии отсутствия хромосомных аномалий у эмбриона, эффективность терапии составляет более 90% [36].
Однако отношение к данному методу терапии неоднозначное, помимо сторонников имеются и противники, которые не считают аллоиммунные нарушения причиной невынашивания беременности [75, 117, 131, 138, 149]. ЛИТ клетками мужа или донора является чрезвычайно дискутабельным методом профилактики и лечения аллоиммунных форм невынашивания беременности, однако многие аспекты применения ЛИТ остаются неясными: нет четких критериев- отбора пациенток для лечения, неотработанны сроки проведения ЛИТ, нет четких данных об эффективности различных доз< вводимых лимфоцитов.
Целью настоящего исследования являлась оптимизация метода лимфоцитоиммунотерапии и оценка ее эффективности* при подготовке и в первом триместре беременности у пациенток с аллоиммунным генезом, привычной потери беременности.
Для достижения поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
Оценить < значение аллоиммунных нарушений в структуре причин привычной потери беременности на основании определения совместимости супругов по системе HLA, уровня NK клеток и сывороточного интерферона в периферической крови, показателей аллогеннои стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител.
Оценить эффективность различных доз аллогенных лимфоцитов (50 млн, 100 млн и 150 млн клеток) на основании анализа субпопуляционного состава лимфоцитов, в периферической крови и оценки функционального состояния иммунной системы с помощью показателей аллогеннои стимуляции лимфоцитов in. vitro и, выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител при-подготовке к беременности.
3. Разработать оптимальные режимы применения ЛИТ во время
беременности на основании исследования субпопуляционного состава
лимфоцитов в периферической крови, показателей аллогенной стимуляции
лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител.
4. Оценить течение и исходы беременностей после применения ЛИТ
при подготовке и в первом триместре беременности у пациенток с
привычными потерями ранних сроков в анамнезе.
Научная новизна
Установлено; что?в.генезе*ранних потерь привычного невынашивания беременности, помимо совместимости супругов более чем по 3 антигенам системы HLA, значимую* роль играют: высокий уровень NK клеток с маркером CD3~56*16*, повышенный.уровень провоспалительных цитокинов; в частности сывороточного интерферона в периферической крови, отсутствие адекватной реакции на стимуляцию аллогенными лимфоцитами in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител.
Впервые разработана рациональная тактика лимфоцитоиммунотерапии (сроки проведения, кратность и доза), повышающая эффективность и безопасность применения проводимой терапии при подготовке и в первом триместре беременности у женщин с привычным невынашиванием аллоиммунного генеза. При выявлении совместимости супругов, по 3 антигенам системы HLA и незначительном повышении (до 20%) уровня CD3~56+16+ клеток в периферической крови, применяется ЛИТ в дозе 50 млн клеток; при выявлении совместимости супругов по 4—5 антигенам системы HLA и повышенного уровня CD3~56+16+ клеток в периферической крови от 20 - 23%, целесообразно проведение ЛИТ в дозе 100 млн клеток; при выявлении совместимости супругов по более чем 5 антигенам системы* HLA и повышенного уровня CD3~56+16+ клеток в периферической крови более 23%, необходимо применение ЛИТ в дозе 150 млн клеток.
В работе подтверждена высокая эффективность применения лимфоцитоиммунотерапии в профилактике и лечении' привычной потери беременности аллоиммунного генеза.
Практическая значимость
На основании проведенных исследований определена группа пациентов повышенного риска ранних потерь беременности, у которых необходимо проведение иммуногенетического обследования, определение в периферической крови уровня CD3"56+16+ клеток, уровня сывороточного интерферона, показателей аллогенной4 стимуляции лимфоцитов in vitro * и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител.
На1 основании полученных результатов обследования разработаны показания для применения различных доз лимфоцитов в количестве 50 млн, 100 млн и 150 млн клеток с целью достижения оптимальной эффективности.
Определены иммунологические показатели оценки эффективности проведения ЛИТ при подготовке и в первом триместре беременностиі у женщин с привычным невынашиванием аллоиммунного генеза.
Разработан алгоритм подготовки к беременности и ведения беременности у пациенток с аллоиммунными нарушениями, и показана высокая эффективность метода ЛИТ по сохранению беременности у этого контингента больных.
Положения диссертации, выносимые на защиту
1. В структуре ранних потерь беременности аллоиммунные нарушения играют существенную роль и составляют 24,6%. Факторами, повышающими риск ранних потерь беременности; являются: совместимость супругов более чем по» 3 антигенам системы. HLA, гомозиготный генотип у женщин по локусу DQAi генотип 0301/0301 и по локусу DQBi генотип 0501/0501, наличие аллеля 0201 по локусу DQAi и/или по локусу DQBi у мужчин.
2. Эффективным методом предгравидарной подготовки женщин с
привычным невынашиванием беременности аллоиммунного* генеза является
ЛИТ. Оптимальным количеством вводимых лимфоцитов для исследуемой
группы пациенток является 100 млн и 150 млн клеток, при этом наблюдается
статистически достоверное снижение уровняСЮЗ~56+16+ клеток, повышение
уровня CD8 клеток и IgM, снижение пролиферативного ответа женских
лимфоцитов на ФГА, и1 повышение уровня блокирующих факторов и
антиотцовских антилейкоцитарных антител. Вводимая доза клеток зависит от
числа совместимых антигенов HLA у супругов и уровня CD3~56+16+ клеток в
периферической крови матери.
3. Индивидуализированнаяпредгестационная подготовка и применение
ЛИТ при подготовке^ влечение первого ітриместра* беременности позволили
получить успешный результат. Рождение жизнеспособных детей отмечено у
95,9% женщин, из них 93,6% оценены по шкале Апгарі на* 8-9' баллов:
Наличие совпадений супругов по антигенам системы HLA создает условия,
для гомозиготности их новорожденных.
Реализация полученных результатов
Результаты проведенных исследований и основные рекомендации, вытекающие из них, используются в акушерских отделениях ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» при обследовании и лечении супружеских пар с привычными потерями беременности ранних сроков.
По теме диссертации, опубликовано 3 работы в отечественной печати.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на межклинической конференции отделения терапии и профилактики
невынашивания беременности 07 июля 2008 года и на совместном заседании апробационной комиссии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» и кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова 14 июля 2008 года.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 4 диаграммами. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический указатель включает 166 литературных источников, из них 34 отечественных и 132 зарубежных авторов.
12
: ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Иммунологические аспекты привычной потери беременности
Иммунологические взаимоотношения эндометрия и трофобласта на ранних
этапах беременности
В мировой литературе в настоящее время принято понятие «привычная
* потеря беременности», т.к. в 75% случаев происходит гибель эмбриона, а
і только потом могут быть явления угрозы прерывания или выкидыш [16, 19,
26, 27, 148].
Среди всех желанных беременностей частота привычной потери
беременности составляет от 2—5%. Общепринято* считать» привычным
невынашиванием 3 и более потери беременности, однако многие
исследователи полагают, что обследование в связи1 с привычной потерей
беременности надо начинать после 2 выкидышей [119, 137, 148]. Это
обусловлено тем, что после каждой потери беременности возрастает риск
\ последующего выкидыша. Так, после одного выкидыша риск потери
беременности составляет 13—17%, после двух потерь риск последующих выкидышей составляет 26%, после трех — 32%, после четырех - 40% [137, 148].
Синдром привычной потери беременности полиэтиологичен, но на
ранних этапах беременности чрезвычайно большую роль играют иммунные
механизмы отторжения. Для успешной имплантации необходима і
синхронность развития имплантации и созревания бластоцисты [124].
Важную роль для своевременной имплантации бластоцисты играет
целый ряд факторов, определяющих успешность развития беременности,
одним из этих факторов является муцин (Mucl-episialin), который покрывает
поверхностный эпителий эндометрия [120].
До сих пор остается неясным, как эмбрион идентифицирует место имплантации [95]. Есть предполажение, что эмбрион продуцирует протеазы, растворимые молекулы, которые разрушают муцин,, воздействуют на эндометрий, подготавливая его к имплантации [120].
