Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1 Этиология ишемического инсульта 16
1.2 Классификация ишемического инсульта 16
1.3 Общие аспекты патогенеза ишемического инсульта 17
1.4 Роль воспаления в патогенезе ишемического инсульта 21
1.5 Роль системного воспаления в патогенезе ишемического инсульта 28
1.6 Понятие об опиоидергической нейротрансмиттерной системе 31
1.7 Основные принципы профилактики и лечения ишемического инсульта... 34
1.8 Понятие о транскраниальной электростимуляции 37
1.8.1 Центральные эффекты ТЭС-терапии 38
1.8.2 Периферические эффекты ТЭС-терапии
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 44
2.1 Характеристика групп животных 44
2.2 Методы исследования 45
2.2.1 Методика наркоза 45
2.2.2 Методика моделирования ишемического инсульта у крыс 45
2.2.3 Методика осуществления ТЭС-терапии у крыс 47
2.2.4 Методика эвтаназии у крыс 49
2.2.5 Методика забора крови 49
2.2.6 Методика иммуноферментного анализа содержания -эндорфина в плазме крови крыс 49
2.2.7 Методика иммуноферментного анализа содержания интерлейкина-1 в плазме крови крыс 50
2.2.8 Методика иммуноферментного анализа содержания интерлейкина-6 в плазме крови крыс 2.2.9 Методика иммуноферментного анализа содержания фактора некроза опухолей- в плазме крови крыс 52
2.2.10 Методика иммуноферментного анализа содержания интерлейкина в плазме крови крыс 53
2.2.11 Методика иммуноферментного анализа содержания трансформирующего фактора роста-1 в плазме крови крыс 54
2.2.12 Методики гистологических исследований 55
2.2.13 Методика определения размеров очага ишемии в головном мозге у
крыс 59
2.3 Статистические методы обработки полученных данных 60
ГЛАВА 3. Гистологическая картина зоны ишемии при моделировании ишемического инсульта без проведения и с применением ТЭС-терапии 62
3.1 Гистологическая картина зоны ишемии при моделировании ишемического инсульта 62
3.2 Гистологическая картина зоны ишемии при моделировании ишемического инсульта при применении ТЭС-терапии 74
3.3 Изменение объема очага инфаркта мозга при моделировании ишемического инсульта без проведения и с применением ТЭС-терапии 84
ГЛАВА 4. Динамика содержания цитокинов и -эндорфина в плазме крови крыс при моделировании ишемического инсульта 87
4.1 Динамика содержания цитокинов в плазме крови крыс при моделировании ишемического инсульта 87
4.1.1 Динамика содержания фактора некроза опухоли- у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 87
4.1.2 Динамика содержания интерлейкина-1 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 89
4.1.3 Динамика содержания интерлейкина-6 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 91
4.1.4 Динамика содержания интерлейкина-10 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 94
4.1.5 Динамика содержания трансформирующего фактора роста- у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 96
4.2 Динамика содержания -эндорфина у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 98
4.3 Динамика содержания цитокинов в плазме крови крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии 100
4.3.1 Динамика содержания фактора некроза опухоли- у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии 100
4.3.2 Динамика содержания интерлейкина-1 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии 102
4.3.3 Динамика содержания интерлейкина-6 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии 104
4.3.4 Динамика содержания интерлейкина-10 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии 107
4.3.5 Динамика содержания трансформирующего фактора роста-1 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии 109
4.4 Динамика содержания -эндорфина у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии 111
4.5 Динамика содержания цитокинов в плазме крови крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с последующим использованием ТЭС-терапии 113
4.5.1 Динамика содержания фактора некроза опухоли- у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с последующим использованием ТЭС-терапии 113
4.5.2 Динамика содержания интерлейкина-1 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с последующим использованием ТЭС-терапии 115
4.5.3 Динамика содержания интерлейкина-6 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с последующим использованием ТЭС-терапии 117
4.5.4 Динамика содержания интерлейкина-10 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с последующим использованием ТЭС-терапии 119
