Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. "Однояйцевые близнецы животных и методы их искусственного получения"
I.I. Однояйцевые близнецы сельскохозяйственных животных 5
1.2; Природа однояйцевых близнецов II
1.3. Искусственное получение однояйцевых близнецов сельскохозяйственных животных методом микроманипуляций на эмбрионах 16
2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Экспериментальные животные 32
2.2. Извлечение эмбрионов 33
2.3. Культивирование эмбрионов 33
2.4. Изготовление микроинструментов 38
2.4.1. Микрокузнща 41
2.4.2. Микропипетка универсальная 43
2.4.3. Микропипетка-держатель 46
2.4.4. Микрошшетка-игла 46
2.4.5. Микропетля с постоянным диаметром 51
2.4.6. Микропетля с изменяющимся диаметром 51
2.4.7.' Универсальный держатель микроинструъгонтов ' 55
2.4.8. Механический шприц для микроприсосов 55
.2.5. Перевязка двубластомерных эмбрионов кролика . 57
2.6. Трансплантация перевязанных пополам эмбрионов кролика62
2.7. Вазектомия самцов кролика 65
2.8. Мжрофотографирование эмбрионов 65
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 66
3.1. Развитие вне организма перевязанных пополам эмбрионов кролика .66
3.2. Результаты трансплантации перевязанных пополам эмбрионов крольчихам-реципиентам 70
3.2.1.Трансплантация перевязанных пополам двубластомерных эмбрионов 70
3.2.2.Трансплантация перевязанных пополам ранних морул . 31
3.3. Зоотехническая характеристика кроликов, полученных из половин эмбрионов 86
6.- ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 93
7. ЛИТЕРАТУРА 95
- Однояйцевые близнецы сельскохозяйственных животных
- Культивирование эмбрионов
- Развитие вне организма перевязанных пополам эмбрионов кролика
Введение к работе
В решении Продовольственной программы, предусматривающей значительное повышение производства продуктов животноводства, большая роль отводится сельскохозяйственной науке. Наряду с тра-диционно разрабатываемыми вопросами зоотехник, интенсифицируются исследования по биотехнологии, активно использующей достижения современной биологии,
В последнее десятилетие большие успехи достигнуты в совершенствовании метода трансплантации эмбрионов сельскохозяйствен-ных животных, открывающего реальную возможность повышения уровня генетического влияния на популяции животных-рекордистов. Появились способы определения пола эмбрионов. Создана технология их криоконсерваїщи, позволяющая создать банк генетически ценных эмбрионов, В развитие этого поставлена задача разработки методов клонирования эмбрионов с целью копирования генотипов высокопродуктивных животных,^ Прогресс исследований в данном направлении обусловлен открытием принципиальной возможности получения генетически идентичных животных при разделении их эмбрионов методами микроманипуляций на две или несколько частей, способных при создании определенных условий развиваться в самостоятельную особь. Таким путем уже получены однояйцевые близнецы крупного рогатого скота и овец. Эти методы, однако, еще не стали достоянием практики животноводства, В связи с этим, актуальна дальнейшая разработка микроманипуляционной техники и приемов микроопераций на эмбрионах различных видов сельскохозяйственных животных.
Настоящая работа посвящена совершенствованию техники микроманипуляций на эмбрионах млекопитающих для целей клонирования. Ставилась задача разработать способ перевязки ранних эмбрионов кро- ~ 5 - ликов для получения животных из половин эмбрионов.
Исследование выполнено в соответствии с Государственным планом по решению научно-технической проблемы: "Усовершенствовать системы селекционной работы и повышения продуктивности сельскохо~ зяйственных животных с использованием молекулярно-генетических иммунологических и физиолого-биохимических методов исследований и ЭВМ, № 8II03329".
По результатам исследований опубликовано 4 печатные работы и выполнено 5 рационализаторских предложений по ВИЖу.
Материалы диссертации доложены и одобрены: на Втором Всесоюзном симпозиуме по иммунологии воспроизведения (1980 г), на 36-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа (1983 г), на объединенной конференции отдела генетики сельскохозяйственных животных ВИЖа (1984 г), на объединенной конференции отдела биофизики клетки института биофизики Ш. СССР (1984 г).
Работа премирована на смотре НТО молодежи (1982 г).
Разработка метода перевязки эмбрионов; впервые обеспечившего получение высших животных, однояйцевых близнецов кроликов из разобщенных лигатурой бластомеров, выносится на защиту;
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Однояйцевые близнецы животных и методы их искусственного получения І.І. Однояйцевые близнецы сельскохозяйственных животных
Наибольшее количество исследований по рассматриваемой пробле- ме посвящено однояйцевым близнецам крупного рогатого скота. Прежде всего изучалось распространение двоиневости у этого вида животных. Было обнаружено, что частота двоиневости в различных популяциях крупного рогатого скота составляет 1-5$ (3,4,26,30,40,47). При этом были найдены существенные вариации двоиневости в зависимости от породы животных (20, 21, 23, 32). В определенных семействах коров и линиях быков была установлена высокая частота повторяемости двоиневости (26). Анализ статистических материалов определенно указывает на наследственный характер многоплодия у крупного рогатого скота. При этом полагают, что многоплодие коров наследуется как через двойневых, так и одинцовых потомков обоих полов. На проявление многоплодия коров, видимо, влияют также различные паратипические факторы (13).