Процесс адгезии двух клеточных структур — эмбриона и эндометрия, осуществляется с помощью молекул адгезии. В момент имплантации ведущую роль в адгезии играют интегрины, особенно интегрин - рь экспрессия* которого в. момент имплантации увеличивается; обеспечивая механические и; химические сигналы, регулируя, активность факторов роста и цитоплазматических киназ, интегрины участвуют в регуляции; жизненного цикла клеток, а также контролируют организацию цитоскелета [71]. Интегрины. связаны» с протеинами; поскольку не обладают энзиматической > активностью, такими'как протеины - трофинищбустин и тастин.
Эмбрион; принимает участие в;регуляции;экспрессии' молекул адгезии;: муцинов; хемокинов и цитоскелетньгх белков на'',эндометриальном? эпителии* [65]. Поверхностные клетки, эндометриального;эпителия?также индуцируют молекулы адгезии, которые являются рецепторами; для лиганд на наружной трофэктодермальной поверхности бластоцисты [161].
Во время беременности происходят динамические изменения в эндометрии— процесс децидуализации. Данный процесс гормонозависимый; при котором происходит трансформация маточных фибробластов в большие клетки, которые, в свою очередь, продуцируют ростовые факторы, гормоны и компоненты матрикса, участвующие в процессе имплантации и развитии плаценты. Во время децидуализации активируются и: увеличиваются субпопуляции лимфоцитов, приобретая цитоплазматические гранулы и продуцируя і иммунные цитокины, [6 Ц;
Эти изменения в основномшроисходят на локальном уровне, но данные о состоянии: локального иммунитета эндометрия; в> мировой; литературе1 чрезвычайно противоречивы [46; 50; 75, 81, 84, 103, 104; 150; 155].
В эндометрии здоровой женщины содержание иммунокомпетентных клеток повышено, и основной популяцией иммунных клеток являются лимфоциты [88]. В иммунном ответе принимают участие макрофаги, естественные киллеры (NK), Т и В лимфоциты. В эндометрии преобладают Т-лимфоциты, а количество В-лимфоцитов незначительное [75, 104, 150].
Исследования показали, что в популяции лимфоидных клеток Т-лимфоциты составляют около 4%, а макрофаги 5% [111]. Их количество возрастает, достигая около 16% в фазу поздней секреции. Макрофаги в эндометрии находятся в строме и в малых лимфоидных агрегатах. Основная роль, в обеспечении иммунологического баланса принадлежит макрофагам эндометрия, которые продуцируют простагландины, (ПР-Е2) [84, 103]. ПГ являются иммуносупрессивным фактором и во время имплантации стимулируют пролиферацию^ и дифференцировку децидуальных клеток эндометрия^ а также повышают васкуляризацику и, проницаемость, стенок, сосудов эндометрия.
Исследования показали, что среди иммунокомпетентных- клеток эндометрия клетки с антигенным маркером CD45+ в пролиферативную фазу составляют 10-15% от популяции клеток эндометрия, а в. секреторную фазу до 20-25% [46]. Клетки с антигенным маркером CD3+, обладающие цитологической активностью, в пролиферативной фазе выше, чем в секреторной [50, 81, 83]. Исследования многих авторов, изучающих субпопуляционный состав лимфоцитов эндометрия показали, что количество Т-лимфоцитов с маркером CD4+ и CD8+ клеток в пролиферативном эндометрии больше, чем в секреторном [62, 108, 156]. В работах других авторов показано; что количество этих Т-лимфоцитов выше не в секреторную, а в пролиферативную фазу [15] или что в течение менструального цикла количество Т-лимфоцитов< не меняется [155]. Показано, что интраэпителиальные лимфоциты находятся между клетками покровного и железистого эпителия и большинство из них экспрессируют
поверхностные маркеры CD3, CD4 и CD8. Интерстициальные лимфоциты окружены спиральными артериолами, некоторые из которых несут маркеры В-лимфоцитов. Наличие плазматических клеток в эндометрии говорит об инфекционных процессах [144]. Лимфоидные скопления находятся в базальном слое эндометрия и не отторгаются во время менструации [103].
Т-лимфоциты по поверхностным гликопротеинам делятся* на Т-хелперы (CD4+) и цитоплазматические Т-лимфоциты (CD8*). Т-хелперы под действием различных факторов* дифференцируются на Th-І и Th-2. Th-1 лимфоциты отвечают за стимуляцию клеточного иммунитета, участвуют в иммунном воспалении, активируют макрофаги, продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов (ИЛ-2, ИФНу, TNFP): Th-2 отвечают за развитие гуморального иммунитета, стимулируют антителообразование, продуцируют факторы-роста ШГ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и Ш1МЗ. Полагают, что' баланс между Th-Г и Th-2 имеет чрезвычайно * больное значениев развитии беременности [15].
В' момент имплантации, при нормально* протекающей беременности, снижается уровень. CD4+ лимфоцитов- и повышается? уровень CD8+ лимфоцитов. Показано, что CD8+ клетки содержат рецепторы к прогестерону и продуцируют медиаторный белок 34-Ша, прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (ПИБФ) [15]. Под влиянием ПИБФ снижается уровень продукции цитокинов Th-І-типа, что ведет к снижению активности NK клеток и приводит к нормальному исходу беременности. При изучении лимфоцитов в биоптатах эндометрия у 20 женщин с привычными потерями, беременности и у 15 фертильных женщин из группы контроля, было1 показано, что процент CD8+ клеток в эндометрии снижен у женщин с привычным невынашиванием беременности [67]. Полученные данные говорят о том, что CD8* выполняют супрессивную роль в локальной иммунной реакции гестационного эндометрия, особенно' во» время имплантации [50, 67].
Большие гранулярные лимфоциты (БГЛ) в эндометрии представляют многочисленную популяцию среди лейкоцитов [15, 39, 47, 105, 106]. Особенность БГЛ эндометрия является активная экспрессия маркера CD56. До менструального цикла и после менопаузы БГЛ в эндометрии отсутствует, их только можно обнаружить в эндометрии у женщин репродуктивного возраста [52].
В позднюю секреторную фазу БГЛ образуют скопления вблизи желез и сосудов. В течение пролиферативной фазы менструального цикла количество БГЛ составляет 8% от всех клеток эндометрия. В середине секреторной фазы, что соответствует периоду имплантации, БГЛ составляет 60%, а в первом триместре беременности — более 70% [46, 123]. Количество БГЛ увеличивается в участках инвазии трофобласта. В течение I триместра их уровень повышается, а в третем триместре резко снижается до исчезновения при доношенной беременности [37, 79].
Предполагают, что посредством цитотоксического воздействия1 на измененные или излишне инвазивные клетки трофобласта, БГЛ оказывают регулирующее действие на процессы миграции и инвазии трофобласта [136].
Во время имплантации, важнейшим компонентом для^
взаимоотношения трофобласта с эндометрием являются
иммунокомпетентные клетки. Существует мнение о том, что в момент имплантации распознание аллоантигенов плода, которые экспрессируются трофобластом, происходит через Т-клетки. Однако исследования показали, что во время имплантации аллогенное распознавание может быть основано на NK-клетках, а не на Т-клетках [105, 106]. Децидуальная ткань матки инфильтрирует большое количество NK-клеток, а Т- и В-клетки встречаются значительно реже.
В распознавании иммунной системой аллогенных и полуаллогенных клеток и индукции реакции отторжения трансплантата основная* роль принадлежит генам МНС (Major Histocompatibility Complex - главный
{
v комплекс гистосовместимости). Комплекс генов МНС находится на коротком
* плече 6-й хромосомы человека и кодирует поверхностные клеточные
антигены HLA (Human Leukocyte Antigens — лейкоцитарные антигены
t человека), которые играют решающую роль для антигенспецифических
взаимоотношений клеток [24]. HLA состоит из группы генов I, II и III
і классов, которые имеют характерные функции. I класс состоит из HLA-A, -В,
-С-локусов и их серологически выявляемых антигенов, на которые
і реагируют Т-цитотоксические (CD8+) клетки [96, 163]. Ко II классу относятся
локусы DR, DQ (а и Р), DP, DO и DN, которые взаимодействуют с Т-
хелперами (CD4+), и играют основную роль в иммунном распознавании и
{ взаимодействии иммунокомпетентных клеток [77, 101].
