Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 16
Глава II. Материалы и методы исследования 59
Глава III. Анализ медико-демографической ситуации, гинекологической заболеваемости и распространенности неспецифических инфекционных заболеваний влагалища 77
3.1. Изучение медико-демографических показателей в группе женщин репродуктивного возраста г. Перми 78
3.2. Особенности регистрации гинекологической патологии и распространенность неспецифических инфекционных заболеваний влагалища 92
Глава IV. Клинические проявления неспецифических инфекционных заболеваний влагалища 101
4.1. Анамнестическая характеристика обследованных пациенток 102
4.2. Особенности клинических проявлений при иеспецифических инфекционных заболеваниях влагалища 116
4.3. Инфекционно-воспалительные заболевания влагалища бактериально-грибковой этиологии в эксперименте 127
Глава V. Клинико-микробиологическая характеристика состояния вагинальной экосистемы при неспецифических инфекционных - заболеваниях влагалища 134
5.1 Бактериоскопические критерии оценки состояния вагинального биотопа при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища 135
5.2. Цитологическая характеристика вагинального отделяемого 137
5.3. Особенности качественного и количественного состава микрофлоры влагалища при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища 141
Глава VI. Особенности противоинфекционнои защиты при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища 159
6.1. Сравнительный анализ фагоцитарных реакций крови и вагинального отделяемого условно здоровых и женщин, страдающих неспецифическими инфекционными заболеваниями влагалища 159
6.2. Характеристика гуморальных факторов неспецифической резистентности при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища 164
6.3. Особенности клеточного звена иммунитета при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища 166
6.4. Особенности гуморального звена системного иммунитета 168
6.5. Особенности цитокинового статуса при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища 180
Глава VII. Экспериментальное обоснование совершенствования диагностики неспецифических инфекционных заболеваний влагалища 198
7.1. Кристаллография влагалищной жидкости в дифференциальной диагностике вагиноза и вагинита 199
7.2. Характеристика морфофункционального состояния С. albicans при различных формах кандидозной инфекции 206
7.3. Экспериментальное исследование влияния рН среды на рост С. albicans и антифунгальное действие препарата «Микосист» 215
7.4. Экспериментальные исследования по изучению фармакодинамики антимикотических препаратов 226
Заключение 234
Выводы 252
Практические рекомендации 254
Список литературы 256
Приложение 308
- Изучение медико-демографических показателей в группе женщин репродуктивного возраста г. Перми
- Цитологическая характеристика вагинального отделяемого
- Особенности цитокинового статуса при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища
- Экспериментальные исследования по изучению фармакодинамики антимикотических препаратов
Введение к работе
Актуальность проблемы
В Российской Федерации с начала 90-х годов ХХ в. на фоне социально-экономического кризиса происходило ухудшение здоровья населения, уменьшение его численности за счет выраженного снижения показателей рождаемости (О.Г. Фролова, 2005; Д.А. Халтурина, 2006; Е.Е. Григорьева, 2007; В.Е. Радзинский, 2007). В сложившейся демографической ситуации охрана репродуктивного здоровья является одним из приоритетных медико-социальных направлений. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ситуация, связанная с заболеваниями, приводящими к этой патологии, является следствием недостаточной научной разработанности вопроса, а также различий в методологических подходах (Ю.А. Соловьева, 2009). В связи с этим ВОЗ предложена программа научных исследований ''Репродукция человека'', основным направлением которой является изучение факторов, негативно влияющих на репродуктивное здоровье и вызывающих бесплодие (World Health Organisation, 1995).
Многочисленными исследованиями последних лет показано, что инфекционно-воспалительные процессы, в частности во влагалище, участвуют в развитии акушерско-гинекологической патологии, определяющей не только здоровье матери, но и плода (В.Л. Титюнник, 2003; А.С. Анкирская, 2006; Г.Р. Байрамова, 2007; J.C. Carey, J. Haut, 2000; M.F. Cotch, 2000). В клинике заболеваний прослеживаются две тенденции: во-первых, несоответствие тяжести внешних проявлений и уровня патологических изменений в репродуктивной сфере, во-вторых, невысокая эффективность проводимого лечения, ведущая к фульминантному течению с летальным исходом либо к хронизации процессов. Их причины и механизмы формирования еще предстоит расшифровать (Хмельницкий О.К., 2000; А.Н. Никонов, О.Р. Асцатурова, 2006; В.Н. Прилепская, 2007; А.Л. Тихомиров, 2007).
Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие существенно изменилась, что связано с постоянной эволюцией бактерий и вовлечением в патологические процессы условно патогенных микроорганизмов (Е.Б. Рудакова, 2004; А.С. Анкирская, 2006; M. Kretschmar, A. Hem, 2000; C.S. Bradshaw, S.N. Tabrizi, 2006). В связи с двойственной природой последних – условно-патогенные микроорганизмы (УПМ) в качестве комменсалов присутствуют в составе нормальной микрофлоры здоровых людей, а также регистрируются как этиопатогены при различных местных и генерализованных процессах – у клиницистов нередко возникают сложности при оценке результатов обследования, определении целесообразности назначаемого лечения и выборе лекарственных препаратов (Побединский Н.М., О.А. Аксенова, 2006; А.Л. Тихомиров, 2007; Ю.Э. Доброхотова, 2008; J.E. Leigh, K. Shetty, 2004; J.R. Schwebke, R.A. Desmond, 2007). В диагностике неспецифических инфекций до последнего времени решающее значение при определении этиологической значимости придавалось численности обнаруженных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микстинфекции – установлению количественных соотношений между ассоциантами. Однако многими исследователями (А.А. Евсеев, 2007; J.R. Naglik at al., 2003 и др.) в подобных ситуациях зачастую более существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности. Ценность этого критерия повышается при выявлении не одного, а нескольких факторов вирулентности, и особенно в патогенетически значимой дозе и/или уровне активности. Решение вопроса об этиологической роли УПМ в очаге поражения облегчается при выяснении ответной реакции макроорганизма в зоне первичной колонизации, поскольку степень реактивности и динамические изменения показателей локальных факторов неспецифической защиты в существенной мере отражают «поведение» условного патогена как комменсала или возбудителя инфекционного процесса. Комплексный подход, учитывающий как биологические особенности УПМ, так и специфику локальной ответной реакции макроорганизма, разработка новых информативных и доступных для практики критериев, позволяющих определить роль изолируемых штаммов в патологическом процессе при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища (НИЗВ), представляется актуальной и насущной проблемой.