Неоднократно предпринимались попытки повысить частоту двои- . новости у крупного рогатого скота селекционным путем (2, 9, 10, 16).
Многочисленны эксперименты по повышению двоиневости у коров гормональными воздействиями с целью вызывания у животных суперовуляции. К сожалению, данный метод, оказавшийся эффективным на овцах, у крупного рогатого скота не оправдал возложенных на него надежд. Причина этого состояла в том, что суперовуляция, вызванная соответствующими гормонами, часто приводила к появлению у коров двойневой беременности в одном роге матки и, как следствие этого, к частым абортам.
Многие авторы отмечают проблематичность необходимости повышения двоиневости в молочном скотоводстве, поскольку при разнопо-ловости телят-близнецов телки, как правило, рождаются бесплодными -фримартинами (5, 7). Исследования последних лет показывают, что быки из разнополых двоен часто характеризуются пониженной воспро- изводительной функцией (7, 42). Нарушение физиологии животных-близнецов не наблюдается лишь в случав их однополости.
Двойневая стельность создает определенную физиологическую напряженность для организма животного. В связи с этим после близнецового отела, по сравнению с одноплодным, сервис-период у коров удлиняется, в среднем, на 21 день, что снижает выход молодняка на 100 коров на 5,2 теленка. Однако, имеются указания на то, что можно увеличить продолжительность периода хозяйственного использования многоплодных коров, в среднем, до 7,44 отелов, а коров, имевших двойни 2 раза и более - до 8,47 отелов (12).
В мировой практике животноводства имеется немало примеров рекордных показателей продуктивности коров, которые либо сами были многоплодными, либо имели многоплодное происхождение (1,8).'
Не вдаваясь в детальный анализ данного вопроса, можно все же согласиться с тем, что повышение естественной двойневости, очевидно, более целесообразно у мясного скота. По имеющимся данным для поддержания нормальной жизнедеятельности мясной коровы затрачивается около 7($ питательных веществ корма, а 30$ идет на прирост живой массы и питание теленка во время стельности и лактации. Превращение энергии корма в энергию прироста живой массы будет значительно эффективнее, если корова будет вынашивать двойню^ При этом будут возникать проблемы, в частности, уменьшение живой массы телят-близнецов при рождении, по сравнению с одинца-ми (25). Это, однако, не всегда является ограничивающим фактором. По данным В.А.Зораняна, к 12-месячному возрасту в оптимальных условиях содержания телята из двоен, как правило, достигают уровня живой массы одинцовых телят (II).
Как указывает этот же автор, в Дорийском племенном заводе от
100 двойневых отелов у коров кавказской бурой породы даже при 10$ падеже остается 180 телят, а от 100 одноплодных - 97 (3% - отход). Таким образом, при двойневых отелах было получено на 83 теленка больше, чем при одинцовых отелах. Исходя из расчета числа отелов на 10 коров^хозяйство вследствие многоплодных отелов получило в годовалом возрасте дополнительно 20 тонн говядины (при одинаковых условиях содержания животных).
Однояйцевые близнецы могут оказать неоценимую помощь в проведении научно-исследовательской работы по различным вопросам зоотехнии. Так-, например, подсчитано, что при изучении различных хозяйственных факторов, влияющих на величину удоев или величину молочного жира, одна пара монозиготных двоен может заменить, соответственно, 22 и 52-54 животных-аналогов, не близнецов (61).
Однояйцевые близнецы у крупного рогатого скота весьма редки, их процент по литературным данным разных авторов колеблется от 0,05 до 0,28^(4). Наряду с этим общепринятым мнением имеется одно сообщение, в котором говорится о том, что среди однополых близнецов однояйцевые составляют восьмую часть (30).
У крупного рогатого скота зарегистрировано и рождение однояйцевых троен (51,65).
Публикации об однояйцевых близнецах свиней, лошадей и овец немногочисленны. У свиней и лошадей описаны лишь единичные случаи однояйцевой двойневости (38, 67). Разные авторы указывают на разный процент однояйцевых близнецов у овец. Однако, многие склонны считать справедливым мнение L.Gedada(45), установившего, что однояйцевые близнецы у этого вида животных составляют около 20$ всех пар животных одного пола.
Следует специально указать на техническую трудность точного диагностирования однояйцевых близнецов сельскохозяйственных живо- тных. У крупного рогатого скота, например, об этом сначала судили по таким морфологическим признакам, как масть, рисунок носового зеркала, размеры скелета телят. Позднее для этих целей стали использовать исследование большого набора эритроцитарных антигенов. Казалось, что определение групп крови должно было радикально решить все спорные вопросы диагностики монозиготности двоен у крупного рогатого скота. Однако, в специальной работе (3), по этой проблеме, при исследовании 200 пар однополых двоен 50,5$ близнецов оказались с одинаковыми фенотипами групп крови и эритроцитар-ной мозаикой, 47% - с различными фенотипами и мозаикой, 0,5% - с различными фенотипами, но без эритроцитарной мозаики и только 7$ демонстрировали одинаковый фенотип без мозаики» На основании исследования групп крови, эти четыре указанные пары близнецов можно было бы отнести к монозиготным двойням, однако это исключалось данными по биохимическому полиморфизму: партнеры первой пары различались по типу церрулоплазмина, второй пары - по типу амилазы, третьей и четвертой - одновременно по типу трансферта и амилазы, данные материалы показывают, что среди 200 пар исследованных однополых двоен по группам крови, биохимическому полиморфизму и морфологическим признакам эти авторы не обнаружили ни одной пары полностью идентичных (монозиготных) двоен. В связи с этим, был сделан вывод о чрезвычайной редкости однояйцевых близнецов в потомстве крупного рогатого скота. Особо указывалось на возможность различных диагностических ошибок при идентификации у крупного рогатого скота однояйцевых двоен.