Регион класса III системы HLA состоит из генов, которые вовлечены в
реакции иммунологических взаимоотношений, принимают участие в
процессах воспаления и содержат аллели компонентов комплемента G2, С4 и
Bf (пропердиновый фактор), а также TNF w ряд изоферментов [21].
j Обнаружены некласические локусы HLA-E, F и G, которые находятся на 19
," хромосоме. Классические антигены системы HLA I и II классов на
h трофобласте не экспрессируются, но экспрессируется неклассический
(класс lb) антиген HLA-G плода. Этот антиген отцовского происхождения
! является молекулой адгезии для CD8 антигенов больших гранулярных
лейкоцитов, которые с маркерами CD3 CD8+CD56+ функционально связаны с
ТЫ-клетками, продуцирующими цитокины ИЛ-2, ИФН-у и TNFa по
, сравнению с CD8 CD56 децидуальными гранулярными лейкоцитами. На
| трофобласте экспрессируются рецепторы для цитокинов TNFa, ИФН-у и
GM-CSF, которые имеют низкую связывающую способность. При этом ответ
на плодовые антигены будет происходить через Th2 цитокины. Th2
продуцируют регуляторные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13 и др.),
? продукция которых по отношению к провоспалительным цитокинам будет
\ повышена. Успешное развитие и инвазия трофобласта возможна при
нормальном балансе между Thl и Th2 цитокинами. Повышенное содержание провоспалительных цитокинов отрицательно влияет на развитие и инвазию трофобласта, задерживает развитие плаценты, что способствует снижению продукции гормонов и протеинов [35, 78, 102].
Следует отметить, что трофобластом и клетками амниона вырабатываются молекулы фетуин и спермин, которые обладают иммуносупрессивным действием. Эти молекулы подавляют продукцию TNF. Иммунологическая агрессия против трофобласта снижается с помощью HLA-G-антигена, который ингибирует рецепторы NK клеток [55].
В имплантацию эмбриона вовлечены гормоны яичника, эстрогены и прогестерон. Иммуномодулирующая роль эстрогенов и прогестерона, необходима для развития восприимчивости эндометрия и поддержания беременности.
Прогестерон проявляет иммуномодулирующий эффект с помощью ПИБФ, который угнетает иммунный ответ, развивающийся по типу Thl, аллоантигениндуцированную пролиферацию* [116, 153, 160], а также действует на выработку цитокинов активированными лимфоцитами [151]. Группа авторов показала непосредственно важную роль прогестерона в индукции генной экспрессии ИЛ-5 в Т-клеточной линии [165]. Изучая иммуномодулирующую способность прогестерона на уровень продукции цитокинов во время беременности, J. Szekeres-Bartho и соавт. (1996) показали, что снижение клеточного ответа в течение беременности происходит за счет влияния ПИБФ на баланс Тп1/Тп2-типов, с помощью изменения цитокинового соотношения. Перед родами естественная цитотоксическая активность значительно увеличивается. Активность NK клеток блокируется под влиянием ПИБФ [152]. Нужно отметить, что механизм достижения данных эффектов полностью не ясен.
Для поддержания беременности, необходима продукция прогестерона. Показано, что прогестерон, индуцируя иммуносупрессивный белок, влияет на продукцию лимфокинов активированными Т-клетками [60].
Удачная имплантацияі зародыша, которая связана с восприимчивостью эндометрия, а также развитие беременности на1 ранних сроках, обусловлено с изменением продукции прогестерона в течение лютеиновой фазы [66]. Снижение уровнялрогестерона может приводить к спонтанному аборту.
На трофобласте экспрессируются материнские и отцовские антигены, ранняя сенсибилизация которых предотвращается с помощью прогестерона-и эстрогенов, которые продуцируются трофобластом и оказывают иммуносупрессивный эффект на цитотоксические клетки. Группа авторов-показала, что под влиянием прогестерона; уровень блокирующих факторов-в сыворотке крови беременных может быть не устойчивым [116]'. CD8+ лимфоциты-имеют рецепторы к прогестерону, в зависимости от которых, при синтезе блокирующего фактора угнетается естественная цитотоксическая активность.
При росте и развитии трофобласта увеличивается продукция прогестерона, который играет основную! роль в иммунных взаимоотношениях. Под влиянием прогестерона местно продуцируются плацентарные протеины. Протеин TJ6 влияет на децидуальные CD56+16+ клетки, вызывая апоптоз этих клеток. Существуют анти-Т]6-антитела, наличие которых блокирует апоптоз клеток, что приводит к увеличению уровня NK клеток и к неблагоприятному исходу беременности [14, 57, 110].
В организме матери вырабатываются антитела, связанные с ростом трофобласта, которые блокируют местный иммунный. ответ. Удачная имплантация приводит к быстрому развитию трофобласта, который начинает секретировать хорионический гонадотропин (ХГ), белок PPJ, факторы роста. Для обеспечения роста и. развития эмбриона с 5-6 недели беременности
начинается интенсивное развитие плаценты, который опережает темпы развития эмбриона [27].
С помощью ХГ и многочисленных факторов роста можно осуществлять контроль над функционирующей плацентой [93, 125, 139].
Организм беременной женщины обеспечивает рост и развитие плода за счет адаптивных изменений во всех системах организма.
Иммунологические аспекты привычной потери беременности
Многие исследователи со времен работ P. Medawar (1953) и» его коллег рассматривали плод как аллотрансплантат, но любой аллотрансплантат подвергается реакциям тканевого отторжения, и поэтому основными вопросами1 в иммунологии беременности является механизм выживания полуаллогенного плода в матке и механизмы иммунологического отторжения его, [49]. Одним из вопросов является выяснение- особенностей экспрессии антигенов системы HLA на поверхности клеток фетального трофобласта.
По данным многих исследователей причинами ранних потерь аллоиммуиного генеза являются:
совместимость антигенов системы HLA у супругов (3 и более идентичных антигенов);
повышенное содержание NK клеток и сывороточного интерферона в периферической крови;
отсутствие изменений в показателях аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских атнилейкоцитарных антител.
Во время имплантации бластоциста внедряется в децидуальную оболочку матки, которая в первом триместре беременности играет важную иммунорегуляторную роль. В децидуальной оболочке матки функционируют
субпопуляции Т-лимфоцитов и NK. В капсулярном слое децидуальной оболочки находятся супрессорные лимфоциты, макрофаги и цитотоксические Т-лимфоциты. В стромальной части ворсин плаценты локализованы дендритные клетки, которые представляют антиген CD4+-Т-клеткам (клетки плодового происхождения) [129]. Эти клетки несут DQ-аллели II класса МНС. Совпадение этих аллелей у матери и плода может привести к нарушениям в фетоплацентарном комплексе, поскольку в плаценте происходит инициация аутоиммунного ответа [112].
На мембранах клеток трофобласта экспрессируются материнские и отцовские антигены. За счет наличия^ антигенов гистосовместимости плацента является иммунологическим барьером [13, 31].
Успешная имплантация зародыша связана с локальной супрессией отцовских антигенов МНС наг поверхности ранней бластоцисты [59, 97]. Клетки трофобласта способны регулировать экспрессию генов I. класса МНС и угнетать экспрессию генов II класса, при этом реакция тканевого отторжения отсутствует [82].
Плацента вырабатывает антитела к отцовским HLA-антигенам I класса и фиксирует антитела к антигенам II класса МНС. На мембранах синцитиотрофобласта расположены Fc-рецепторы, которые участвуют в переносе материнских IgG плоду и связывают антитела, специфичные к отцовским антигенам.
К плоду с помощью Fc-рецепторов активно транспортируют материнские IgGi и IgG3, которые создают пассивный иммунитет у плода. В строме плаценты локализованы Fc-рецепторы, которые регулируют связывание комплексов, а агрегация IgG стимулирует рост плаценты [6, 13, 22,27,157].
На цитотрофобласте экспрессируется HLA-G-антиген, который представляет пептид Т-клеткам. Пептиды представляются молекулам I класса МНС с помощью транспортных белков. Иммуногистохимическим
методом группа авторов определила их экспрессию трофобластом и отношение с HLA-G-антигеном [69]. Одновременно были использованы антитела против транспортных белков (ТАРІ) с антителами к антигенам I класса МНС. В первом триместре и в конце беременности на материнских тканях экспрессия- ТАРІ была пассивная, а на НЬА-С+-вневорсинчатом цитотрофобласте интенсивная'. Это говорит о том, что процесс формирования комплексных антигеновf I класса МНС с пептидами* во вневорсинчатом цитотрофобласте происходит активно. Нужно отметить, что плод от материнской иммунной агрессии защищается с помощью процесса сброса антигенов1 с поверхности трофобласта, что > снижает экспрессию антигенов» I класса цитотрофобластом:
Для роста и развития-плаценты необходимы полипептидные гормоны, (инсулин, эпидермальный- фактор роста), которые связываются? с помощью HLA-G-молекул [146].