4.5.5 Динамика содержания трансформирующего фактора роста-1 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с последующим использованием ТЭС-терапии 121
4.6 Динамика содержания -эндорфина у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с последующим использованием ТЭС-терапии 123
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 126
Выводы 142
Практические рекомендации 144
Список литературы
- Общие аспекты патогенеза ишемического инсульта
- Методика иммуноферментного анализа содержания -эндорфина в плазме крови крыс
- Гистологическая картина зоны ишемии при моделировании ишемического инсульта при применении ТЭС-терапии
- Динамика содержания цитокинов в плазме крови крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии
Общие аспекты патогенеза ишемического инсульта
Наиболее употребляемой классификацией ишемического инсульта является TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) [H. P. Adams, B. H. Bendixen, L. J. Kappelle et al., 1993; E. C. Jauch, J. L. Saver,H. P. Adams et al., 2013], согласно ей в зависимости от основного механизма возникновения острой локальной церебральной ишемии, выделяют пять патогенетических вариантов инсульта: - атеротромботический возникает вследствие стеноза или окклюзии крупных артерий, в результате атеротромбоза или фрагментации атеросклеротической бляшки; - кардиоэмболический - источником эмболов, приводящих к окклюзии сосудов мозга, является сердце (аритмии, фибрилляция предсердий, патология клапанного аппарата сердца, инфаркт миокарда); - лакунарный – развивается вследствие окклюзии артерий малого калибра (артериальная гипертензия и сахарный диабет); - ишемический - связан с нарушениями гемодинамики и развитием острой локальной церебральной ишемии, не атеросклеротическими васкулопатиями, расслоением стенки артерий, состояниями, сопровождающимися гиперкоагуляцией крови. - ишемический - неизвестного происхождения (инсульты с неустановленной причиной или с наличием двух и более возможных причин).
По степени тяжести выделяют [В. Н. Шток, О. С. Левин, 2006]: - малый инсульт- возникающая неврологическая симптоматика регрессирует в течение первых 21 дня заболевания; - инсульт легкой и средней тяжести - преобладает очаговая неврологическая симптоматика; - тяжелый инсульт - присутствует выраженная общемозговая симптоматика с угнетением сознания, признаками отека мозга, грубым очаговым неврологическим дефицитом, часто с дислокационными синдромами, вегетативными и трофическими нарушениями;
В зависимости от локализации инфаркта мозга в определенном сосудистом бассейне выделяют [МКБ-10; В. Н. Шток, О. С. Левин, 2006]: синдром средней мозговой артерии; синдром передней мозговой артерии; синдром задней мозговой артерии; синдромы верхней, передней и задней нижних мозжечковых артерий и другие сосудистые синдромы головного мозга.
Ткань ГМ характеризуется чрезвычайно высоким уровнем аэробного энергетического метаболизма. Отсюда следует, что именно уровень оксигенации, напрямую связанный с кровоснабжением, является лимитирующим фактором определяющим жизнеспособность ткани мозга в краткосрочной перспективе [Е. И. Гусев, В. И. Скворцова, 2001; S. H. Graham, J. Chen, 2001; J. Graulich et al., 2002; A. N. Clarkson, B. A. Sutherland, I. Appleton, 2005; A. Durukan, T. Tatlisumak, 2007; К. П. Иванов, 2010; М. Бэр, 2011; Ю. И. Зильбертер, Т. М. Зильбертер, 2012; N. W. Manning et al., 2014]. Поэтому основу патогенеза ИИ, вне зависимости от патогенетического варианта его развития, составляет «острая локальная церебральная ишемия» и реакция организма на нее, определяемая, прежде всего, реактивностью единой нейроиммуноэндокринной системы [Е. И. Гусев, В. И. Скворцова, 2001; А. Х. Каде, А. П. Парахонский, 2004; А. А. Мольберг, Т. В. Гришина, 2006; А. Ф. Повещенко, В. В. Абрамов, В. А. Козлов, 2007; А. А. Олейник, Р. С. Вастьянов, 2008; М.А. Самоструева, Д. Л. Теплый, И. Н. Тюренков, 2009; Г. Н. Крыжановский, С. В. Магаева, 2010; Ж. В. Титова, Г. М. Бодиенкова, 2013]. «Острая локальная церебральная ишемия» означает острое ограничение кровоснабжения ГМ в отдельном артериальном бассейне. Она является динамическим и потенциально обратимым процессом [Е. И. Гусев, В. И. Скворцова, 2001; W. S. Smith, 2004; К. П. Иванов, 2010; М. Бэр, 2011; N. W. Manning et al., 2014].