Цель исследования
совершенствование оказания гинекологической помощи женщинам репродуктивного возраста с учетом социальных, клинико-микробиологических и диагностических особенностей неспецифических инфекционных заболеваний влагалища.
Задачи исследования
-
Проанализировать медико-демографические показатели здоровья, основные тенденции и закономерности репродуктивного поведения и развития заболеваний репродуктивной сферы женщин фертильного возраста.
-
Провести анализ состояния организации учета и оказания медицинской помощи при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища и обосновать необходимость их оптимизации
-
Изучить особенности клинических проявлений и характера течения патологических процессов, ассоциированных с неспецифическими инфекционными заболеваниями влагалища и установить взаимосвязь со спецификой микробного фактора.
-
По результатам клинического и микробиологического исследования выделить основные клинико-микробиологические варианты неспецифических заболеваний влагалища.
-
Усовершенствовать и разработать новые критерии оценки состояния вагинального биотопа по микробному фактору.
-
Оценить состояние клеточного и гуморального звена иммунитета с учетом состояния микробиоты влагалища.
-
Разработать методические подходы к диагностике и интерпретации результатов анализа при обследовании на неспецифические инфекционные заболевания влагалища.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Впервые на основании анализа многолетних данных официальной статистики, оригинальных форм учета заболеваемости, разработанных и апробированных на базе крупного акушерско-гинекологического комплекса, раскрыты основные механизмы мобилизации резервов репродуктивного здоровья и обоснованы подходы к их реализации.
Впервые на основе комплексного клинико-лабораторного и экспериментального исследования сформулирована гипотеза о преимущественном формировании кандидоносительства при присоединении кандидозной инфекции к бактериальному вагинозу (БВ) и «истинного» вульвовагинального кандидоза (ВВК) при сочетании с неспецифическим вульвовагинитом.
Впервые проведена оценка состояния вагинального биоценоза с использованием экологического подхода на основе индексов, характеризующих микробное разнообразие с учетом долевого участия облигатных и транзиторных видов микроорганизмов. Это позволило предложить классификацию видов микроорганизмов в вагинальном биотопе: доминантные, субдоминантные, малозначимые.
На основании интегральной оценки состояния микробиоценоза влагалища определены характерные дефекты противоинфекционной защиты, показано преимущественное нарушение локальных механизмов колонизационной резистентности и установлены особенности взаимодействия основных звеньев местного иммунитета при различных формах НИЗВ.
Показано, что на этапе скрининга для идентификации выделенного штамма в качестве возбудителя инфекции, наряду с определением степени обсемененности анализируемого образца, целесообразно изучение патогенных свойств выделенных микроорганизмов, которые различны у соименных видов, вызывающих заболевание и входящих в норме в состав представителей транзиторной или облигатной микрофлоры организма-хозяина (Патент на изобретение №2280866 «Способ диагностики вагинального кандидоза». Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июля 2006 г.).
Впервые для дифференциальной диагностики НИЗВ предложен метод исследования кристаллограмм вагинального секрета, характеризующий изменение влагалищной жидкости, как интегрального показателя реакции макроорганизма на инфекционный процесс различной этиологии (Патент на изобретение №2351931 «Способ дифференциальной диагностики бактериального вагиноза и неспецифического вагинита». Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 апреля 2009 г.).
Впервые показано, что эффективность терапии НИЗВ зависит как от особенностей фармакокинетики используемых препаратов, так и от состояния вагинальной среды, в частности, рН влагалищной жидкости.
Практическая значимость работы
На основании анализа существующих статистических форм рекомендована регистрация БВ и неспецифического вульвовагинита (НВВ) как самостоятельных нозологических форм и предложены шифры, которые могут быть использованы для статистического учета данных заболеваний. Предложена оригинальная схема учета НИЗВ, в том числе при различных сочетаниях, как со специфическими, так и неспецифическими инфекциями.
Обоснован новый подход к дифференциальной диагностике состояний, ассоциированных с кандидозной инфекцией влагалища. Характеристика изолированных штаммов с использованием предложенного оригинального коэффициента вирулентности может служить одним из достоверных критериев при решении вопроса: является ли выделенная культура C. albicans этиопатогеном или комменсалом в составе микрофлоры влагалища. Такой подход позволит рационализировать выбор этиотропной терапии, исключая необоснованное использование антимикотиков при кандидоносительстве (Патент на изобретение №2280866 «Способ диагностики вагинального кандидоза». Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июля 2006 г.).
Показано, что компьютерные технологии при оценке этиологической значимости УПМ придают применяемым методикам экспрессность и повышают их объективность. Использование методов компьютерной морфометрии позволяет не только производить измерения в автоматическом режиме, но и систематизировать, подвергать статистической обработке, архивировать аналитические данные, что в значительной степени облегчает микробиологический мониторинг инфекций, ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами.
Использование кристаллографии влагалищной жидкости является не только простой в исполнении и обоснованной с экономической точки зрения, но и дает возможность документировать полученные результаты и сопоставлять изображения образцов при повторных исследованиях, что позволит оценить динамику инфекционного процесса и эффективность проводимого лечения.