По данным литературы, в реакции,» смешанной' культуры лимфоцитов можно определить угнетение пролиферации Т-клеток цитотоксическими антителами, которое можно измерить и использовать в диагностике этой причины привычнойшотери беременности [145].
Анти-НЬА-антитела способствуют развитию иммунного ответа на отцовские антигены по Тп2-пути. У женщин отсутствие этих антител, взаимосвязанных с иммунным ответом по Thl-пути, может привести к привычной потери беременности, неудачам при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО), что объясняется задержкой развития и разрушением клеток плаценты. Для восстановления репродуктивной функции женщины необходима нормализация баланса Thl/Th2 и лечение аутоиммунного состояния [64].
Активация супрессорных лимфоцитов и появление «блокирующих антител» может препятствовать, реакциям тканевого отторжения [38, 132]і В реакции смешанной культуры лимфоцитов о наличии блокирующих антител
можно судить по угнетению- пролиферативного ответа клеток отца под действием материнской сыворотки. Антитела против антигенов отца, которые связаны с комплексом HLA, блокируют клеточные реакции. Эти антитела нецитотоксические и во время беременности они проявляются как блокирующие [72, 157], облегчающие или усиливающие антитела [86], аутоантитела [107].
В' гетерогенную группу антител входит «блокирующий* фактор», который угнетает продукцию фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов [141]. Было установлено, что «блокирующий фактор» относится к иммуноглобулинам:
Если антиидиотипические антитела* направлены^ к антиген связывающему участку цитотоксических антител, которые распознают отцовские антигены, либо к идиотипическим! детерминантам TCR" (Т-клеточный рецептор), то они могут играть роль блокирующих антител [157].
Группа исследователей показали, что экспрессия антигенов II класса-МНС угнетается с помощью фактора, который присутствует в ретроплацентарной сыворотке и периферической крови матери [118]. Но учитывая, что по сравнению с активностью ретроплацентарной сыворотки активность фактора в сыворотке периферической крови матери снижена, то это говорит о том, что в области взаимодействия системы мать -плод угнетающий фактор освобождается локально.
На трофобласте, В-лимфоцитах и моноцитах обнаружена одиночная пептидная цепь 80кД (R80K) [113]. При нормальном течении беременности материнские антитела связываются с белком R80K, поскольку он имеет аллоантигенную детерминанту. Связь белка R80K с материнскими антителами защищает трофобласт от атаки NK, поскольку белок R80K играет роль мишени для естественной1 клеточной.цитотоксичности.
Цитотоксические антитела, воздействуя на Т-лимфоциты матери, подавляют распознавание антигенов плода. Это свидетельствует о том, что цитотоксические антитела во время беременности могут играть роль блокирующих и антиидиотипических антител по отношению к HLA-антигенам. Нужно отметить, что воздействие блокирующих антител не вызывает патологических изменений в плаценте или у плода. Исследования показали, что по сравнению с генетически идентичными родителями, при аллогенной беременности масса плаценты больше [51].
В организме матери плод является аллотрансплантатом, несущим набор антигенов матери и отца. Во время беременности плод не отторгается за счет иммунологических реакций между иммунокомпетентными клетками материнской иммунной системы, чем можно объяснить благоприятный исход беременности. Эмбрион не отторгается за счет повышения супрессорной активности лимфоцитов и появления блокирующих антител к антигенам, наследуемым от отца. Во времяi беременности снижение уровня блокирующих факторов в крови может привести к потере беременности [13, 44, 48]. Продукцию блокирующих факторов» можно усилить с помощью введения аллогенных лимфоцитов (лимфоцитов мужа или: донора) беременной женщине [5, 40, 41, 44, 45].
Клетки и ткани плаценты продуцируют много факторов, которые имеют иммуносупрессорную активность. Предполагают, что ХГЧ, плацентарный лактоген, плацентарный белок-14 (РР14) и связанный с беременностью плазматический протеин А также обладают иммуносупрессорной активностью*[41, 122, 130].
Группы исследователей считают, что активация NK может способствовать прерыванию беременности у тех пациенток, чьи абортусы имеют нормальный хромосомный набор. У этих женщин повышенное содержание NK в крови; которые экспрессируют CD56*16* антиген и продуцируют эмбриотоксические цитокины [58]. В!эндометрии из ЕК также
повышен уровень CD 16 клеток. В децидуальной ткани число активированных цитотоксических NK (GD56*) увеличивается и уменьшается количество клеток, которые продуцируют ТФР-р2 (CD56*). У женщин с привычным выкидышем содержание ТФР-р2 в децидуальной ткани меньше, чем при нормально прогрессирующей беременности [67, 127, 164]. Предполагают, что выкидыш при нормальном наборе хромосом связан с увеличением в субпопуляции агрессивных CD56+ клеток [36].
Группа авторов показала, что у женщин с привычным невынашиванием беременности в эндометрии число Т-хелперов (CD4+), макрофагов (CD14+) и МС (CD16+, CD56*) значительно- больше, чем у фертильных женщин, родивших здоровых детей [133].
Повышенное содержание NK (CD3 GD16+CD56+) в* периферической* крови найдено у женщин с привычными потерями беременности многими? исследователями [40, 154, 162]. Во время»беременности повышение уровня,в, периферической крови клеток CD56+ выше. 18%, достоверный показатель, возможного угрожающего выкидыша*. Показано, что» в ранние сроки беременности содержание GD56*16+ лимфоцитов увеличивалось у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе [128]. Таким образом, неблагоприятным прогностическим показателем для спонтанного выкидыша является повышенное содержание NK у небеременных женщин. Высокий процент CD19+CD5+ клеток, который можно обнаружить у женщин с привычным выкидышем в анамнезе, говорит о присутствии аутоантител в крови.
Группа авторов, сравнивая реактивность клеток матери к плацентарным антигенам у женщин, с успешно протекающей беременностью, и у женщин с привычным невынашиванием в анамнезе обнаружили, что уровень Т1і2-цитокинов' ИЛ-10* у фертильных женщин, родивших здоровых детей выше, чем у женщин с привычным
невынашиванием в анамнезе [114]. У последних, был высокий уровень Thl-цитокина ИФН-у.
У 25% женщин с привычным выкидышем неясного генеза на трофобласте увеличивается иммунный и воспалительный ответ [166], а секреция, эмбриотоксических Thl-цитокинов значительно повышается [68, 76].
Высокие уровни провоспалительных цитокинов в периферической крови и супернатантах, культивируемых in* vitro лимфоцитов, являются неблагоприятным прогностическим критерием для развития' эмбриона в первом триместре беременности [30].
Таким образом, нарушение взаимоотношения между трофобластом и материнскими клетками, обусловленное иммунологическими механизмами, может привести к осложнениям в репродуктивном процессе.
1.2. Методы иммунотерапии при привычной)потери беременности
В связи с выявленными иммунными причинами привычной потери беременности, проведено много исследований с целью поиска путей терапии, позволяющих с помощью воздействия на иммунную систему матери сохранить беременность.
К сожалению, существующие препараты, обладающие иммуномодулирующими свойствами, не могут быть применимы во время беременности. В литературе обсуждается в основном три возможных метода иммунотерапии: активной иммунизацией аллогенными лимфоцитами (лимфоцитоиммунотерапия, ЛИТ)1 клетками мужа или донора, пассивной иммунотерапии^ - введение иммуноглобулинов и возможности иммунной терапии препаратом' дюфастон (дидрогестерон). За счет выработки под* влиянием дидрогестерона прогестерон-индуцированного блокирующего фактора, может быть снижен уровень активированных иммунных клеток.
Показаниями для проведения ЛИТ являются такие клинические симптомокомплексы, как угроза прерывания беременности, ранний и поздний токсикоз, гипоплазия хориона, плацентарная недостаточность и идиопатическая форма синдрома задержки развития плода, которые обусловлены нарушением иммунологических взаимоотношений в системе мать - плацента - плод [27].