Согласно некоторым материалам, общепринятое суждение о частоте монозиготности близнецов различных видов сельскохозяйственных животных в большей части ошибочно. Так, из 68 исследованных пар однополых близнецов крупного рогатого скота, у которых были выяв- лены сходная масть и пегость, а у шести пар, кроме того, обнаружена одинаковость рисунка носового зеркала, это не явилось абсолютным указанием на их однояйцевость (26).
Серьезные эмбриологические исследования, связанные с выяснением природы фримартинизма, выполненные П.Г.Детским в 1955 году (25) также не подтвердили того количества монозиготных близнецов, которое обычно регистрируется в практике скотоводства.
Известен факт существования двуяйцевых фолликулов в яичниках млекопитающих. Механизм их образования хорошо прослежен на ондатрах. У этого вида животных процесс фолликулогенеза в яичниках начинается после рождения и продолжается у половозрелых самок. Количество двуяйцевых фолликулов в яичниках ондатры в месячном возрасте достигает 25-30$ от общего числа примордиальных и растущих фолликулов. Развиваясь, двуяйцевые фолликулы могут расчленяться на два фолликула. Вначале одновременно на двух полюсах фолликула фолликулярный эпителий образует выросты, которые соединяясь дают эпителиальную перегородку, отделяющую ооциты друг от друга. По мере роста и развития таких фолликулов происходит врастание оболочки фолликула и последующее полное его расчленение с образованием двух самостоятельных фолликулов. У некоторых фолликулов процесс расчленения полностью не заканчивается, в результате чего образуются двухкамерные фолликулы. При овуляции в яичнике животных образуется только одно желтое тело (25).
Эти данные, полученные при исследовании яичников ондатры, позволяют полагать, что как у крупного рогатого скота, так и у других видов сельскохозяйственных животных, могут быть двуяйцевые фолликулы, которые развиваются, достигают полной зрелости и ову-лируют. В пользу этого свидетельствуют нередкие случаи нахождения в яичниках крупного рогатого скота и других видов млекопитающих - II - двухкамерных фолликулов (18, 19). Этот вопрос специально изучали на овцах. Из 1352 выделенных из 10 фолликулов яичников казахских тонкорунных овец, было обнаружено по два ооцита, а в одном даже 3, из которых один был меньше двух остальных. Все эти ооциты имели нормальную морфологию (14).
Таким образом, возникновение кажущейся идентичности у дизи-готных близнецов сельскохозяйственных животных некоторые авторы склонны связывать с тем, что они происходят из ооцитов - "близнецов", образовавшихся из одной оогонии.
1.2. Природа однояйцевых близнецов
В эмбриологической литературе рассматривается несколько вариантов, когда может произойти разделение эмбриона на две или более самостоятельных частей, что ведет к формированию однояйцевых близнецов.
Так, предполагают, что разделение эмбриона возможно на стадии двух бластомеров. Это положение пытались подтвердить экспериментально на зародышах низших животных. H.Driesch в 1891 г.(41) разделял бластомеры у зародышей иглокожих путем встряхивания их в безкальциевой морской воде. Из каждого бластомера потом получалась вполне развитая личинка. На зародыш тритона на стадии двух бластомеров накладывали лигатуру, ж таким образом, бластомеры отделяли друг от друга. Каждый из них развивался в целого головастика, рис. I (70).
К Экспериментам На ВЫСШИХ ЖИВОТНЫХ ОТНОСЯТСЯ рабОТЫ F.Seidel (68, 69), получившего крольчат из одного бластомера. Этот эксперимент был выполнен по следующей схеме. В двубластомерных эмбрионах кролика (рис. 2, а) стеклянной иглой разрушали один из бластомеров (рис. 2, б).
Рис. I. Формирование двух плодов при перешнуровке эмбриона тритона (noH.Spernan t 70).
При культивировании этих эмбрионов было установлено, что ин-тактный бластомер может последовательно дробиться, в результате чего формируется многоклеточный эмбрион (рис. 2, в, г). Трансплантация этих эмбрионов в половой тракт крольчих в отдельных случаях приводила к получению потомства.
Рис. 2. Эксперимент с разрушением одного из бластомеров эмбриона КрОЛИКа (ПО E.Seidel ,68). а) двубластомерный эмбрион; б) разрушение одного (правого) бластомера; в,г) дробление интактного бластомера.