Выявленная в работе специфика репродуктивного здоровья и поведения женщин фертильного возраста позволит выработать на региональном уровне стратегию оказания профилактической и лечебно-диагностической помощи женскому населению, ориентированную на разные возрастные группы.
Положения, выносимые на защиту
-
В современных условиях процессы репродукции реализуются на фоне депопуляции и увеличения удельного веса женщин позднего фертильного возраста. При этом неспецифические инфекционные заболевания влагалища представляют один из ведущих факторов риска в формировании региональной типологии репродуктивного здоровья.
-
Возникновение неспецифических инфекционных заболеваний влагалища обусловлено состоянием макроорганизма (предшествующей генитальной и экстрагенитальной патологией) и сексуальным поведением, а особенности развития (течения) инфекционного процесса - видом доминирующего микроорганизма, компонентным составом микробных ассоциаций, обусловливающим эффекты синергизма-антагонизма в формирующемся биоценозе.
-
При различных неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища изменения клеточного и гуморального звена иммунитета, регистрируемые на системном уровне, не отличаются специфичностью и достоверно незначимы. Своеобразие клинических проявлений связано с особенностями локальной иммунологической реактивности, обеспечивающей колонизационную резистентность во влагалищном биотопе.
-
В дифференциальной диагностике неспецифических инфекционных заболеваний влагалища, при назначении медикаментозной терапии и верификации излеченности, а также определении этиологической значимости изолированных условно-патогенных микроорганизмов целесообразна комплексная оценка их функциональной активности, состояния среды вагинального биотопа и фармакокинетики назначаемых препаратов.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследований использованы при разработке методических рекомендаций регионального уровня «Микробиологическая диагностика вульвовагинального кандидоза» (2006) и учебного пособия «Иммунотерапия инфекций, передаваемых половым путем» (УМО, 2006).
Основные положения, изложенные в диссертации, внедрены в учебный процесс кафедр микробиологии и вирусологии, эпидемиологии, акушерства и гинекологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, а также кафедры акушерства и гинекологии ГОУ ВПО «Кировская ГМА Росздрава».
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лечебно-профилактических учреждений города Перми и Пермского края, центра планирования семьи (г. Екатеринбург), ГЛПУ «Кировский областной клинический перинатальный центр» (г. Киров).
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
городской конференции акушеров-гинекологов (Пермь, 26 марта 2009);
XIV Международной выставке «Медицина и здоровье-2008» (Пермь, 12–15 ноября 2008);
Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Чита, 1-2 октября 2008);
Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2-3 октября 2008);
Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии в постдипломном образовании врачей» (Омск, 17 сентября 2008);
12-ой Поволжской научно-практической конференции акушеров-гинекологов «Пути сохранения репродуктивного здоровья женщин» (Волгоград, 30-1 июля 2008);
Междисциплинарной научно-практической конференции (Пермь, 21 марта 2008);
научной сессии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е.А. Вагнера (Пермь, 22 апреля 2008);
Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы репродуктивного здоровья и безопасное материнство» (Пермь, 15-16 мая 2007);
Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 4-7 декабря 2006);
II конференции иммунологов Урала (9-12 сентября 2002).
Всего по материалам диссертации сделано 11 докладов, в том числе 1 – международного и 4 – федерального уровня.
Диссертационная работа апробирована на заседании научного координационного совета по акушерству и гинекологии ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава.
По материалам диссертации опубликовано 44 печатных работы, в том числе: 11 – в изданиях, рекомендованных экспертным советом ВАК по медицине для опубликования результатов исследований по докторским диссертациям. Патенты на изобретения – 3.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста, иллюстрирована 67 рисунками и 86 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав собственных наблюдений, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 321 работу отечественных и 220 работ зарубежных авторов.
Личный вклад
Сбор информации, ретроспективный анализ демографических и эпидемиологических показателей выполнены лично автором. Все клинические исследования, включая их планирование, проведение, анализ, обобщение и обработку полученных результатов, внедрение рекомендаций с оценкой их эффективности, проведены автором в полном объеме. Все бактериологические исследования и значительная часть иммунологических исследований, с последующим анализом их результатов и статистической обработкой, проводились автором и сотрудниками подведомственной лабораторной базы. В работу вошли результаты исследований, проведенных совместно с Н.В. Чемурзиевой, Д.Ю. Сосниным, Ю.Л. Касаткиной, Н.С. Авдеевой, М.Г. Машуровым, Е.В. Трухиной, Е.В. Бабушкиной.
Изучение медико-демографических показателей в группе женщин репродуктивного возраста г. Перми
Решение общегосударственных задач имеет свои особенности на конкретных территориях. Для оценки демографической ситуации в таком крупном промышленном городе, как г. Пермь, использованы данные официальной статистики отдела переписи населения и демографической статистики РОСТАТа Территориального органа Федеральной государственной службы государственной статистики по Пермскому краю (ПЕРМЬСТАТ).
Современную демографическую ситуацию в г. Перми, как и в целом по России, скорее можно охарактеризовать как кризисную. Это проявляется в продолжающемся с начала 1990 превышении числа умерших над количеством родившихся. Ряд политических и экономических решений привели к положительным изменениям, так, за последние три года наметилась тенденция повышения рождаемости. Следует отметить, что это зависит в значительной мере от половозрастного состава населения, а именно от доли женщин, находящихся в активном репродуктивном возрасте. Анализ динамики численности населения показывает, что за 17 лет (1990 — 2007 гг.) оно снизилось на 103 850 чел., что подтверждается при определении прямолинейной тенденции многолетней динамики численности населения (рис. 3.1, 3.2). Наиболее выраженное снижение наблюдали в середине 90-х годов. Так, в 1994 г. население уменьшилось на 10 251 чел., в 1995 г. - на 25 797 чел., в 1996 г. - на 10 430 чел., что связано " с политическими, социальными и экономическими изменениями в стране в целом.