Этот метод был предложен и использован в начале 80-х годов>[5, 6, 43, 147]. Через 5-8 дней наблюдали клинический, а через 2-4 недели -иммунокорригирующий эффект, который заключался в увеличении содержания Т-лимфоцитов, повышении их функциональной активности, а также в повышении уровней ХГ, прогестерона и эстрогенов [20, 27].
Многие исследователи полагали, что прерывание беременности, при наличии нескольких идентичных антигенов отца и матери, может быть корригировано проведением ЛИТ клетками не мужа, а от пула доноров [40, 41,42,43,44,45,54, 113, И9].
По данньїМіСеровой Л.Д. и соавт. (1997) идентичные антигены HLA-A локуса при патологии встречаются в 50-69%, а в контроле 34—44%. Идентичные антигены HLA-B локуса при патологии встречаются 30-38%, а в контроле 18-28%. Идентичность антигенов HLADR локуса при невынашивании составляет 42—71%, а в контроле 20-30%. Автор предлагает проводить ЛИТ донорскими лимфоцитами при* совместимости супругов по системе HLA по 2 и более антигенам. Привычное невынашивание беременности при совместимости по системе HLA по 2 антигенам наблюдается в 75% случаев, а при совместимости по 3 и более антигенам в 100% [13].
По данным Beer А.Е., при наличии у супруга HLA-DQ 0201 в 50% случаев наблюдали анэмбрионию [43].
Группа авторов показала [90], что после проведения ЛИТ у многих женщин в сыворотке крови были обнаружены IgM- и IgG-антитела, которые
связывались с Т- и В-клеткамш У 15% женщин, иммунизированных 2 раза клетками мужа, был получен низкий уровень блокирующих антител. Для получения ожидаемого эффекта была необходима третья иммунизация. 20% женщин было показано проведение ЛИТ клетками донора или смесью^клеток донора и мужа,, поскольку их иммунная система не реагировала на иммунизацию лимфоцитами;мужа.
ЛИТ применяется не только в; лечении привычного невынашиваниям беременности [1, 5; 20;.27, 36; 53, 56;,57, 59; 70« 85; 89; 99; 100; 109]; а также для профилактики и-лечения гестоза?[3^ 7, 32]1.
ЛИТ активирует лимфоциты матери-; для?* распознавания; антигенов эмбриона и выработки; блокирующих факторов? [56;. 70]. На фоне; ЛИТ повышается способность, выработки* цитокинов. и ростовых факторов; стабйлизируетсжгормональнаяш иммунорегуляторная;функциятрофобласта;, развивается-; процесс .плацентации; снижается;:частота раннего; токсикоза:т. гестоза;.задержки-внутриутробногоразвитияшлода;[70]1
Ироведение ЛИТ, у пациенток, с повышенным- содержанием ЄВ56* клеток повышает процент наступления; беременности в> программе ЭКО! и ИЭ[9]1
ЛИТ имеет много» как сторонников, так и противников, которые считают, что аллоиммунные взаимоотношения не могут быть причиной, невынашивания беременности [75,117,131, 138; 149].
Много групп исследователей начали включать в программу лечения ЛИТ, но получали неоднозначные результаты. В 1995г. группой экспертов от Американского общества репродуктивной иммунологии (ASRM) была сделана попытка оценить эффективность применения» ЛИТ в; лечении привычной;потери беременности;, Однако; при;проведениишульницентровых исследованиш не . были; стандартизированы, иммунологические! методы исследования-. Не: были едиными;: критерии включения: пациенток: в группу исследования, многие исследователи не учитывали первичное или вторичное
невынашивание, один и тот же партнер или нет, не были учтены противопоказания для ЛИТ (наличие аутоантител)* [20], не определяли кариотип абортуса (если происходил выкидыш), не учитывалось количество вводимых лимфоцитов и реакция на введение лимфоцитов. В результате в группе с ЛИТ и в группе сравнительной (применение симптоматической' терапии или ее полное отсутствие) получены практически однозначные исходы беременности.
Тем не менее, по многочисленным литературным данным, ЛИТ эффективно применяется1 при привычном невынашивании. Целесообразно начинать терапию с ранних сроков4 беременности. При первом проведении ЛИТ, эффективность терапии, продолжается 4-5 недель, и поэтому данный^ метод лечения1 следует повторять через.4 недели., ЛИТ активирует процесс развитияшлаценты, уменьшает случаи раннего токсикоза и гестоза; задержки, внутриутробного развития плода.
Противопоказаниями проведения ЛИТ являются аутоиммунные нарушения и заболевания:
Аллогенные лимфоциты- рекомендуют вводить от мужа или от донора, после тщательного обследования. Минимальное количество вводимых клеток составляет 40 млн. (но точно эффективная доза не установлена). Взвесь аллогенных лимфоцитов вводят подкожно^ на переднюю часть предплечья в 8-10 точек. В месте введения образуется покраснение, припухлость, небольшой зуд, который проходит через 5-7 дней. При совместимости супругов по системе HLA реакция может отсутствовать, и тогда целесообразно вводить взвесь клеток, полученных не от мужа, а от пула доноров [27].
На фоне ЛИТ улучшается, состояние беременности, уменьшаются клинические проявления угрозы прерывания, повышается' уровень ХГ, эстрогенов, прогестерона и трофобластического Р-глобулина [20^ 27]. Однако, многие вопросы при ЛИТ не решены. Нет четких критериев, кому
показана эта терапия, какие "методы могут быть критериями оценки эффективности, нет четких данных о дозе вводимых лимфоцитов. По-видимому, исследования в этом направлении должны быть продолжены.
Пассивная иммунотерапия* включает в себя внутривенно вводимый иммуноглобулин. Результаты исследований последних двух десятилетий' показали, что большие дозы иммуноглобулинов.эффективно применяют при аутоиммунных заболеваниях (аутоиммунная тромбоцитопения и- системная красная волчанка) [63].
В предшествующие годы иммуноглобулины вводили при. инфекционных заболеваниях у детей и новорожденных [51].'
Однако, была показана иммуномодулирующая* роль
иммуноглобулинов;, которым свойственны» различные* иммунологические механизмы. В* состав- иммуноглобулинов^ входят блокирующие антитела,1. которые, угнетают синтез: аутоантител, блокаду Fc-рецептора; блокаду транспорта через плаценту материнских эндогенных цитотоксических IgG; увеличивают супрессорную функцию- Т-клеток, угнетают В-клеточнукг функцию, и/или редукцию, активации- комплемента; NK-активности и продукции цитокинов [57, 91, 123, 142, 158, 162].
В последние годы иммуноглобулины стали все чаще применять в клинике привычной потери беременности, при аллоиммунных и аутоиммунных нарушениях [1, 40, 91, 158].
Было показано, что применение иммуноглобулинов повышает частоту имплантации перенесенного эмбриона и наступления, беременности после ЭКО при повышенном содержании цитотоксических CD56+ лимфоцитов (>12%) в периферической крови у женщин с бесплодием и привычными выкидышами [56].
Проведение комплексной терапии, с включением иммуноглобулинов; с целью подготовки к беременности у женщин с привычным, невынашиванием первого триместра приводит к нормализации локальных иммунных и
морфологических реакций, снижению в эндометрии количества CD56+ и CD56+CD16+ клеток, увеличению CD8 клеток [4].
Исследования показали, что применение ЛИТ или/и введение иммуноглобулинов в комплексной терапии при гестозах снижает частоту тяжелых форм гестоза, преждевременных родов и рождения детей с гипотрофией [7, 12, 159]. В то же время другие авторы не рекомендуют применение иммуноглобулинов при гестозе [121, 143].
Противопоказанием для введения иммуноглобулинов является низкий уровень IgA в крови из-за возможности развития анафилактической реакции. Этот вариант терапии также находит много противников из-за очень высокош дороговизны препаратов, возможных побочных реакций на1 иммуноглобулины и отсутствии четких критериев эффективности их применения.
В исследованиях у J. Szekeres-Bartho и соавт. (2001) было показано, что под влиянием прогестерона (дидрогестерона) CD8+ клетки продуцируют ПИБФ, который блокирует NK-активность in vitro и играет важную роль в иммунных реакциях трофобласта и эндометрия. Учитывая иммуномодулирующую роль прогестерона, во время беременности рекомендуют применение дюфастона в дозе 10мг до 16 недели беременности. Дюфастон не обладает андрогенным действием и анаболическим эффектом, обеспечивает полную секреторную активность эндометрия, способствует сохранению благоприятного действия эстрогенов на липидный профиль крови, не оказывает отрицательного действия на углеводный обмен. Показанием для применения дюфастона является привычный и угрожающий выкидыш с прогестероновой недостаточностью [27].