В исследованиях последних лет было показано дробление помещен- - ІЗ - ных в соответствующие условия изолированных бластомеров эмбрионов многих видов животных: мышей, крыс, крупного рогатого скота, свиней и др. (22).
Не смотря на экспериментальную демонстрацию возможности развития индивидуальных бластомеров эмбрионов вплоть до рождения особей соответствующих видов животных, окончательного ответа на вопрос о том, таков ли естественный механизм образования однояйцевых близнецов, получен не был.
Между тем, в последние годы экспериментально показано, что разделение одного эмбриона на два самостоятельных может произойти на стадии морулы или ранней бластоцисти. При трансплантации единичных эмбрионов крупного рогатого скота в этой стадии дробления коровам-реципиентам были получены телята - однояйцевые близнецы. Так, например^.i5oyaert,R.Bouters,et аі(.56)на 10-й день полового цикла вводили телкам-донорам 3000 и.е. СЖ, а через 2 дня инъецировали 37,5 мг простагландине. Через 12 часов доноров осеменили замороженным семенем, а затем на седьмой день извлекли эмбрионы, один из которых трансплантировали корове-реципиенту. Через 281 день корова-реципиент родила двойню.
Подобный же случай был зарегистрирован в Центре по трансплантации ВИЖа. Источником однояйцевых близнецов был 7-дневный эмбрион, который сначала подвергался замораживанию, затем оттаиванию и пересадке корове-реципиенту (28).
В рассмотренных работах разделение эмбрионов в соответствии v с условиями трансплантации происходило в рогах матки животных-реципиентов. Между тем, как было установлено (66), в естественных условиях Это может произойти и в яйцеводах животных.
Интересное ЯВЛеНИв ОПИСаЛИA.Massip, P.Zwalmen, et.al.(52).
Ранние бластоцисти коров, вымытые на седьмой день беременности животных, культивировали в модифицированном растворе Кребса~Рин~ гера с добавлением лактата, пирувата натрия к 20% инактивированной овечьей сыворотки. Через двенадцать с половиной часов культивирования у одной из бластоцист через небольшое отверстие в прозрачной зоне началось выпячивание трофобласта, которое увеличивалось в размере до тех пор, пока бластоциста не приняла вид двух одинаковых по величине "мячей", связанных друг с другом тонким плазматическим мостиком. Клетки трофобласта и эмбриобласта при этом оказались распределенными поровну между двумя вновь образованными бластоцистами. Процесс этого разделения занял 79 часов 15 минут. Было высказано предположение, что данное явление можно рассматривать как приводящее к появлению дихорионных двоен. A.Enders (43) также случайно наблюдал раздвоение эмбриональной внутриклеточной массы бластоцисты и посчитал это причиной возникновения однояйцевых двоен.
Как полагают JT.K.' Эрнст с соавт. (31), одной из возможных причин появления однояйцевых близнецов, может явиться спонтанный выход бластомеров из прозрачной зоны эмбриона. A.Newman (58) И J.Patterson (64) ЄЩЄ В 1910 Г. было описано образование однояйцевой четверни или даже 7-9 однояйцевых близнецов у броненосцев.
Специальными эмбриологическими исследованиями, выполненными в этом плане, было установлено, что в яичниках самки броненосца всегда происходит только одна овуляция. Впоследствии в яичнике образуется только одно желтое тело.
Овуляция у броненосца наступает в августе месяце.' Из оплодотворенного яйца начинает развиваться эмбрион. Бластоциста, попав в матку, несколько недель остается в состоянии покоя. Развитие её возобновляется лишь осенью. При этом часть трофобласта бластоцис- та превращается в плаценту, а в зародышевом узелке дифференцируется экто- и энтодерма, В разросшейся эктодерме постепенно развивается амниотическая полость, которая почкуется с повторным удвоением, что предшествует появлению множества зародышей - однояйцевых близнецов.
Как Полагали A. Newman HJ. Patter son ПРИЧИНОЙ, Запускающей этот механизм, является весьма длительный латентный период от момента оплодотворения яйца броненосца до его имплантации. Данная точка зрения, однако, встречает серьезные возражения. Указывают, например, что у барсуков (44), медведей (79) и;некоторых других видов животных бластоцисти имеют аналогичный "период покоя", однако однояйцевые близнецы у этих видов животных неизвестны.
По-видимому, "почкование" амниотического пузыря у броненосцев все же видовой, генетически детерминированный признак.
Имеется сообщение о том, что, возможно,такой же механизм образования однояйцевых близнецов имеет место у одного из видов опоссумов. У одной из самок этого вида в левой матке случайно была найдена четверня однояйцевых близнецов, находящаяся на ранней стадии развития. Полиэмбриония у опоссумов, как было показано впоследствии, носит спорадический характер, встречаясь наравне с обычным развитием яйца.
Имеются данные о том, что однояйцевые близнецы высших живот** ных могут быть сформированы в результате оплодотворения двуядерно-го яйца (46).
Таким образом, пока окончательно неясно, в какой момент при образовании естественных однояйцевых близнецов происходит разделение одного эмбриона на два способных к самостоятельному развитию; под влиянием каких факторов, внешних по отношению к нему или внутренних; носит ли оно случайный характер или наследственно предопределено.