Интерес представляет изучение группы женщин фертильного возраста, к которой, по критериям ВОЗ, относят женщин в возрасте от 15 до 49 лет. За период с 1990 по 2007 гг. отмечается незначительное увеличение этой группы на 5192 чел. Снижение числа девочек в возрасте от 0 до 14 лет на 61596 чел. (рис. 3.5) и девушек-подростков от 15 до 18 лет на 10 220 чел. сочеталось с увеличением женщин позднего репродуктивного возраста (46-49 лет) на 10831 чел. Это свидетельствует о старении женщин фертильного возраста и является неблагоприятным фактором для воспроизводства населения.
Для изучения демографической ситуации был проведен анализ рождаемости, которая относится к основным демографическим процессам и в решающей степени определяет характер воспроизводства населения. Наиболее низкий уровень рождаемости отмечен в период с 1993 по 1995 гг. В последующем наблюдалось постепенное ее повышение, однако показатели не достигали уровня 1990 г. (рис. 3.6). Уменьшение рождаемости и увеличение смертности привело к естественной убыли населения, начиная с 1992 г. (рис. 3.7).
Как видно из данных, представленных на рис. 3.8, количество женщин фертильного возраста и показатель рождаемости имеют среднюю степень отрицательной корреляционной зависимости. За период с 1990 по 2002 гг. отмечали увеличение числа женщин фертильного возраста. Однако в 1990 г. при относительно низком количестве представительниц данной группы наблюдали достаточно высокий показатель рождаемости - 12,6 на 1000 населения, а в 2002 г. количество женщин фертильного возраста достигает своего максимального значения, при этом показатель рождаемости падает до 10,3. Несмотря на продолжающееся снижение численности женщин репродуктивного возраста, за последние четыре года появилась стойкая тенденция к повышению рождаемости. Вероятно, это связано со стабилизацией политической и экономической ситуации в стране, а также с внедрением различных программ, направленных на улучшение демографической ситуации, в частности с введением «материнского капитала».
Нельзя не подчеркнуть, что репродуктивную функцию реализует лишь незначительная часть женщин фертильного возраста. Например, в 2006 г. родили только 3,9% женщин, в 2007 г. - 3,6%, что свидетельствует о чрезмерно низкой интенсивности деторождения. Для объяснения столь неблагоприятной ситуации немаловажное значение имеет изучение факторов риска, воздействующих в целом на уровень рождаемости. К ним относятся наряду с социально-экономическими, психологическими также медицинские. Нами всесторонне исследовано влияние на процессы рождаемости в г. Перми тактики планирования семьи, в том числе количество абортов, применение эффективных средств контрацепции, бесплодие и др.
В г. Перми в последние годы отмечается снижение абсолютных и относительных показателей, особенно важно, что такая же тенденция отмечается и в группе 15-19 лет, которая составляет репродуктивный потенциал (рис. 3.9, 3.10). Удельный вес первобеременных среди всех прерываний беременности снижается и составляет 18,8% в 2002 г. и 12,9% - в 2008 г.
Одним из последствий большого числа искусственных абортов в популяции является сохранение высокого уровня материнской смертности в стране, поскольку среди ее причин в России 18,5% (2002 г.) составляют именно аборты. Показатели материнской и перинатальной смертности повышаются у женщин в юном и старшем репродуктивном возрасте, при интервалах между беременностями менее 2 лет, большом числе абортов в анамнезе [7]. В г. Перми отмечено снижение показателей перинатальной (2000 г. - 10,8, 2008 г. - 7,4 на 1000 родившихся живыми и мертвыми) и материнской (2002 г. - 32,6, 2008 г. - 15,2 на 100 000 живорожденных) смертности, что согласуется со снижением количества прерываний беременности.
Как известно, НИЗВ являются фактором риска для развития инфекционных послеабортных осложнений. Хотя в 2005-2008 гг. произошло снижение общего числа прерываний беременности на 28,7%, количество осложнений остается на одном уровне. При этом нельзя не учитывать недостатки статистического учета послеабортных осложнений. Несовершенство формы статистического учета, сокрытие случаев гнойно-септических заболеваний, отсутствие расшифровки в группе «прочие осложнения» не только затрудняет подробный анализ структуры послеабортных осложнений, но и не позволяет оценить их влияние на репродуктивное здоровье.
С целью определения инфекционных факторов риска возникновения эндометритов нами выполнено исследование типа случай-контроль. Проведен ретроспективный анализ историй болезни 58 пациенток (I группа) с инфекционно-воспалительными осложнениями после медицинского аборта и 32 карт (II группа) пациенток, у которых прерывание беременности не сопровождалось осложнениями. Группы были сопоставимы по характеру менструальной функции и сексуальной активности. Следует отметить, что в исследование были включены только больные, которым вмешательство было проведено в ЛПУ, в сроке до 12 недель беременности, по желанию женщины, пациентки с самопроизвольными, криминальными, неуточнеными абортами в исследование не входили. Сочетание послеабортного эндометрита и остатков плодного яйца было выявлено у 27 пациенток I группы (46,6%).
Данные акушерско-гинекологического анамнеза представлены в табл. 3.1, 3.2. Пациентки I группы были старше, имели большее количество беременностей, чаще (72,4%) повторных. В данной группе достоверно чаще встречались осложнения в течение беременности и родов, послеродовые и послеабортные гнойно-септические осложнения, гинекологические заболевания. Особенно высока была доля инфекционных заболеваний: так, ИППП отметили 44,8% обследуемых, НИЗВ - 84,5%, ВЗОМТ - 67,2%. Большее число пациенток указывали на эктопию шейки матки — 58,6%, которая, как известно, также часто сопровождается воспалительным процессом в цервикальном канале (хр. цервицит). Приведенные данные свидетельствуют о том, что ВЗОМТ являются фактором риска развития послеабортных осложнений.