Противопоказанием является повышенная чувствительность» к компонентам препарата, синдром Дубина - Джонсона и синдром Ротора.
Таким образом, на сегодняшний день данные мировой литературы весьма противоречивы по иммунным аспектам невынашивания беременности
и по возможным методам терапии иммунных нарушений. В связи с этим мы полагаем, что дальнейшие исследования в этом направлении позволят получить более точные данные об эффективности ЛИТ в клинике привьлной потери беременности.
Иммунологические аспекты привычной потери беременности
До сих пор остается неясным, как эмбрион идентифицирует место имплантации [95]. Есть предполажение, что эмбрион продуцирует протеазы, растворимые молекулы, которые разрушают муцин,, воздействуют на эндометрий, подготавливая его к имплантации [120].
Процесс адгезии двух клеточных структур — эмбриона и эндометрия, осуществляется с помощью молекул адгезии. В момент имплантации ведущую роль в адгезии играют интегрины, особенно интегрин - рь экспрессия которого в. момент имплантации увеличивается; обеспечивая механические и; химические сигналы, регулируя, активность факторов роста и цитоплазматических киназ, интегрины участвуют в регуляции; жизненного цикла клеток, а также контролируют организацию цитоскелета [71]. Интегрины. связаны» с протеинами; поскольку не обладают энзиматической активностью, такими как протеины - трофинищбустин и тастин.
Эмбрион; принимает участие в;регуляции экспрессии молекул адгезии;: муцинов; хемокинов и цитоскелетньгх белков на эндометриальном? эпителии [65]. Поверхностные клетки, эндометриального;эпителия?также индуцируют молекулы адгезии, которые являются рецепторами; для лиганд на наружной трофэктодермальной поверхности бластоцисты [161].
Во время беременности происходят динамические изменения в эндометрии— процесс децидуализации. Данный процесс гормонозависимый; при котором происходит трансформация маточных фибробластов в большие клетки, которые, в свою очередь, продуцируют ростовые факторы, гормоны и компоненты матрикса, участвующие в процессе имплантации и развитии плаценты. Во время децидуализации активируются и: увеличиваются субпопуляции лимфоцитов, приобретая цитоплазматические гранулы и продуцируя І иммунные цитокины, [6 Ц;
Эти изменения в основномшроисходят на локальном уровне, но данные о состоянии: локального иммунитета эндометрия; в мировой; литературе1 чрезвычайно противоречивы [46; 50; 75, 81, 84, 103, 104; 150; 155].
В эндометрии здоровой женщины содержание иммунокомпетентных клеток повышено, и основной популяцией иммунных клеток являются лимфоциты [88]. В иммунном ответе принимают участие макрофаги, естественные киллеры (NK), Т и В лимфоциты. В эндометрии преобладают Т-лимфоциты, а количество В-лимфоцитов незначительное [75, 104, 150].
Исследования показали, что в популяции лимфоидных клеток Т-лимфоциты составляют около 4%, а макрофаги 5% [111]. Их количество возрастает, достигая около 16% в фазу поздней секреции. Макрофаги в эндометрии находятся в строме и в малых лимфоидных агрегатах. Основная роль, в обеспечении иммунологического баланса принадлежит макрофагам эндометрия, которые продуцируют простагландины, (ПР-Е2) [84, 103]. ПГ являются иммуносупрессивным фактором и во время имплантации стимулируют пролиферацию и дифференцировку децидуальных клеток эндометрия а также повышают васкуляризацику и, проницаемость, стенок, сосудов эндометрия.
Исследования показали, что среди иммунокомпетентных- клеток эндометрия клетки с антигенным маркером CD45+ в пролиферативную фазу составляют 10-15% от популяции клеток эндометрия, а в. секреторную фазу до 20-25% [46]. Клетки с антигенным маркером CD3+, обладающие цитологической активностью, в пролиферативной фазе выше, чем в секреторной [50, 81, 83]. Исследования многих авторов, изучающих субпопуляционный состав лимфоцитов эндометрия показали, что количество Т-лимфоцитов с маркером CD4+ и CD8+ клеток в пролиферативном эндометрии больше, чем в секреторном [62, 108, 156]. В работах других авторов показано; что количество этих Т-лимфоцитов выше не в секреторную, а в пролиферативную фазу [15] или что в течение менструального цикла количество Т-лимфоцитов не меняется [155]. Показано, что интраэпителиальные лимфоциты находятся между клетками покровного и железистого эпителия и большинство из них экспрессируют поверхностные маркеры CD3, CD4 и CD8. Интерстициальные лимфоциты окружены спиральными артериолами, некоторые из которых несут маркеры В-лимфоцитов. Наличие плазматических клеток в эндометрии говорит об инфекционных процессах [144]. Лимфоидные скопления находятся в базальном слое эндометрия и не отторгаются во время менструации [103].
Т-лимфоциты по поверхностным гликопротеинам делятся на Т-хелперы (CD4+) и цитоплазматические Т-лимфоциты (CD8 ). Т-хелперы под действием различных факторов дифференцируются на Th-І и Th-2. Th-1 лимфоциты отвечают за стимуляцию клеточного иммунитета, участвуют в иммунном воспалении, активируют макрофаги, продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов (ИЛ-2, ИФНу, TNFP): Th-2 отвечают за развитие гуморального иммунитета, стимулируют антителообразование, продуцируют факторы-роста ШГ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и Ш1МЗ. Полагают, что баланс между Th-Г и Th-2 имеет чрезвычайно больное значениев развитии беременности [15].
В момент имплантации, при нормально протекающей беременности, снижается уровень. CD4+ лимфоцитов- и повышается? уровень CD8+ лимфоцитов. Показано, что CD8+ клетки содержат рецепторы к прогестерону и продуцируют медиаторный белок 34-Ша, прогестерон-индуцированный блокирующий фактор (ПИБФ) [15]. Под влиянием ПИБФ снижается уровень продукции цитокинов Th-І-типа, что ведет к снижению активности NK клеток и приводит к нормальному исходу беременности. При изучении лимфоцитов в биоптатах эндометрия у 20 женщин с привычными потерями, беременности и у 15 фертильных женщин из группы контроля, было1 показано, что процент CD8+ клеток в эндометрии снижен у женщин с привычным невынашиванием беременности [67]. Полученные данные говорят о том, что CD8 выполняют супрессивную роль в локальной иммунной реакции гестационного эндометрия, особенно во» время имплантации [50, 67].
Большие гранулярные лимфоциты (БГЛ) в эндометрии представляют многочисленную популяцию среди лейкоцитов [15, 39, 47, 105, 106]. Особенность БГЛ эндометрия является активная экспрессия маркера CD56. До менструального цикла и после менопаузы БГЛ в эндометрии отсутствует, их только можно обнаружить в эндометрии у женщин репродуктивного возраста [52].
В позднюю секреторную фазу БГЛ образуют скопления вблизи желез и сосудов. В течение пролиферативной фазы менструального цикла количество БГЛ составляет 8% от всех клеток эндометрия. В середине секреторной фазы, что соответствует периоду имплантации, БГЛ составляет 60%, а в первом триместре беременности — более 70% [46, 123]. Количество БГЛ увеличивается в участках инвазии трофобласта. В течение I триместра их уровень повышается, а в третем триместре резко снижается до исчезновения при доношенной беременности [37, 79].
Клиническая характеристика обследованных женщин
Таким образом, при анализе показателей интерферонового статуса у всех женщин исследуемой группы был выявлен дисбаланс системы интерферона, который выражался повышенным уровнем сывороточного интерферона и резким угнетением продукции ИФН-а и -у. Такое состояние расценивается как интерферондефицит.
В связи с высоким уровнем цитотоксических клеток, и сывороточного интерферона в периферической крови подготовку к беременности начинали с проведения лечения индукторами интерферона.
При исследовании, интерферонового статуса определялись титры интерферона в ответ на воздействие индукторов интерферона (неовир, панавир, полиоксидоний, имунофан, иммуномакс, галавит деринат, ридостин) с соответствующим индивидуальным их подбором. Было выявлено, что у 38- (59,4%) женщин исследуемой группы имеется» более выраженная чувствительность «к имунофану, у 15 (23,4%) - к галавиту и у 11 (17,2%) женщин чувствительность была к иммуномаксу.