Инфаркт мозга - область нежизнеспособной ткани мозга, возникшая, в том числе, в результате острой локальной церебральной ишемии. Инфаркт является зоной необратимого морфологического дефекта [Е. И. Гусев, В. И. Скворцова, 2001; N. W. Manning et al., 2014; Е. И. Гусев, М. Ю. Мартынов, П. Р. Камчатнов, 2013].
Последовательность метаболических реакций ткани ГМ, возникающих в ответ на снижение мозгового кровотока [T. R. Anderson, R. D. Andrew, 2002; W. S. Smith, 2004; Л. П. Соколова, 2011; Е. И. Гусев, М. Ю. Мартынов, П. Р. Камчатнов, 2013; N. W. Manning et al., 2014; K. A. Hossmann, 2012] подразделяют на несколько критических этапов: первый критический этап - развивается при снижении кровотока до 70% от нормального уровня (менее 50-55 мл на 100 гр вещества мозга в минуту) -возникает торможение белкового синтеза с изменением профиля образующихся белков; второй критический этап - развивается при дальнейшем снижении кровотока до 45- 50% от нормальной величины (до 35 мл на 100 гр вещества мозга в минуту) - происходит активация анаэробного гликолиза, завершающаяся развитием тканевого лактат-ацидоза и цитотоксического отека; третий критический этап - наступает при дальнейшем снижении кровотока до 20 мл на 100 гр вещества мозга в минуту - характеризуется прогрессирующим энергодефицитом, приводящим к нарушению активного ионного транспорта и мембранных электрических процессов, сопровождается выбросом возбуждающих аминокислот и затруднением их обратного поглощения (ранняя фаза глутаматной эксайтотоксичности); четвертый критический этап - наступает при снижении мозгового кровотока до 20% от нормальной величины (10-15 мл на 100 гр вещества мозга в минуту) -возникает необратимое повреждение клеток, характеризующееся аноксической деполяризацией мембран;
Методика иммуноферментного анализа содержания -эндорфина в плазме крови крыс
В Институте физиологии им. И.П. Павлова АН СССР и ВНИИ пульмонологии МЗ СССР В. П. Лебедевым и соавт. (1983) был разработан и экспериментально обоснован оптимальный режим ТЭС: частота непрерывных импульсов или пачек высокочастотных импульсов 77±0,5 Гц, длительность импульса 3,75±0,25 мс при соотношении постоянного и среднеимпульсного тока 2:1-5:1 [Я. С. Кацнельсон, 1985]. Указанные параметры тока являются строго критичными. При изменении частоты или длительности импульса, а также соотношения между величинами постоянного и импульсного тока анальгетический эффект (АЭ) резко ослабевает. Расположение электродов при ТЭС – фронто-мастоидальное. Проводится ТЭС при помощи электростимуляторов «ТРАНСАИР» и «ЭТРАНС» различных модификаций.
В ауторадиографических экспериментах с помощью [14С] деоксиглюкозы, которая накапливается в нервных клетках в соответствии с уровнем их возбуждения, было установлено, что ТЭС приводит к селективной активации структур, относящихся к антиноцицептивной системе (АНС) ствола мозга (дорсомедиальные ядро гипоталамуса, серое околоводопроводное вещество, ядра шва) [В. П. Лебедев и соавт., 1986], при этом происходит блокада проведения восходящих болевых импульсов в кору головного мозга. При исследовании конкурентного взаимодействия эндогенных опиоидов, выделяющихся на фоне ТЭС, наиболее выраженное вытеснение меченого лиганда--опиоидных рецепторов (2-125-I-морфина) было отмечено именно в структурах АНС [Л. Н. Айрапетов и соавт., 1987].
При исследовании внутричерепных путей распространения тока с помощью ядерно-магнитнорезонансной томографии было установлено, что только при расположении электродов, обеспечивающим сагитальное направление тока, последний имеет доступ к основным элементам АНС [M. L. G. Joy et al., 1993; M. L. G. Joy et al., 1994]. При проведении ТЭС – терапии в активации структур АНС [В. П. Лебедев и соавт., 1983] ведущая роль принадлежит эндогенным опиатным механизмам [А. Б. Савченко, 1994]. В более поздних публикациях выявлено участие серотонинергического, дофаминергического и холинергического механизмов в реализации стимуляционной анальгезии [В. П. Лебедев и соавт., 1991; А. Б. Савченко, 1994].