При подготовке к медицинскому аборту пациентки проходят обследование, которое включает бактериоскопическое исследование влагалищного отделяемого. При анализе данных выявлено, что санацию влагалища перед операцией проводил 21 чел. (36,2%) I группы и 6 чел. (18,8%) II группы. Изучение результатов бактериоскопического исследования вагинального отделяемого (табл. 3.3) показало, что только в 29,3%о случаев, у пациенток I группы, состояние микробиоценоза влагалища можно было характеризовать как нормоценоз. Несмотря на лабораторные признаки инфекционно-воспалительного процесса во влагалище (БВ - 13 чел. (22,4%), НВВ - 28 чел. (48,3%)), пациенткам было проведено оперативное вмешательство. Во II группе у 81,3% регистрировали нормоценоз, 18,7% -НВВ.
Цитологическая характеристика вагинального отделяемого
ВЖ рассматривается как интегральная среда, по составу которой прямо или косвенно можно судить о состоянии всех отделов репродуктивной сферы. Более того, динамика некоторых биохимических и биофизических показателей нередко служит основой для понимания закономерностей формирования патологических процессов [180]. Влагалищное содержимое состоит из жидкостного и клеточного компонентов, слизи, продуцируемой цервикальными железами, транссудата, десквамированного эпителия влагалища и матки, лейкоцитов и микроорганизмов. Гликоген лизированных клеток поверхностного слоя является пластическим и энергетическим субстратом (практически единственным) для резидентной микрофлоры. Синтез молочной кислоты не является конечным результатом взаимодействия микрофлоры и эпителиальных клеток. Цикличность созревания вагинального эпителия - гормонозависимый процесс, который реализуется через фермент лактатдегидрогеназу (ЛДГ). ЛДГ воздействует на молочную кислоту, превращая её в пировиноградную кислоту, которая, в свою очередь, является субстратом для следующего цикла глюконеогенеза [116]. Изменение состава микрофлоры приводит к изменению функционирования данной системы. Изучение особенностей клеточного состава ВЖ при различных изменениях состава облигатной и транзиторной микрофлоры представляли для нас большой интерес.
Как известно, клеточный состав содержимого влагалища представлен в основном эпителиальными клетками и лейкоцитами. Результаты цитологического исследования у пациенток с НИЗВ представлены в приложении (табл. 12). Для характеристики клеточного состава мы использовали следующие показатели: количество лейкоцитов (КЛ), количество эпителиальных клеток (ЭК), сумма клеток (СК), цитологический коэффициент (ЦК, ЦК=КЛ/КЭ).
Среднее КЛ в группе здоровых составило 3,6±1,01, число ЭК - 3,7±1,03, СК-7,3±1,66,ЦК составил 1,0±0,3 5.
У женщин-кандидоносителей КЛ и ЭК в среднем составило 4,2±0,97 и 4,2±0,93 в поле зрения, СК - 8,4±1,69 единиц в поле зрения, а ЦК - 1,0±0,21.
При БВ (III группа) отмечено увеличение ЭК (р 0,05) при нормальном КЛ по сравнению с I группой. ЦК был достоверно (р 0,05) наименьшим по сравнению с другими группами 0,6±0,12 (от 0,3 до 0,86). Повышение числа слущивающихся эпителиальных клеток объясняется снижением или полным отсутствием лактобактерий, что приводит к уменьшению количества молочной кислоты и повышению рН. В результате смещения рН создаются оптимальные условия для увеличения активности гидролитических и протеолитических ферментов. Нейтральная среда является оптимальной для функционирования таких ферментов, как амилаза, расщепляющая гликоген, сиалидаза, муциназа и пролинаминопептидаза, осуществляющие деградацию белковых макромолекул коллагена. Кроме того, щелочная реакция способствует снижению уровня ионизированного кальция во ВЖ. Эти процессы приводят к нарушению межклеточных взаимоотношений в глубоких слоях эпителия влагалища. В результате чего происходит активация процессов клеточной дезинтеграции, и, как следствие, наступает избыточная десквамация клеток, в том числе и жизнеспособных. Известно также, что цитолитическим действием обладает эндотоксин грамотрицательных анаэробных бактерий. Кроме того, гемолизин гарднерелл и сукцинат, продуцируемый бактеридами, обладают синергетическим эффектом и подавляют функции лейкоцитов, что может также блокировать развитие воспалительной реакции при БВ.
У пациенток IV группы выявляли значительное увеличение исследуемых цитологических показателей, причем их значения были максимальными среди всех пациенток с НИЗВ (р 0,05).
КЛ, ЦК при остром ВВК было сопоставимо с группой здоровых и кандидоносителей, а хроническая форма характеризовалась достоверным увеличением КЛ, СК, ЦК. В обеих группах отмечено достоверное повышение числа ЭК. Распределение показателей в V группе свидетельствует об отсутствии воспалительной реакции при острой форме кандидоинфекции, в противоположность этому величина ЦК (3,0±0,50), как результат возрастания доли лейкоцитов, является признаком воспалительного процесса.
У пациенток VII группы отмечали повышение КЛ, ЭК, СК по сравнению с I и III группой (р 0,05), а ЦК достоверно превышал только показатели при БВ. Как и при изучении микроскопической картины, были выделены две подгруппы: Vila: КЛ - 8,8±5,07, количество ЭК - 11,9±2,88, СК - 21,6±7,41, ЦК - 0,8±0,45; VIIB: КЛ - 19,9±5,02, количество ЭК - 14,3±2,72, СК - 34,3±7,41, ЦК - 1,4±0,37.