Имунофан в настоящее время широко известный препарат, обладающий иммуномодулирующим действием, назначали внутримышечно по» 1,0 мл 0,005% раствора 1 раз в день через 2 дня, всего 10 инъекций. Галавит обладает иммуномодулирующим, противовоспалительным действием, который назначали внутримышечно поІООмг через день, всего 5 инъекций, а затем по 100 мг 1 раз в 3 дня общим курсом до 10 инъекций. Иммуномакс, имеет иммуномодулирующее свойство. Перед употреблением содержимое флакона растворяли в 1 мл воды для инъекций, вводили внутримышечно по 100-200 ЕД 1 раз в день. Курс лечения - 6 инъекций в 1, 2, 3, 8, 9, 10 дни лечения. Через 3 недели после проведенной терапии с целью оценки ее эффективности проводилось исследование параметров интерферонового статуса (табл. 16).
У женщин исследуемой группы наблюдалось значительное снижение уровня сывороточного интерферона, фактически до нормальных значений в среднем титр составил 4,5±0,52 Е/мл. Среднее значение уровня продукции ИФН-а в ответ на индукцию вирусом болезни Ньюкасла повысилась до 63,6±2,3 Е/мл. Продукция ИФН-у при индукции лейкоцитов крови повысилась до нормальных значений и в среднем титр составил 31,4± 1,2 Е/мл.
После проведения терапии с использованием индукторов интерферона, учитывая совместимость и особенности супругов по системе HLA, в качестве заключительного этапа подготовки к беременности была проведена ЛИТ лимфоцитами от доноров, с оценкой функционального состояния иммунной системы женщины. Подготовка, к беременности: женщин с аллоиммунными: причинами привычного невынашивания; ранних сроков. проводилась лимфоцитоиммунотерапией (ЛИТ) от доноров; с использованием различных доз лимфоцитов;(50 млщ 100 млн и 150 млн клеток). Отбор доноров осуществлялся в- соответствии с приказом №364 Минздрава РФ: от 14.09-2001г. «Об утверждении порядка медицинского-обследования донора кровитее компонентов»..Из числа доноров исключили лица с вирусной активацией; частыми простудными; заболеваниями, наличием очаговхроническойинфекции.. Аллогенные лимфоциты- выделяли В; асептических условиях после забора 50 мл (от одного донора);. 1005мл (от, двух доноров)ш 150;мл (оттрех доноров) свежеконсервированноШкрови:: Противопоказаниями проведения- ЛИТ являются? аутоиммунные, нарушения и заболевания; поливалентная форма аллергии; В связи с поставленной целью, 64 пациентки; с аллоиммунными нарушениями привычного невынашивания ранних сроков- были произвольно разделены на 3 группы. ЛИТ проводили вне беременности с периодичностью один раз в месяц за 2 цикла, до предполагаемой беременности. Введение лимфоцитов осуществлялось на 5-91 день цикла однократно вг течение 2кх циклов подряд. Взвесь, аллогенных лимфоцитов? вводили подкожно, на переднюю часть предплечья в 8-10 точек. Производилась визуальная оценка местной реакции;, организмаша введениеклеточношвзвесш, Пациенткам;В группы (26гпациенток) проводили ЛИТ в количестве 50 млн клеток (от одного донора). Во-II группе (18 пациенток) проводили ЛИТ в количестве 100 млн клеток (от двух доноров). В III группу входили 20 женщин, которым проводили ЛИТ в количестве 150 млн клеток (от трех доноров). Через 3 недели после каждого введения аллоиммунных лимфоцитов была проведена оценка функционального состояния иммунной системы, и сопоставление полученных результатов с показателями до проведения ЛИТ у женщин исследуемых подгрупп при помощи критерия Уилкоксона. Относительное содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови женщин исследуемых групп после проведения ЛИТ при подготовке- к беременности представлены.в табл. 17.
Результатььгенетического обследования супружеских пар исследуемой. группы
Также наблюдалось статистически!достоверное повышение: уровня IgM при введении 50 млн г клеток - повышение уровня составило 2,4 liOj 17 r/л по сравнению с 2,29±0 31 г/л (р 0,05), при введении 100 млн клеток — повышение уровня IgM составило 2,56±0 22 г/л по сравнению с 2,09±0;28 г/л (р 0,05), при введении 150; млн клеток — повышение уровня IgM составило 2,75±0,18 т/л по сравнению с 2;11±0 18 г/л (р 0;05).
У 8 пациенток I группы после проведения II процедуры ЛИТ, не получив: снижения; уровня ЄОЗ б Іб " клеток, дополнительно назначили иммуноглобулин человеческий; нормальный для внутривенного введения в дозе 25 мл: внутривенно капельно через= день 3 раза с 6 дня; менструального цикла или октагам 2,5г двухкратно через» день.. Иммуноглобулин; воздействует: путем; модуляции реакции иммунной; системы, в; частности,, путем снижения токсической активности NK клеток. Противопоказанием для введения иммуноглобулинов является низкий уровень IgA в крови из-за возможности развития анафилактической реакции.
Во II фазу цикла всем пациенткам с целью иммуномодуляции назначался препарат дидрогестерон в дозе 10 мг 2 раза в день с 16 по 25 дни менструального цикла.
Таким образом, с помощью анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови женщин исследуемых групп при подготовке к беременности было установлено, что наиболее информативным показателем эффективности является статистически достоверное снижение уровня CD3 56 16+ клеток и соотношения CD4/CD8 клеток, и также является статистически достоверное повышение уровня CD8+ клеток и уровня» IgM, при проведении ЛИТ в количестве ЮО млн и 150 млн клеток.
Одно из направлений в работе было- посвящено поиску показателя функционального состояния "Иммунной, системы чувствительного к влиянию ЛИТ. Для этого проводилось исследование уровня реакции женских лимфоцитов на ФРА, определили уровень блокирующих факторов- (БФ) и уровень антиотцовских антилейкоцитарных антител (АОАТ).
Показатели функционального состояния иммунной системы женщин исследуемых групп после проведения ЛИТ при подготовке к беременности представлены в табл. 18.
При исследовании функции женских лимфоцитов в культуре in vitro на стандартный митоген после I процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное снижение ответа женских лимфоцитов на ФГА при введении 150 млн клеток — снижение уровня составило 177±28,1% по сравнению с 246,9±36,3% (р 0,05). Отмечено статистически не достоверное снижение ответа женских лимфоцитов на ФГА. При введении 50 млн клеток -снижение уровня было не достоверным и составило 129±53,2% по сравнению с 199,6±33,3%, при введении 100 млн клеток - снижение уровня составило 120,2±25,9% по сравнению с 184,6±45,3%. После II процедуры ЛИТ наблюдалось статистически достоверное снижение ответа женских лимфоцитов на ФГА при введение как 50s млн клеток - снижение уровня составило 114,5±77Д% по сравнению с 199,6±33,3% (р 0,05), так и при введении ЮОмлн клеток - снижение уровня составило 112,4±17,37% по сравнению с 184,6±45,3% (р 0,05), при введении 150 млн клеток - снижение уровня составило 111,4±21,63% по сравнению с 249,6±36,3%(р 0,01).
Вторым шагом было определение БФ на основе угнетения, реакции женских лимфоцитов.на стандартный митоген (ФГА) в культуре:
После I процедуры ЛИТ статистически достоверное повышение уровня БФ при введении 150 млн клеток составило 33,24±3,27% по сравнению с 16,15±6,1% (р 0,05). Статистически не достоверным было повышение уровня БФпри введении 50 млн клеток - повышение уровня составило 22,93±5,1% по сравнению с 17,68±6,39%, и при введении 100 млн клеток - повышение уровня составило 25,64±3,21% по сравнению с 16,49±5,13%.
После II процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное повышение уровня БФпри введении как 50 млн клеток - повышение уровня составило 34,76±2,42% по сравнению с 17,68±6,39% (р 0,05), так и при введении 100 млн клеток — повышение уровня составило 36,83±4,34% по сравнению с 16,49±5,13% (р 0,05) и при введении 150 млн клеток — повышение уровня составило 44,5±5,53% по сравнению с 16,15±6,1% (р 0,05)..