Опиоидная природа медиаторов, выделяемых при ТЭС подтверждена многочисленными экспериментальными и клиническими наблюдениями [В. П. Лебедев и соавт., 1986]. Показано, что во время и после сеанса ТЭС – терапии в мозге и спинномозговой жидкости увеличивается уровень ключевого опиоидного пептида – -эндорфина [Л. И. Айрапетов и соавт., 1985; В. П. Лебедев и соавт., 1986]. Подобные эффекты наблюдаются также при непосредственной электростимуляции структур ствола мозга, относящихся к АНС [Е. О. Брагин, 1991].
Наряду с увеличением содержания опиоидных пептидов в структурах мозга и ликворе животных, на фоне ТЭС-терапии в режиме анальгезии отмечается, определяемое радиоиммунным методом, резкое увеличение -эндорфина в плазме крови экспериментальных животных (кролики, мыши, крысы, кошки) и человека [А. Б. Савченко, 1994].
Устранение обезболивания после введения налоксона – блокатора опиоидных рецепторов, свидетельствует об участии опиоидного нейрохимического механизма в формировании АЭ при ТЭС [В. П. Лебедев и соавт., 1988].
У животных с толерантностью к морфину АЭ отсутствует и появляется по мере ее исчезновения [В. П. Лебедев и соавт., 1988]. У лиц с пониженной чувствительностью к опиатам, обусловленной их периодическим применением или врожденными особенностями организма, АЭ также не наблюдается [В. П. Лебедев и соавт., 1986]. Д-лейцин и Д-фенилаланин – ингибиторы энкефалиназ (карбоксипептидаза А и др.) – ферментов, осуществляющих деградацию энкефалинов, потенцируют АЭ [В. П. Лебедев и соавт., 1988], что также свидетельствует об участии опиоидных пептидов в эффектах стимуляции АНС.
К центральным эффектам ТЭС-терапии помимо АЭ, относят центральный гемодинамический эффект. Экспериментальные исследования показали, что ТЭС в том же узком диапазоне характеристик, который необходим для развития АЭ, эффективно стабилизирует гемодинамику [В. П. Лебедев и соавт., 1986; Я. С. Кацнельсон, В. А. Леоско, 1987].
Основой исследований периферических эффектов ТЭС-терапии, которые в значительной степени опосредованы иммунными механизмами, послужило открытие ОР на разных типах клеток иммунной системы, что подчеркивает важность их роли в процессах иммунорегуляции [I. H. Jonsdottir, 2000; H. Machelska, K. Stein, 2003; H. L. Rittner, A. Brack, C. Stein, 2008; И. Л. Шаравьева, 2011;Т. А. Баева, 2006; Т. А. Баева, В. О. Небогатиков, 2012; К. Г. Горшкова, 2012; J. M. Bidlack, 2000; Ю. А. Ковалицкая, Е. В. Наволоцкая, 2011; J. B. S. Garsia, M. G.de Melo Cardoso, M. C. Dos-Santos, 2012].
Модуляция ТЭС динамики острофазного ответа в условиях асептического воспалительного процесса в значительной степени обусловлено указанной способностью опиоидных пептидов [Н. Л. Грицкевич и соавт., 1987; Н. Л. Грицкевич и соавт.,1991; Н. Л. Грицкевич и соавт.,1993]. Способность ТЭС-терапии в режиме анальгезии вызывать противовоспалительный эффект используется при использовании ТЭС-терапии в комплексной терапии воспалительных заболеваний в различных системах организма [А. П. Голиков и соавт., 1989; В. А. Александрова и соавт., 1994; В. С. Тиликин и соавт., 2012]. Изучение влияния ОП, высвобождающихся при ТЭС-терапии, на процесс репарации тканей и регенераторные процессы нервных стволов, в работах с экспериментальной перерезкой седалищного нерва у крыс, показано, что ТЭС-терапия ускоряет процесс репарации тканевых дефектов в среднем на 17-20% [В. П. Лебедев и соавт., 1986; А. Б. Савченко 1994], реиннервацию двигательных нервных волокон на 30%, чувствительных - на 20% [Г. Н. Акоев и соавт., 1990; Л. И. Колосова и соавт., 1990]. Благодаря этому ТЭС-терапия используется в комплексной терапии нейросенсорной тугоухости [А. С. Роземблюм и соавт., 1998; Н. И. Краева и соавт., 1998], язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [Ю. Д. Зильбер и соавт., 1987; Ю. Д. Зильбер и соавт., 1988; С. В. Рычкова, В. А. Александрова, 1991; С. В. Рычкова 1992; В. А. Александрова и соавт., 1994; Р. В. Шапоренко, 2008]; инфаркта миокарда [А. П. Голиков и соавт., 1989; Е. А. Губарева, 2009; В. Г. Борисенко, 2009], гестоза [С. П. Вчерашнюк, 2011].