1»3. Искусственное получение однояйцевых близнецов сельскохозяйственных животных методом МИКРОМЭ" нипулядий на эмбрионах
В последнее десятилетие интенсивно велись работы по разделению эмбрионов сельскохозяйственных животных методами микроманипуляций. При этом ставилась задача либо деления ранних эмбрионов на индивидуальные бластомеры с целью получения из них несколько самостоятельных эмбрионов, которые дадут клон однояйцевых близнецов, либо разделения ранних бластоцист животных пополам, которое должно было обеспечить получение одной пары однояйцевых близнецов.
Началу этих работ предшествовали многочисленные исследования, выполненные на эмбрионах многих видов лабораторных животных: мышах (72,73), крысах (59), кроликах (68, 69).
Было установлено, что в соответствующих условиях культуры ткани индивидуальные бластомеры эмбрионов млекопитающих могут дробиться.
Впервые идентичные близнецы крупного рогатого скота методом микроманипуляций были получены английскими исследователями б.wniad-sen,H.Lehn-Jensen,et aiC76). Работа выполнялась следующим образом. У половозрелых телок-доноров вызывали суперовуляцию инъекцией 2000 ИЕ СЖ в период между 9-14 днями полового цикла с последующей инъекцией через 48 часов 750 мкг клопростенола. Телок осеменяли через 10-12 часов после начала охоты. Эмбрионы (с 32-64 шарами дробления) извлекали нехирургическим методом на 5 или 6 день после охоты.
ГЛикроманипулирование с эмбрионами проводили при комнатной температуре (20-24С) в среде PBs . Сначала микрохирургически уда- ляли прозрачную зону эмбриона, затем выделяли индивидуальные бластомери, которые по одиночке или группами вводили в освобожденные прозрачные оболочки ооцитов свиней. Полученные таким образом эмбрионы помещали в маленький цилиндрик из 1$*-го агара на 0,9$ Ь'аО- В свою очередь, его погружали в большой цилиндр из 1,2$ агара, рис. 3.
Рис. 3. Схема заключения изолированных бластомеров эмбрионов крупного рогатого скота в агаровые цилиндры (по s. Willadsen /175) а) большой агаровый цилиндр; б) малый агаровый цилиндр; в) прозрачная зона свиного ооцита; г) бластомер эмбриона коровы.
Эмбрионы, заключенные указанным выше способом в агар, пересаживали в перевязанный яйцевод овцы. После соответствующего времени инкубации, когда эмбрионы трансформировались в компактную позднюю морулу или раннюю бластоцисту, их извлекали из агара и оценивали под микроскопом. 0 нормальности эмбриона судили по соответствию его фактического развития времени прошедшему от момента оплодотворения, либо после непродолжительного культивирования.
Для выделения индивидуальных бластомеров авторы использовали пастеровские пипетки с концевым диаметром , несколько превышающим диаметр одного бластомера. Каждый эмбрион посредством микроманипуляции разделяли на две равные группы бластомеров, а если это уда- валось, то на четыре.
Свиные ооциты были выделены из яичников животных на мясокомбинате и хранились в среде pbs при - 196С.
В каждый блок агара заключали до 10 микроманипулированных эмбрионов,
В результате данной работы было показано, что микрохирурги-чески выделенные из ранних эмбрионов коров индивидуальные бласто-меры в указанных условиях были способны продолжать свое развитие, табл.1.
Таблица I.
Развитие "половинок" эмбрионов-, полученных из 5 - 6 дневных морул коров, заключенных в агар, и культивируемых В ПереВЯЗаННЫХ ЯЙЦеВОДа OBe4(noS.Willadsen Н. Lehn -Jensen, et al.f '6)
Число пересаженных эмбрионов 100
Число извлеченных эмбрионов ПО
Морфология эмбрионов: дегенерированные 5 с задержкой развития 2 с неправильным дроблением I с нормальным дроблением 92
Степень выживания "половинок" эмбрионов после пересадки составила 75%, что не намного отличается от того, что происходило с нормальными эмбрионами, трансплантированными коровам или телкам-реципиентам.
Степень выживания "четвертушек" эмбрионов после пересадки составила 43$,что было значительно ниже, чем у нормальных эмбрионов.
Из 4 пар пересаженных монозиготных эмбрионов три дали по дво-йневой стельности.
Описанного типа микрошнипуляции с эмбрионами, по мнению авторов, при определенном навыке несложны и один человек может разделить 20 морул коров в день. Таким образом, сделан вывод, что предложенный метод может быть использован в практике как для получения монозиготных двоен, так и для простого увеличения числа эмбрионов, пригодных для трансплантации.