При определении АОАТ после I процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное повышение уровня АОАТ при введении 100 млн клеток - повышение уровня составило 39,76±6,8% по сравнению с 15,23±4,37% (р 0,05) и при введении 150 млн клеток - повышение уровня составило 43,65±11Д9% по сравненикгс 12±5,98% (р 0;01). При введении 50 млн клеток статистически достоверного повышения уровня- АОАТ не было — повышение уровня,составил о 28,09±9,49% по сравнению с 20,74±10 3%.
После II процедуры ЛИТ отмечено статистически достоверное повышение АОАТ при всех дозах лимфоцитов: при введении 50 млн клеток -повышение уровня составило 43,27±5,3% по сравнению с 20,74±10;3% (р 0,05), при введении 100 млн клеток — повышение уровня составило 45,45±13,34% по сравнению с 15,23±4,37% (р 0;05), при введении 150 млн клеток — повышение уровня составило 53,86±6,43% по сравнению с 12±5,98% (Р 0,01).
Таким образом, с помощью анализа функционального состояния иммунной системы женщин исследуемых групп при подготовке к беременности было установлено, что наиболее информативным показателем эффективности является статистически достоверное снижение ответа женских лимфоцитов на ФГА, и также является статистически достоверное повышение уровня БФ и АОАТ, при проведении ЛИТ в количестве 100 млн и 150 млн клеток.
На основании проведенных исследований установлено, что- после I процедуры ЛИТ в количестве 50 млн клеток в I группе женщин снижение уровня CD3 56+16+ клеток, повышение уровня5 БФ и выработка АОАТ произошло только у 8 женщин, у которых до проведения ЛИТ наблюдалось совместимость супругов по 3 антигенам системы HLA, уровень CD3 56+16+ клеток не превышал 20%, а также после проведения терапии индукторами интерферона наблюдалось снижение сывороточного интерферона до нормальных значений. Во II группе после I процедуры ЛИТ в количестве 100 млн клеток снижение уровня CD3 56+16+ клеток, повышение уровня БФ и выработка АОАТ произошло только у 12 женщин, у которых до проведения ЛИТ наблюдалось совместимость супругов по 4—5 антигенам системы HLA, уровень CD3 56+16+ клеток не превышал 23%, а также после проведения терапии индукторами интерферона наблюдалось снижение сывороточного интерферона до нормальных значений. В III группе — из 20 женщин, которым проводили ЛИТ в количестве 150 млн клеток эффективность получили у всех.
Проведение ЛИТ и оценка функционального состояния иммунной системы при подготовке к беременности женщин с привычнымневынашиванием ранних сроков
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы при лечении невынашивания беременности, частота этой патологии остается достаточно высокой и не имеет особой тенденции к снижению.
Частота привычной потери беременности составляет 2—5% от всех желанных беременностей, и риск потери беременности увеличивается после двух предшествующих прерываний [137, 148].
Большинство привычных выкидышей ранних сроков беременности обусловлено иммунологическим отторжением плода как аллотрансплантата, чужеродного для матери вследствие экспрессии отцовских антигенов.
К аллоиммунным механизмам потери беременности относят совместимость супругов по системе HLA, высокий уровень NK клеток в периферической крови, повышенный уровень провоспалительных цитокинов и отсутствие блокирующих факторов в сыворотке крови матери.
В распознавании иммунной системой аллогенных и полуаллогенных клеток и индукции реакции отторжения трансплантата основная роль принадлежит генам МНС (Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости). Комплекс генов МНС находится на коротком плече 6-ой хромосомы человека и кодирует поверхностные клеточные антигены HLA, которые играют решающую роль для антигенспецифических взаимоотношений клеток [24]. Наиболее изученными считаются классические антигены I класса, состоявшие из локусов HLA-A, -В, -С и их серологически выявляемых антигенов, которые реагируют с Т-цитотоксичными клетками (CD8+) [96, 163], и антигены II класса, состоявшие из локусов HLA-DR, DQ (а и р), которые взаимодействуют с Т- хелперами (CD4+), и играют основную роль в иммунном распознавании и взаимодействии иммунокомпетентных клеток [71, 101]. Антигены системы HLA I и II классов на трофобласте не экспрессируются, но экспрессирует антиген HLA-G плода, который представляет пептид Т-клеткам [69].
В организме матери плод является аллотрансплантатом, несущий набор антигенов матери и отца. Во время, беременности эмбрион не отторгается за счет повышения супрессорной активности лимфоцитов и появления блокирующих антител к антигенам, наследуемым от отца. Во время беременности снижение уровня блокирующих факторов в крови, может привести к потере беременности [13, 44, 48]. У женщин с ранними потерями беременности наблюдается увеличение в субпопуляции цитотоксических CD16+, CD56+ и CD3"56+16+ клеток, что может способствовать прерыванию беременности даже у тех пациенток, чьи абортусы имеют нормальный хромосомный набор [36, 58, 67, 127, 164]. Еще один аллоиммунный механизм прерывания беременности основан на эмбриотоксическом влиянии цитокинов ТЫ-типа, таких как ИФН-у и ФНО-а [68]. Приблизительно у 25% женщин с необъяснимым привычным выкидышем, обнаружена повышенная секреция эмбриотоксических ТЫ цитокинов [68, 76, 166]. В- настоящее время эффективным методом лечения аллоиммунных нарушений является лимфоцитоиммунотеапия (ЛИТ) аллогенными лимфоцитами, которая позволяет изменить состояние иммунной системы у матери с целью рождения живого и здорового ребенка. На основании многочисленных исследований показано успешное применение ЛИТ в комплексном лечении привычного невынашивания беременности [1, 5, 20, 27, 36, 53, 56, 57, 59, 70, 85, 89, 99, 100, 109]. В нашей стране первые работы по проведению- ЛИТ принадлежат В.И. Говалло и В.М. Сидельниковой (1983). В результате проведения ЛИТ было получено уменьшение клинических проявлений угрозы прерывания беременности, повышение уровня ХГ, эстрогенов, прогестерона и трофобластического Р-глобулина. Значимые результаты получил по использованию ЛИТ в лечении пациентов с привычной потерей беременности Beer А. в 1978г., и первым представил свою теорию иммунологических аспектов невынашивания беременности. ЛИТ активирует лимфоциты матери для распознавания антигенов эмбриона и выработки блокирующих факторов [56, 70]. На фоне ЛИТ повышается способность выработки регуляторных цитокинов и ростовых факторов, стабилизируется гормональная и иммунорегуляторная функция трофобласта, адекватно развивается процесс плацентации, снижается частота раннего токсикоза и преэклампсии, задержки внутриутробного развития плода [70]. В отношении эффективности проведения ЛИТ есть много противников, полагающих, что иммунные нарушения, в том числе аллоиммунные и совместимость супругов по системе HLA не играют роль в прерывании беременности и ЛИТ не дает терапевтического эффекта [75, 117, 131, 138, 149]. На сегодняшний день- данные мировой литературы весьма противоречивы по иммунным аспектам невынашивания беременности, и по возможным методам терапии иммунных нарушений.
Целью настоящего исследования являлась оптимизация метода лимфоцитоиммунотерапии и оценка ее эффективности при подготовке и в первом триместре беременности у пациенток с аллоиммунным генезом привычной потери беременности.
В соответствии с поставленными целями в данной работе была проведена оценка влияния различных доз аллоиммунных лимфоцитов на функциональное состояние иммунной системы и репродуктивную систему, для решения вопроса об эффективности проведения ЛИТ у женщин с привычным невынашиванием беременности аллоиммунного генеза.
Критериями отбора в основную группу являлись: привычное невынашивание беременности (в анамнезе 2 и более самопроизвольных выкидышей в первом триместре); совместимость антигенов системы HLA у супругов (3 и более идентичных антигенов);, повышенное содержание NK клеток и сывороточного интерферона в периферической: крови; отсутствие изменений в показателях аллогенной стимуляции лимфоцитов in vitro и выработки антиотцовских антилейкоцитарных антител.
![Коррекция системы гемостаза у беременных с синдромом потери плода в III триместре беременности [Электронный ресурс]](/i/i/4586/187678.png "Коррекция системы гемостаза у беременных с синдромом потери плода в III триместре беременности [Электронный ресурс] Зинченко Ирина Валентиновна")