ТЭС-терапия применяется для лечения ожогов и операционных травм. По данным кафедры общей и клинической патофизиологии Кубанского государственного медицинского университета благодаря использованию ТЭС-терапии сокращалось время заживления ожогов («легкие» на 25,8%, «тяжелые» на 16,8%) и операционной травмы на 18,7%, что позволяло сокращать сроки пребывания больных в стационаре [Ю. А. Богданова, 2003]. ТЭС-терапия оказывает гомеостатическое действие на уровень артериального давления [В. П. Лебедев и соавт., 1992; Н. В. Зюзина, 2006].
Показано что, под влиянием ТЭС-терапии отмечается тенденция к нормализации артериального давления [В. А. Заболотных, И. И. Заболотных, 1998]. Этот эффект ТЭС-терапии особенно выражен при вегетососудистых дистониях, как эссенциальных, так и климактерических [Г. А. Акимов и соавт., 1991]. Приоритетность и новизна такого способа лечения подтверждена авторским свидетельством СССР [В. А. Заболотных и соавт., 1987].
Гистологическая картина зоны ишемии при моделировании ишемического инсульта при применении ТЭС-терапии
Исследуемые и контрольные образцы на первой стадии анализа инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. ФНО-, имеющийся в образцах, связывался с иммобилизованными антителами. Материал, который не связался удаляли отмывкой буферным раствором, основным компонентом которого является фосфатно-солевой буфер с детергентом. Конъюгат №1 (антитела к ФНО- с биотином) взаимодействовал со связавшимся ФНО-. Не связавшийся конъюгат №1 удаляли отмывкой. Связавшийся конъюгат №1 на третьей стадии при инкубации взаимодействовал с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 после третьей отмывки определяли цветной реакцией с субстратом пероксидазы хрена -перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Добавлением раствора стоп-реагента – 0,1 N HCl реакцию останавливали и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Количество, содержащегося в образце ФНО-, было пропорционально интенсивности окрашивания раствора в лунке. Все этапы реакции проходили на шейкерах-инкубаторах «ST-3» (Латвия), в термостатируемых условиях. Учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации анализов проводили на фотометре вертикального сканирования «ANTHOS 2010» (Австрия) с помощью программного обеспечения «Auswerte-Softwere anthos labtec», версия 2.3.0.7.
Определение уровня ИЛ-10 в плазме крови проводили иммуноферментным методом с помощью набора «Ray Biotech, Inc.» (Германия). Основным реагентом комплекта являются моноклональные антитела к ИЛ-10, сорбированные на поверхности лунок полистирольного планшета, конъюгаты поликлональных антител к ИЛ-10 с биотином и калибровочные образцы, содержащие ИЛ-10. Исследуемые и контрольные образцы, на первой стадии анализа, инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. ИЛ-10, имеющийся в образцах, связывался с иммобилизованными антителами. Материал, который не связался удаляли отмывкой буферным раствором, содержащим фосфатно-солевой буфер с детергентом. С конъюгатом №1 (антитела к ИЛ-10 с биотином) взаимодействовал связавшийся ИЛ-10. Конъюгат №1, который не связался удаляли отмывкой. Связавшийся конъюгат №1 на третьей стадии взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 после третьей отмывки определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Добавлением раствора стоп-реагента – 0,1 N HCl реакцию останавливали и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Количество содержащегося в образце ИЛ-10 было пропорционально интенсивности окрашивания раствора в лунке. Все этапы реакции проходили на шейкерах-инкубаторах «ST-3» (Латвия) в термостатируемых условиях. Учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации анализов проводили на фотометре вертикального сканирования «ANTHOS 2010» (Австрия) с помощью программного обеспечения «Auswerte-Softwere anthos labtec», версия 2.3.0.7.