Несмотря на полученный положительный эффект, разработанная S. Willadsen, H.Lehn-Jcnsen,et al.ТЄХНОЛОГИЯ Получения ГЄНЄТИЧЄС- ки идентичного потомства у крупного рогатого скота представляется пока все же весьма трудоемкой, так как требует включения в экспе^-римент одновременно трех видов животных : коров, у которых вымываются и которым трансплантируются эмбрионы, свиней, из ооцитов которых берут прозрачные зоны, и овец, являющихся промежуточными реципиентами микроманипулированных эмбрионов. Следует также отметить, что данный метод требует сложных технических приспособлений для восстановления целостности прозрачной зоны эмбрионов,
По схеме, использованной s.wniadsen,\н. LehnTJense^ анало-
ГИЧНЫЙ эксперимент был ВЫПОЛНеН Т.Williams, R. Elsden.et зі?8)»
Авторы извлекали эмбрионы у коров-доноров нехирургическим методом между 5,5-7 днями после осеменения животных. Эмбрионы отбирали на стадии морулы ~ ранней бластоцисти и помещали их в микрокашго модифицированного раствора Дюльбеко с фосфатом и 2С$ сыворотки крови плода теленка^ Затем на микроманипуляторе тонкими стеклянными микропипетками разрезали прозрачную оболочку эмбриона и примерно половину клеточной массы удаляли и перемещали в освобожден- ную прозрачную зону ооцита крупного рогатого скота.
Для исключения промежуточного реципиента эмбрионы после микроманипуляций помещали в культуру, в среду Хэм..- с 20$ сыворотки крови плода теленка, при температуре 37С с газовой смесью из 95$ воздуха и Ъ% С0. Всего было разделено 55 эмбрионов. Из 66 прокультивированных половинок 55 успешно развились. После культивирования 74$ эмбрионов были морфологически классифицированы как хорошего качества и из них 20 пар эмбрионов были пересажены коровам-реципиентам в рог матки, соответствующий яичнику с желтым телом. После проведенных 14 хирургических трансплантации 9 реципиентов стали стельными и 7 из них - двойнями.
В ЭТОМ ЖЄ Плане МОЖНО рассматривать работу G.Brem,И.Krausslich et ai. (34), выполненную на эмбрионах крупного рогатого скота. Микроманипуляции с 6-6,5 дневными эмбрионами авторы выполняли на стационарном и переносном їликроманипуляторах, базировавшихся первый на инвертированном микроскопе Цейса, а второй - на стереоми-кроскопе.
Для управления микрохирургическими инструментами с целью удерживания и разрезания эмбрионов были использованы два прямых микроманипулятора Лейтца, которые были соединены с электрическими шпиндельными моторами. Для разрезания эмбрионов, в отличие от техники, предложенной S.Willadsen,И.Lehn-Зшівеп , были ИСПОЛЬЗОВа- ны не только тонко оттянутые стеклянные нити, но и металлические ножи*
Эмбрионы оценивали микроскопически. Во время микроманипуляций и культивирования они находились в среде PBS с 20$-ной инак-тивированной сывороткой крови эмбриона теленка.
Эмбрионы, подготовленные для разделения, были зафиксированы пипетками-держателями, поставленными под прямым углом к направле- нию разреза. У фиксированного эмбриона сначала с помощью микроножа разрезали прозрачную зону, затем стеклянными иглами разрез раскрывали. Через него в эмбрион вводили специальный металлический нож или стеклянную нить для разрезания эмбриона на две половины. При распарывании морулы и разрезании пополам внутриклеточной массы часть бластомеров, как отмечают авторы, разрушалась. У некоторых эмбрионов происходила перестройка морфологии - восстановление первоначальной формы, что проявилось округлением разделенных половин.
Одну половину эмбриона оставляли в собственной прозрачной зоне, другую переносили в прозрачную зону какогскпибо дегенери-рованного эмбриона или неоплодотворенного ооцита крупного рогатого скота; Пустые оболочки были получены разрезанием их микроножом и отсасыванием содержимого микропипеткой.
После нехирургической трансплантации 148 половин 132 коровам и телкам-реципиентам было получено 25 беременностей, из которых 3 пары монозиготных двоен. Среди 4 абортусов также были двойни.
Авторы указывают, что решающее значение для успешной микро-манипуляции имеет отбор эмбрионов. Разрезанию могут быть подвергнуты лишь морфологически высококачественные морулы. Из 10 отобранных эмбрионов пригодным для получения близнецовой пары может только один.
Многие последующие исследования, в которых развивалась основная идея s.vViiiadsen » состоящая в разделении эмб-рионов на индивидуальные бластомеры и подсадки их в свободные оболочки ооцитов, преследовали задачу ее упрощения и возможной адаптации к задачам практики зоотехнии. С этой целью j.ozii,j. Heyman et аіСбЗ) усовершенствовали технику разделения эмбрионов на части с использованием пневмоманипулятора типа ^Фонбрюна, обес- печиващего независимый одновременный контроль пяти стеклянных микроинструментов: микропипетки для захвата эмбриона во время операции путем присасывания, двухішнструментов с острыми концами для вскрытия прозрачной оболочки по экватору и разрезания не менее, чем 1/2 длины ее окружности и последующего разделения эмбриона на две части после извлечения его из оболочек. Два оставшихся микроинструмента служили для переноса частей эмбрионов в прозрачную зону ооцитов.
