Введение к работе
Актуальность темы исследования
Вопросы, связанные с обеспечением безопасности гемотрансфузий, остаются одними из самых важных в клинической и лабораторной практике. Несмотря на применение в службе крови высокочувствительных и специфичных методов тестирования доноров, в большинстве случаев позволяющих обеспечить безопасность гемотрансфузий, остается риск инфицирования реципиента при использовании компонентов крови от доноров, находящихся в периоде серонегативного окна [Дашкова Н.Г., 2006; Рагимов А.А., 2012; Zou S, Dorsey KA, Notari EP, et al, 2010].
С целью минимизации периода серонегативного окна и оптимизации лабораторного скрининга донорской крови в ряде стран с конца 90-х годов XX столетия используют молекулярные технологии, в частности ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Появление мульти-плексных систем и международный опыт динамической оценки остаточного риска способствовали внедрению NAT-тестирования (метод амплификации нуклеиновых кислот) не только на гепатит С и ВИЧ- инфекцию, но и на гепатит В [Федоров H.A., Елов А.А., Черкасов Е.Г., 2005; Филатов Ф.П., 2005; Kleinman SH, Lelie N, Busch MP, 2009]. Несмотря на то, что в мире накоплен десятилетний опыт применения NAT- тестирования донорской крови, в России подходы к применению молекулярных тестов только формируются, а целесообразность обязательного NAT-скрининга в Службе крови до сих пор обсуждается. В нашей стране с 2011 года на законодательном уровне регламентировано использование в качестве дополнительных методов молекулярно-биологические исследования и мультиплексный анализ, позволяющий одновременно обнаруживать ДНК или РНК сразу нескольких вирусов (Постановление Правительства РФ №1230 от 31.12.2010). В связи с этим, на современном этапе развития гемобезопасности актуальной задачей является внедрение в практику технологий мультиплексного NAT-тестирования и оценка их эффективности в сертификации крови доноров и реципиентов.
В последние десятилетие стало очевидным, что кроме обязательного тестирования донорской крови на гепатит B, C и ВИЧ инфекцию необходимо выполнять исследования по выявлению патогенов, способных оказать существенное влияние на безопасность гемокомпонентой терапии, особенно для группы иммунокомпрометированных больных. В этой связи важное значение приобретают гемотрансмиссивные герпесвирусы (СMV, EBV, HHV-6), способные вызывать серьезные осложнения у реципиентов после гемотрансфузий: гепатит, инфекционный мононуклеоз, болезнь «трансплантат против хозяина» и др. [Масчан А.А. , 2001; Hudnall SD, Stanberry LR. 2006]. Вопрос возможности применения мультиплексных тест-систем с целью расширения перечня регламентированных вирусных инфекции для скрининга донорской крови остается малоисследован.
Иммунологическая безопасность гемотрансфузий является центральной задачей трансфузионной медицины. Наличие в переливаемых компонентах крови донора специфических анти-HLA I и II классов может спровоцировать развитие ТРАЛИ (связанное с трансфузией острое повреждения легких), которое по данным FDA является ведущей причиной посттрансфузионной летальности [Bux J, Sachs UH., 2007]. Более 40 лет методика выявления антител с помощью лимфоцитотоксического теста была единственной и до настоящего времени широко применяется в клинической лабораторной диагностике. Современные технологии мультиплексного анализа открывают новые возможности в совершенствовании, стандартизации и оптимизации скрининга антилейкоцитарных антител. Исследования в этой области являются перспективными, но в отечественной медицинской литературе публикации крайне немногочисленны.
Таким образом, вопрос необходимости изучения и внедрения высокочувствительных мультиплексных систем для обеспечения безопасности гемотрансфузий и повышения эффективности скрининга донорской крови является актуальным.
Цель работы
Совершенствование и оптимизация лабораторного скрининга донорской крови на основе внедрения современных мультиплексных технологий.
Задачи исследования
-
Изучить возможности выявления гемотрансмиссивных инфекций (HBV, HCV, HIV) у доноров крови и ее компонентов с помощью мультиплексной тест-системы ПЦР в реальном времени в формате минипул тестирования и параллельном ИФА скрининге.
-
Определить критерии пулирования образцов донорской крови при NAT тестировании, применяя «закрытые» системы с полной автоматизацией процесса и «открытые» с ручным выделением.
-
Оценить распространённость и вирусную нагрузку EBV, CMV, HHV6 при скрининге доноров крови с использованием мультиплексной технологии ПЦР в реальном времени и методом ИФА.
-
Оценить медико-экономическую эффективность использования отечественных мультиплексных систем и целесообразность внедрения обязательного NAT- скрининга донорской крови.
-
Сравнить встречаемость и распределение анти-HLA антител с помощью технологии мультиплексного анализа хMAP Luminex и твердофазного иммуноферментного метода среди различных групп доноров.