Показатели у пациенток VIII группы достоверно выше, чем в группе здоровых, а при сопоставлении данных с острой кандидозной моноинфекцией достоверно снижены были КЛ, ЭК, СК. ЦК достоверно превышал уровень в группе здоровых, но был сопоставим с IV группой. Цитологическая картина внутри группы была неоднородна, что позволило сформировать две подгруппы.
Villa: КЛ - 50,0±15,38, количество ЭК - 16,2±4,30, СК - 65,3±18,80, ЦК -3,1±0,62.
VIIIB: КЛ - 36,2±6,41, количество ЭК - 12,4±1,87, СК - 48,6±8,06, ЦК -2,9±0,29.
Несмотря на, казалось бы, схожесть в микробиологическом аспекте процессов, реакция макроорганизма при смешанных формах, как и в случае моноформ аэробной и анаэробной инфекции, была не одинакова. При сочетании БВ и кандидоносительства отмечено повышение КЛ, числа ЭК и СК, однако ЦК оставался меньше 1,0, что свидетельствует о преобладании ЭК в клеточном составе. В случае активации кандидозной инфекции выявлено значительное увеличение КЛ, СК и изменение ЦК (1,4±0,37), что указывает (?) на преобладание лейкоцитов над ЭК. Следовательно, мы можем говорить о более выраженном влиянии смешанной анаэробно-грибковой инфекции на влагалищный эпителий. Это, вероятно, обусловлено совместным воздействием анаэробных ферментов и фосфолипаз Candida, т.к. часть фосфолипаз имеет оптимум активности при рН 5,6-8,6. Анализ показателей ЦК показал вариабельность данных в VI группе - 0,4-1,5. В тех случаях, когда ЦК 1, в клеточном составе преобладали эпителиоциты и СК более 10, процесс связан с избыточным ростом анаэробов, продукты жизнедеятельности которых вызывают токсическое действие, не приводя к воспалительной реакции, и, как следствие, происходит цитолиз и слущивание клеток поверхностного слоя. Цитологический пейзаж подтверждает клинически выявленное- доминирование признаков БВ, а обнаруженные Candida в споровой форме лишь подчеркивают наличие дисбиотических процессов во влагалище. Активизация кандидозной инфекции на фоне БВ характеризуется ЦК больше 1,0 и суммарным количеством клеток более 20, процесс приобретает неяркий воспалительный характер на фоне токсического отторжения эпителия.
При анализе показателей в VIII группе обнаружено уменьшение числа лейкоцитов по сравнению с IV группой, причем при кандидоносительстве лейкоцитарная реакция была более выражена, чем при обострении кандидоинфекции. Значительно выше была и СК в Villa подгруппе, при этом достоверного отличия по количеству ЭК не выявлено. ЦК в обеих подгруппах превышал 1,0. Представленные данные позволяют предположить взаимодействие представителей аэробных бактерий с активными клетками грибов, что приводит к снижению реакции макроорганизма и, как следствие, изменению,- «стиранию» клинической картины как бактериальной, так и грибковой инфекции.
Смешанная форма бактериальной инфекции характеризовалась высокими показателями КЛ, ЭК, СК, ЦК, превышающими значения у здоровых и пациенток с БВ, в тоже время- при сопоставлении данных с группой НВВ уровни КЛ; СК, ЦК были достоверно снижены. Сочетание анаэробной и аэробной бактериальной инфекции приводит к уменьшению воспалительной реакции, что может свидетельствовать о депрессии местных факторов противоинфекционной защиты. Изменение колонизационной резистентности может быть связано с черезмерно высоким антигенным стимулом или, наоборот, возникновением такой кооперации бактерий, при которой антигены бактерий в меньшей степени контактируют с иммунными клетками, что не позволяет формировать адекватный иммунный ответ. Массивный выброс токсических продуктов бактериями ведет к значительному повреждению поверхностных слоев эпителия, что подтверждается максимально высоким количеством ЭК в данной группе, по сравнению с другими НИЗВ.
Особенности цитокинового статуса при неспецифических инфекционных заболеваниях влагалища
Цитокинами называют большую группу соединений, участвующих в межклеточной передаче сигналов в ходе иммунного ответа. Вопрос о содержании цитокинов в сыворотке крови, вагинальном секрете у больных с различными заболеваниями органов малого таза, в том числе инфекционно-воспалительными, а также их значении в развитии патологического процесса широко обсуждается. Однако в ряде случаев результаты исследований противоречивы.
Считают, что у здоровых женщин в генитальном тракте преобладает Th2 зависимый иммунный ответ и доминирование IL-10. Дисбаланс провоспалительных и противовоспалительных цитокинов отмечается при БВ и ВВК, однако данные исследователей значительно разнятся [82, 116, 146, 159, 243, 268, 446, 516, 512, 520, 534, 537]. Сведений об уровне цитокинов в сыворотке крови или вагинальном секрете при смешанных формах НИЗВ в доступной литературе нами не найдено. В этой связи проведено исследование, направленное на изучение особенностей цитокинового профиля в периферической крови и вагинальном отделяемом у пациенток с различными формами НИЗВ.
Полученные данные о концентрации цитокинов (IL-1, IL-2, IL-6, IL-4, TNF-a, INF-y) в периферической крови и вагинальном отделяемом у здоровых женщин были сопоставимы с результатами ранее проведенных исследований [217, 280, 304, 369, 409, 449, 519].
В группе кандидоносителей все показатели в периферической крови и во ВЖ были сопоставимы со здоровыми женщинами (приложение табл. 31, 32; р 0,05). При БВ в крови отмечено достоверное повышение уровня IL-4 (р 0,05), показатели IL-1, IL-2, TNFa, IL-6 и INFy соответствовали значениям в I группе (приложение табл. 31). Во влагалищном отделяемом выявлено увеличение IL-6, IL-4. Отсутствие изменений уровня прововоспалительных цитокинов .в крови, повышение количества IL-4 объясняют отсутствие воспалительной реакции в ответ на размножение большого количества анаэробных микроорганизмов. IL-6 подавляет продукцию IL-1, TNF-a, а также индуцирует клеточную дифференцировку и стимулирует секрецию иммуноглобулинов. «Нормальное» количество IL-1 и IL-2 не позволяет стимулировать миграцию лейкоцитов в очаг инфекции.