Эта сложная техника была использована с единственной целью добиться наименьшего травмирования эмбрионов в процессе выполнения микроманипуляций, чтобы можно было сразу трансплантировать их коровам - реципиентам, минуя стадию "промежуточного хозяина" (овцы). Авторы изучали способность к выживанию 6-7 дневных эмбрионов коров после их разделения пополам. Эмбрионы были получены от телок породы шароле, суперовулировавших после внутримышечного введения 32 мг <ЮГ в течение 5 дней в убывающих дозах. После обнаружения течки коров осеменяли дважды. Эмбрионы извлекали нехирургическим методом на 6-7 день после первого осеменения, классифицировали по стадиям развития и хранили при комнатной температуре в питательной среде в атмосфере Ъ% СС>2, 5% (^, 90$ Б 2» Б работе использовали только те эмбрионы, в которых началось образование полости. Еластоцисты, имевшие зародышевый диск и отдельный трофоб-ласт, отбрасывали .
Половинки эмбрионов помещали в пустые прозрачные зоны ооци*~ тов, извлеченных из яичников убитых коров, которые хранили в фос-фатно-буферном растворе с 20$ эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при температуре -20С. Обе половинки каждого эмбриона в прозрачной зоне нехирургическим методом переносили в матку коров-реципиентов, синхронизированных по половому циклу двук- ратной инъекцией проотагландина с коровами-донорами. Каждая монозиготная пара эмбрионов была помещена в капилляр с 0,2 мл питательной среды и пересажена при помощи специального катетера примерно на 10 см внутрь рога матки, соответствующего яичнику с желтым телом.
Из 16 пар 6-7-дневных эмбрионов было пересажено 14 пар монозиготных половинок (два разделенных эмбриона были разрушены при введении половинок в пустую прозрачную зону).
На 32-й день из 14 коров-реципиентов, каждой из которых были трансплантированы по две половинки эмбрионов, 9 оказались стельными (64,2$). Трех из этих 9 коров-реципиентов убили на этой стадии и 4 - на 70-й день. Все извлеченные плоды внешне были нормальными, у 6 реципиентов были двойни (66,6$). В совокупности из 28 пересаженных половинок эмбрионов было получено 15 плодов. Два отелившихся реципиента принесли по двойне. Из представленных данных очевидно, что уровень приживаемости после нехирургической пересадки монозиготных половинок эмбрионов приближается к показателям трансплантации кооперированных эмбрионов.
Рассмотренные материалы указывают также на то, что 6-7 дневные эмбрионы крупного рогатого скота можно использовать для получения монозиготных двоен.
Как полагают, первое клеточное дифференцирование, появляющееся в элементах бластоцисти, не может ограничить получения монозиготных двоен путем микроманипуляции разделения эмбрионов пополам. При изучении механизма образования природных монозиготных двоен, как уже указывалось, эмбрион может удваиваться в период развития между стадией раннего деления клеток и гаструляцией и у коровы это происходит на 18 день стельности. По мнению J.ozii, J.Heyman,et ai.(63), наличие полости (вмятины) на 6-7 день разви- тия позволяет надеяться, что при разрезании эмбрионов на половины, клетки, ответственные за формирование зародышевого диска и трофобласта, могут распределиться равномерно.
В одной из своих последних работ J. Ozii (62) выполнял микроманипуляции на 8-й дневных эмбрионах, собранных нехирургическим методом суперовулировавших кроссбредных телок. Нормально экспандированные бластоцисты с четкой внутриклеточной массой и трофобластом были освобождены от прозрачной зоны и разделены по сагитальной линии,- Каждую половину бластоцисты вводили в пустые прозрачные зоны и культивировали в течение двух часов в среде В-2, Прокультивированные половины бластоцист были трансплантированы реципиентам нехирургически. После трансплантации II бластоцист (22 половины) II реципиентам, 8 из них стали стельными, 4 -двойнями.
Из работ, выполненных на крупном рогатом скоте, можно также указать на исследование G.Br em, B.Kmff et ai. (35), которые манипулировали со 127 эмбрионами, полученными от суперовулировавших телок на 5-6 день после первого осеменения. Их разделение на 2 половины производили с помощью микроманипулятора, после чего каждую из половин заключали в свободную прозрачную зону. Полученные 103 пары эмбрионов были пересажены по 2 каждому, а 23 пары -по одному, В первом случае стельность составила 23$, во втором -19$. Было установлено, что положительный эффект находился в прямой зависимости от качества эмбрионов и характера обращения с ними на всех этапах работы.
Как и для крупного рогатого скота, для овец первоначальное экспериментальное получение однояйцевых близнецов также было связано с разделением эмбрионов на отдельные бластомеры с последующей подсадкой их в прозрачные свободные оболочки ооцитов. - 25 -Одной из работ в этом плане является исследование s.Meinec- ke-Tillman,B.Meinecke (54).
Авторы экспериментировали на овцах породы меринос. Микрома-нипуляции выполняли с эмбрионами, находящимися на стадии морулы (2,5-5 дней) и ранней бластоцисти (6,5 дня).
Однояйцевые близнецы сельскохозяйственных животных
Наибольшее количество исследований по рассматриваемой проблеме посвящено однояйцевым близнецам крупного рогатого скота. Прежде всего изучалось распространение двоиневости у этого вида животных. Было обнаружено, что частота двоиневости в различных популяциях крупного рогатого скота составляет 1-5$ (3,4,26,30,40,47). При этом были найдены существенные вариации двоиневости в зависимости от породы животных (20, 21, 23, 32). В определенных семействах коров и линиях быков была установлена высокая частота повторяемости двоиневости (26). Анализ статистических материалов определенно указывает на наследственный характер многоплодия у крупного рогатого скота. При этом полагают, что многоплодие коров наследуется как через двойневых, так и одинцовых потомков обоих полов. На проявление многоплодия коров, видимо, влияют также различные паратипические факторы (13).