Научная новизна
Показана целесообразность внедрения современных молекулярно-биологических методов на базе мультиплексных систем в Службу крови с целью оптимизации алгоритма лабораторного скрининга и повышения безопасности гемотрансфузий.
При тестировании донорской крови методом ПЦР в мультиплексном формате выявлены молекулярные маркеры гемотрансмиссивных инфекций в период серонегативного окна и определена их вирусная нагрузка. Установлено, что применение мультиплексных систем позволяет уменьшить себестоимость исследований, трудозатраты, время выполнения, расширить спектр диагностических маркеров и снизить посттрансфузионный риск передачи вирусных инфекций. Сформулированы критерии определения размера пула.
С помощью мультиплексной тест-системы методом ПЦР в реальном времени у доноров крови определена распространённость и количество ДНК CMV, EBV, HHV-6 в сравнении с серологическими маркерами с целью расширения перечня регламентированных вирусных инфекции при скрининге донорской крови.
Установлено, что для скрининга анти-HLA антител метод проточной цитометрии на основе хMAP Luminex более чувствительный и специфичный по сравнению с твердофазным иммуноферментным. Показана необходимость применения высокочувствительных мультиплексных технологий для антилейкоцитарного скрининга всех групп доноров.
Практическая значимость работы
Показана возможность использования единой мультиплексной технологической платформы для скрининга донорской крови. Установлена высокая эффективность мультиплексных систем в обеспечении вирусной безопасности гемотрансфузий
Данные о распространенности герпесвирусов (CMV,EBV, HHV-6) свидетельствуют о необходимости применения дополнительного скрининга доноров и подборе гемокомпонентов для группы иммуно-компрометированных реципиентов, нуждающихся в регулярном трансфузиологическом пособии. Методы ИФА и ПЦР в диагностике гемотрансмиссивных инфекций взаимно дополняют друг друга.
Применение высокочувствительных мультиплексных технологий на основе Luminex позволяет получать новые данные о распространенности и распределении антилейкоцитарных антител, которые используются для анализа эффективности стратегии обследования различных категорий доноров и разработки комплекса мероприятий, направленных на снижение риска развития связанного с трансфузией острого повреждения легких.
Внедрение результатов исследования в практику
Материалы диссертации используются в практической работе клинико-диагностической лаборатории Центра крови Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, в работе отделения трансфузиологии Российского научного центра хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН, при обучении курсантов кафедры «Клиническая трансфузиология» факультета послевузовского профессионального образования врачей Московского Государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Применение мультиплексного NAT скрининга донорской крови позволяет выявлять инфицированных доноров в период серонегативного «окна». Методы ИФА и ПЦР в диагностике гемотрансмиссивных инфекций взаимно дополняют друг друга.
-
Единая мультиплексная технология для скрининга донорской крови повышает эффективность обеспечения безопасности гемотрансфузий.
-
Высокая распространенность и вирусная нагрузка герпесвирусов среди доноров крови свидетельствует о необходимости проведения дополнительного скрининга с целью повышения вирусной безопасности для иммунокомпроментированных реципиентов.
-
Мультиплексное выявление антилейкоцитарных антител на основе технологии хMAP Luminex превосходит по чувствительности и специфичности метод ИФА. Высокая распространенность анти-HLA антител напрямую коррелирует с количеством беременностей в анамнезе. Среди различных групп доноров у мужчин без гемотрансфузий и женщин без беременностей и гемотрансфузий в анамнезе также выявляются анти-HLA-антитела.
Апробация работы
Апробация состоялась 12.04.2013 г. на объединенной научной конференции лабораторий иммунологии и регуляторных механизмов в хирургии, клинической биохимии, профилактики и лечения инфекции в хирургии, трансфузиологии с экспедицией Российского научного центра хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН и кафедры клинической трансфузиологии факультета послевузовского профессионального образования врачей Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова. Результаты исследования были доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010», а также в виде устных докладов на семинаре «NAT-скрининг как стандарт безопасности в службе крови» (Мадрид, Испания 18-21 августа, 2012 года), Всероссийской научно-практической конференции «Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови» (Санк-Петербург, 22-23 марта 2012 года). Стендовые доклады были представлены: AABB Annual Meeting and CTTXPO (Boston, MA,October 6-9, 2012), 32nd International Сongress of the International Society of Blood Transfusion in joint cooperation with the 10th Congress of AMMTAC (Cancun, Mexico, July 7-12, 2012), 22nd Regional Congress of the ISBT (Asia, Taipei, Taiwan, November 19-23, 2011 ), AABB Annual Meeting (San Diego, October 22-25, 2011).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы состоит из 159 наименований, из которых отечественных 19, зарубежных 140. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 8 рисунками.
![Обеспечение качества и безопасности полученной эферезом свежезамороженной плазмы в военно-медицинском учреждении [Электронный ресурс]](/i/i/4438/184435.png "Обеспечение качества и безопасности полученной эферезом свежезамороженной плазмы в военно-медицинском учреждении [Электронный ресурс] Кононенко Светлана Николаевна")