Значительные изменения отмечены как на системном, так и на местном уровне при НВВ (приложение табл. 31, 33). Высокие показатели провоспалительных цитокинов приводят к стимуляции фагоцитарных реакций, что ведет к усиленной миграции лейкоцитов в патологический очаг.
При острой форме ВВК все показатели в крови находились в диапазоне колебаний у здоровых пациенток. Отмечена тенденция к повышению количества IL-4 (приложение табл. 31), что может приводить к стимуляции и дифференцировке В-лимфоцитов и объяснить увеличение CD20+ клеток. В вагинальном отделяемом обнаружено достоверное снижение TNF-a, но показатели оставались на нижней границе здоровых (приложение табл. 33). Концентрация IL-4 достоверно повышалась (р 0,05). Такое соотношение провоспалительных и . противовоспалительных цитокинов с преобладанием последних кореллирует с низким содержанием лейкоцитов во влагалищном секрете, что отмечено при бактериоскопическом исследовании, и не позволяет развиться воспалительной реакции.
Хроническая форма ВВК характеризуется значительными отклонениями цитокинового статуса. Нами отмечено достоверное (р 0,05) снижение IL-1, IL-2, TNF-a и повышение IL-6, IL-4 в крови по сравнению со здоровыми пациентками (приложение табл. 31). Несмотря на это, их уровень, как и INFy, соответствовал нормальным значениям. Во влагалищном отделяемом (приложение табл. 33) регистрировали достоверное (р 0,05) снижение IL-1, IL-2, TNF-a, INFy и повышение IL-6, IL-4 по сравнению с группой здоровых. Сравнительный анализ данных у пациенток с острой и хронической формой ВВК показал, что в VI группе наблюдали уменьшение провоспалительных и нарастание противовоспалительных фракций (р 0,05).
Как известно, ТЫ продуцируют IL-1, IL-2, TNF-a, INFy, а Th2 - IL-4 [231, 249]. Учитывая вышеприведенные данные, мы можем говорить о большом значении клеточного звена иммунитета в противогрибковой защите, с активацией Th2 клеток.
В VII группе выявлено нарастание IL-1 в периферической крови, по сравнению с I группой, и IL-2, при сопоставлении с III группой. Однако несмотря на выявленные тенденции активации провоспалительных на фоне нормальных значений противовоспалительных цитокинов, их уровень находился в пределах колебаний у здоровых женщин (приложение табл. 32). Активация IL-1, IL-2, IL-6, TNF-a, INFy и депрессия IL-4 выявлена во ВЖ, показатели достоверно отличались (р 0,05) от количества соответствующих цитокинов в I и III группе (приложение табл. 34). Полученные результаты согласуются с повышением числа лейкоцитов, IgG в вагинальном секрете и развитием воспалительной реакции, в отличие от III группы.
При аэробно-грибковых ассоциациях не отмечено выраженного дисбаланса цитокинов в периферической крови, но во влагалищном отделяемом наблюдали значительные отклонения. Выявлено достоверное повышение уровня IL-4, IL-6, по сравнению с показателями в I и IV группах, при уменьшении количества IL-1, IL-2, TNF-a, INFy (р 0,05). Такие изменения цитокинового каскада соответствуют уменьшению количества лейкоцитов в вагинальном секрете по сравнению с их числом у пациенток IV группы.
Смешанная аэробно-анаэробная инфекция характеризовалась максимально высокими показателями провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-2, TNF-a), тенденцией к увеличению IL-6 и снижением IL-4 в периферической крови (приложение табл. 34), что свидетельствует о выраженном дисбалансе в противоинфекцонной защите. Во ВЖ также изменения были значительными. Отмечали активацию IL-1, IL-2, IL-6, TNF-a, INFy и депрессию IL-4 (р 0,05, приложение табл. 32).
Цитокины — небольшие белки, действующие аутокринно (т.е. на клетку, которая их продуцирует) или паракринно (на клетки, расположенные вблизи). Учитывая многочисленные эффекты каждого из исследуемых цитокинов, проведено изучение их влияния на численность и функцию иммунокомпетентных клеток, а также синтез провоспалительных и противовоспалительных фракций интерлейкинов [107, 257, 433]. Анализ проводили путем сравнения группы здоровых женщин и пациентов в НИЗВ, не подразделяя их по этиологическому фактору.
Считается, что IL-1 представляет один из самых древних в эволюционном плане факторов, обеспечивающих эффективную защиту организма в ответ на проникновение разнообразных инфекционных агентов. 1L-13 многофункциональный цитокин с широким спектром действия играет ключевую роль в развитии и регуляции неспецифического и специфического иммунитета. Он является лидером среди цитокинов воспаления, а его концентрация свидетельствует об активности процесса. [62, 107,231, 393].
Учитывая эффекты IL-ip, проведен корреляционный анализ уровня IL-1J3 с иммунокомпетентными клетками и другими интерлейкинами (рис. 6.2-6.5). В группе здоровых прямая сильная корреляция уровня IL-1(3 периферической крови с CD4+ (г=0,74, р 0,01), взаимосвязь средней силы с CD20+ (г=0,69, р 0,01) клетками, уровнем IL-2 (г=0,56, р 0,01) и TNF-a (r=0,73, p 0,01). Аналогичные эффекты выявлены при НИЗВ: IL-1 3 и CD4+ (r=0,58, р 0,01), IL-1 Р и CD20+ (г=0,48, р 0,01), IL-ip и IL-2 (i=0,84, р 0,01), IL-ip и TNF-a (г=0,78, р 0,01).