Неоднократно предпринимались попытки повысить частоту двои- новости у крупного рогатого скота селекционным путем (2, 9, 10, 16).
Многочисленны эксперименты по повышению двоиневости у коров гормональными воздействиями с целью вызывания у животных суперовуляции. К сожалению, данный метод, оказавшийся эффективным на овцах, у крупного рогатого скота не оправдал возложенных на него надежд. Причина этого состояла в том, что суперовуляция, вызванная соответствующими гормонами, часто приводила к появлению у коров двойневой беременности в одном роге матки и, как следствие этого, к частым абортам.
Культивирование эмбрионов
Для получения возможности сравнения процессов дробления нормальных и после выполнения микроманипуляций эмбрионов использовали культивирование их in vitro
С учетом имеющихся литературных данных и собственного экспериментального опыта были отработаны и усовершенствованы методики культивирования эмбрионов кроликов, позволяющие; добиться устойчивого развития их вне организма животных.
Культивирование эмбрионов кролика ранее было получено во многих питательных средах, обычно используемых для постановки культур клеток соматических тканей млекопитающих, табл. 2. Дробление ранних (двух, четырех бластомерных) эмбрионов кролика до стадии морулы или бластоцисти наблюдали в средах Хем-Ф-Ю, 199, Игла, Бринстера, изотонических солевых растворах, жидкости из яйцеводов крольчих, гомологичной сыворотке крови, В качестве добавок к стандартным питательным средам апробировались: обезжиренный белок, жирные кислоты, альбумин бычьей сыворотки крови, сыворотка крови теленка, гомологичная сыворотка крови, гликоген, различные аминокислоты, лактат и пируват натрия, казеинат, а также некоторые витамины.
Для культивирования ранних эмбрионов кролика мы использовали среду 199, к которой добавляли гомологичную сыворотку крови животных в соотношении 1:4, а также о,5 мг/мл пирувата натрия, В наших опытах культивирование ранних эмбрионов кролика проводилось при температуре 37С, рН - 7,4 в атмосфере, содержащей 5% С02, 5% 02 и 9С$н 2 Обычно эмбрионы животных принято культивировать в капле среды под слоем вазелинового масла. Мы культивировали эмбрионы без использования масла, поскольку оно прилипает к микроинструментам, что существенно мешает качественному выполнению микроманипуляций, В каждую каплю среды обычно помещали один эмбрион.
Развитие вне организма перевязанных пополам эмбрионов кролика
Для изучения дробления in vitro перевязанных пополам синтетической нитью эмбрионов кролика в 1980-81 г.г. нами было проведено 36 экспериментов, в которых культивировали 282 микро-оперированных эмбриона. В каждой постановке культуры на контроль ставили эмбрионы, не подвергавшиеся микроманипуляции перевязки.
Следует указать, что наиболее типичные неудачные микроманипуляции перевязки эмбрионов состояли в разрыве оболочек эмбриона (рис. 29, а), разрушение одного или обоих бластомеров (рис. 29, б, в), отхождении обоих бластомеров на одну сторону лигатуры (рис. 29, г).
С совершенствованием техники наложения лигатуры наблюдалось повышение числа дробящихся в культуре эмбрионов. В 1981 году количество удачных перевязок эмбрионов составило около 80$.
Как уже было указано в разделе 2,5, в качестве лигатуры нами апробировались различные материалы, в результате чего по физическим свойствам была выбрана капроновая нить диаметром 15 мкм.
Встала задача определить степень влияния контакта нити с поверхностью эмбриона на ритм его дробления.
С этой целью мы выполнили эксперимент параллельного культивирования 20 морфологически нормальных двубластомерных эмбрионов кролика контактирующих и неконтактирующих с синтетической нитью. Технически это было выполнено помещением эмбрионов в пустые петли из синтетической нити.
Как оказалось, контакт поверхности эмбрионов с синтетической нитью не нарушал естественного ритма их дробления.
Из 36 проведенных нами экспериментов (табл. 5) лишь в 5 (13,9$) (эксперименты Ш 2, 6, 14, 15, 24) дробления эмбрионов не наблюдали, причем, в трех из них одновременно не развивались и эмбрионы, поставленные для контроля (эксперименты J№ 6, 14,24). По-видимому, эти неудачи были обусловлены плохим качеством питательной среды.
Из 31 эксперимента, в которых наблюдали дробление перевязанных пополам двубластомерных эмбрионов/в своем большинстве они дробились асинхронно (38,3) Однако, было зарегистрировано и синхронное дробление разобщенных бластомеров(4,6$). Причем, в одних экспериментах наблюдали одновременно как асинхронное, так и синхронное дробление (II,,7$) эмбрионов, в других только асинхронное или только синхронное. Общее количество дробящихся эмбрионов варьировало от 25 до 76,6$, В контроле дробилось до 100$ эмбрионов.