Экспериментальные исследования по изучению фармакодинамики антимикотических препаратов
Последнее десятилетие характеризуется неослабевающим интересом к микотической инфекции различной этиологии. Новый век даже назвали «золотым веком» медицинской микологии, подразумевая успехи, достигнутые в диагностике и лечении микозов [248, 376]. Вместе с тем, ускоренная эволюция возбудителей, расширение их спектра за счет вовлечения в патологический процесс новых, ранее не значимых видов, порождает и новые проблемы, требующие своего решения. Лечение кандидозной инфекции влагалища, в особенности хронического рецидивирующего кандидоза - одна из таких проблем. В связи с этим мы предприняли экспериментальное исследование, направленной на определение активной концентрации препаратов во ВЖ.
В исследование были взяты коммерческие препараты Итраконазол (Орунгал) и Флуконазол (Дифлюкан).
Итраконазол — высоколипофильное соединение, и его наибольшие концентрации обнаруживаются в тканях, особенно в жировой, сальнике, сальных железах кожи. Концентрации итраконазола в тканях намного превышают плазматические, и долгое время сохраняются после отмены препарата. Это белый кристаллический порошок. Тпл=166,2 . Растворим в дихлорметане, ограниченно растворим в тетрагидрофуране, практически нерастворим в воде и разбавленных растворах кислот. Капсула «Орунгал» содержит 100 мг итраконазола, масса содержимого одной капсулы = 461 мг.
Для исследования брали навеску равную 0,0236 г растертой массы капсулы (в этом количестве содержится 0,0236/4,61=0,00512 г итраконазола), помещали в мерную колбу на 25 мл, добавляли 3 мл ацетонитрила, 2 мл 1% раствора фосфорной кислоты, взбалтывали до тех пор, пока не разойдутся гранулы, и жидкость приобретет однородный вид. Доводили объем в мерной колбе до 25 мл подвижной фазой (ПФ) и фильтровали через стеклянный фильтр.
ПФ была приготовлена согласно статье в справочнике Clarke s Analysis of Drugs and Poisons: Itraconazole: ацетонитрил - вода в соотношении 60:40, с добавлением 0,1% диэтиламина, рН установлен с помощью фосфорной кислоты до 7,8.
В результате чего был получен раствор, содержащий 204,7 мкг итраконазола в 1 мл. Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) выполняли на приборе «Миллихром А 02», колонка Silasorb SPH, 2,0x75 mm. Объем раствора 5 мкл, скорость подачи ПФ 150 мкл/мин, t=40C. Результаты ВЭЖХ представлены в табл. 7.7.
На основании полученных данных (табл. 7.7) был построен калибровочный график для определения содержания итраконазола (рис. 7.16) и определен предел чувствительности - 3 мкг/мл, т.е. то количество итраконазола, которое можно выявить в 1 мл.
В качестве конкретного примера приводим данные анализа ВЖ больной П..., 35 лет.
Исследован биоматериал, взятый у больной П..., принимавшей итраконазол в течение 3-х дней. После центрифугирования при 4000 об/мин получена прозрачная надосадочная жидкость. При потоке ПФ 150 мкл/мин рабочее давление порядка 7,0, время удерживания около 10, пик хвостатый.
К 30 мл ПФ было добавлено 10 мл АЦН, с целью уменьшить время удерживания, скорость потока 100. При использовании такой ПФ пик итраконазола получился более узким, время удерживания около 6, пик хвостатый.
При ВЭЖХ биоматрицы в тех же условиях наблюдается несимметричный пик на времени удерживания около 2 мин. Это, скорее всего, несорбируемые на колонке примеси или естественные вещества, находящиеся в биологических объектах. Других пиков на хроматограмме не обнаружено.
Хроматографическое исследование биоматериала больной П... пика итраконазола (рис. 7.17), который ожидался на времени удерживании около 6 мин, не обнаружено.
После того, как в исследуемый образец был добавлен стандартный раствор итраконазола, пик итраконазола вышел, как и ожидалось, на времени удерживания около 6 мин (рис. 7.18). Подобные результаты были получены у 8-ми обследованных пациенток.
Флуконазол растворим в воде, быстро и почти полностью всасывается в желудочно-кишечном тракте. В кровь попадает более 90% принятой внутрь дозы. Одновременный прием пищи, а также желудочная кислотность не влияют на абсорбцию препарата. В плазме крови с белками связывается не более 12% препарата, основное количество находится в свободной форме. Поэтому флуконазол хорошо проникает во все жидкости организма [252]. Флуконазол - белые кристаллы, Тпл от 138 до 140С, легко растворим в воде. Раствор Дифлюкан содержит 2 мг/мл флуконазола. Для исследования брали 2,5 мл Дифлюкана, помещали в мерную колбу 25 мл и доводили объем до метки подвижной фазой. ПФ была приготовлена с учетом состава приведенного в справочнике Clarke s Analysis of Drugs and Poisons: Fluconazole: ацетонитрил - вода в соотношении 60:40, с добавлением 0,02% диэтиламина, рН установлен с помощью фосфорной кислоты до 7,5.
В результате разведения 2,5 мл Дифлюкана в мерной колбе 25 мл был получен раствор, содержащий 200 мкг/мл, который исследовали на приборе «Миллихром А02», колонка Silasorb SPH, 2,0x75 mm. Объем раствора 5 мкл, скорость подачи ПФ 50 мкл/мин, t=35C. Далее разводили раствор, содержащий 200 мкг/мл, и выполняли ВЭЖХ.
На основании полученных данных был (табл. 7.8) построен калибровочный график для определения содержания флуконазола (рис. 7.19). Был определен предел чувствительности, это то количество флюконазола в 1 мл, которое можно определить данным методом, равное 2 мкг/мл.