Определение уровня ТФР-1 в плазме крови проводили иммуноферментным методом с помощью набора «Boster Biological Technology Co., Inc.» (США). Основным реагентом комплекта являются моноклональные антитела к ТФР-1, сорбированные на поверхности лунок полистирольного планшета, конъюгаты поликлональных антител к ТФР-1 с биотином и калибровочные образцы, содержащие ТФР-1. Исследуемые и контрольные образцы на первой стадии анализа инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. ТФР-1, имеющийся в образцах, связывался с иммобилизованными антителами. Материал, который не связался удаляли отмывкой буферным раствором, содержащим фосфатно-солевой буфер с детергентом. С конъюгатом №1 (антитела к ТФР-1 с биотином) взаимодействовал связавшийся ТФР-1. Конъюгат №1, который не связался, удаляли отмывкой. Связавшийся конъюгат №1 на третьей стадии взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 после третьей отмывки определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Добавлением раствора стоп-реагента – 0,1 N HCl реакцию останавливали и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Количество содержащегося в образце ТФР-1 было пропорционально интенсивности окрашивания раствора в лунке. Все этапы реакции проходили на шейкерах-инкубаторах «ST-3» (Латвия) в термостатируемых условиях. Учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации анализов проводили на фотометре вертикального сканирования «ANTHOS 2010» (Австрия) с помощью программного обеспечения «Auswerte-Softwere anthos labtec», версия 2.3.0.7.
Из ГМ, взятого после эвтаназии крыс, (половина органа из каждой группы) на границе очага ишемии вырезались кусочки размером 3 мм. Их фиксировали в 10% нейтральном забуференном фосфатами формалине в течение 2 суток. Затем в течение 2 часов фиксированную ткань ГМ выдерживали в проточной водопроводной воде. Ручную проводку забранного материала (ткани ГМ) выполняли с использованием изопропилового спирта с минеральным маслом до парафина [М. В. Пешков, И. И. Дыгало, 2009; Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров, 2010]. Заливку осуществляли парафином. После вырезки парафиновых блоков их устанавливали на деревянные блоки.
Динамика содержания цитокинов в плазме крови крыс с экспериментальным ишемическим инсультом с предварительным использованием ТЭС-терапии
Острое асептическое воспаление лежит в основе расширения зоны инфаркта мозга в течение первой недели после возникновения инсульта [K. J. Becker, 2001; G. J. del Zoppo,K. J. Becker, J. M. Hallenbeck, 2001; M. D. Ginsberg, 2003; M. Fisher, R. Ratan, 2003; P. L. Wood, 2003; R. Markus, D. C. Reutens, S. Kazui, 2004; Y. D. Wen, H. L. Zhang, Z. H. Qin, 2006; Q. Wang, X. N. Tang, M. A. Yenari, 2007; А. Х. Хана-Мурад, Л. И. Павлинова, А. А. Мокрушин, 2007; A. Tuttolomondo, D. Di Raimondo, R. Di Sciacca, 2008; J. Jordan et al., 2008; D. Amantea et al., 2008; C. Benakis, L. Hirt, R. A. Du Pasquier, 2009; Ю. Д. Губарев, А. О. Шеремет, 2009; А. С. Кость, Б. Д. Луцик, Л. Е. Лаповець, 2010; A. G. Ceulemans et al., 2010; Y. Lee et al., 2014; М. В. Онуфриев и соавт., 2014]. Активность воспалительной реакции в очаге ишемии обусловлена возрастанием уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8) [Е. И. Гусев, В. И. Скворцова, 2001; N. Quan, M. Herkenham, 2002; А. А. Аракелян и соавт., 2005; Л. Н. Кашаева, Л. М. Карзакова, В. Н. Саперов, 2005; Q. Wang, X. N. Tang, M. A. Yenari, 2007; D. Amantea et all., 2008; M. Y. Zuidema, C. Zhang, 2010; М. В. Онуфриев, 2014]. ФНО-, ИЛ-1 и ИЛ-6, являются ключевыми медиаторами микроглиальных нейроиммунных процессов и вырабатываются локально в ответ церебральную ишемию [A. C. H. Yu, L.T. Lau, 2000; H. Boutin et al., 2001; Y. D. Wen, H. L. Zhang, Z. H. Qin, 2006; A. Tuttolomondo et al., 2008; S. Shenharsarfaty et al., 2008; S.Choi, W. J. Friedman, 2009; A. Maddahi, L. Edvinsson, 2010; M. Zhang et al., 2011]. ФНО- -плейотропный полипептид, вырабатываемый Нф, активированными МФ, астроцитами и эндотелиальными клетками [J. Zaremba, 2000; С. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев, 2008]. Он оказывает токсической действие на нейроны путем активации системы генерации АФК, что резко индуцирует процессы ПОЛ [J. J. Viel, D. Q. Mc Manus, S. S. Smith, 2001; A. Quintana et al., 2005; А. Е. Бугрова, 2007; R. M. Adibhatla, J. F. Hatcher, 2007; R. M. Adibhatla, R. Dempsey, J. F. Hatcher, 2008; N. Liu et all., 2009; А. В. Алексеенко, 2013]. Таким образом, изменение его содержания влияет на степень повреждения ткани мозга.
При исследовании плазмы крови у крыс группы №1 (интактные животные) уровень ФНО- составил 8,41±2,53 пг/мл (табл. 4.1).
В 1 сутки после моделирования ИИ содержание ФНО- в плазме крови животных группы №2 составило 17,82±11,31 пг/мл, что было достоверно (р0,05) больше на 52,80 %, чем в плазме крови интактных животных (рис. 4.1).
К 3 суткам после моделирования ИИ уровень ФНО- в плазме крови животных, по сравнению с 1 сутками той же группы, достоверно не изменился (р0,05) и составил 18,36±7,20 пг/мл. Это на 54,19% достоверно (р0,05) больше, чем в плазме крови животных группы №1 (табл. 4.1).
Примечание: ФНО- – фактор некроза опухоли-; р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р - достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р - достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р - достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта. На 7 сутки после моделирования ИИ содержание ФНО- в плазме крови животных группы №2, по сравнению с 1 сутками, и животными группы №2 и 3 сутками крыс группы №2 достоверно не изменилось (р0,05) и составило 17,82±3,79 пг/мл, что достоверно(р0,05) больше на 52,80%, чем в плазме крови интактных животных (рис. 4.1).
К 14 суткам после моделирования ИИ уровень ФНО- в плазме крови животных группы №2 составил 21,01±8,06 пг/мл, что, по сравнению с животными группы №1, было достоверно (р0,05) больше на 59,97%, а по сравнению с 3 и 7 сутками у животных группы №2 достоверно не изменился (р0,05).
Таким образом, содержание ФНО- в плазме крови животных группы №2 повышалось с момента моделирования ИИ и оставалось повышенным в течение всего периода наблюдения. Динамика содержания интерлейкина-1 у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом
Синтез ИЛ-1 микроглией в условиях церебральной ишемии является активирующим сигналом для запуска образования других провоспалительных цитокинов, а также стимуляции астроцитов к продукции потенциальных нейротоксичных веществ, таких как NO и метаболиты арахидоновой кислоты [H. Boutin et al., 2001; L. D. Church, P. G. Cook, M. F. Mc Dermott, 2008; S. Choi, W. J. Friedman, 2009; C. A. Dinarello, 2009; C. A. Dinarello, 2011; H. F. Green et al., 2012; J. Galea, D. Brough, 2013; C. Garlanda, C. A. Dinarello, A. Mantovani, 2013].
Примечание:ИЛ-1 – интерлейкин-1; р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р - достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р -достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р - достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.
Через 1 сутки в плазме крови животных группы №2 после моделирования ишемического инсульта концентрация ИЛ-1 составила 464,60±127,43 пг/мл, что достоверно (р0,05) больше на 93,34 %, чем в плазме крови животных группы №1 (рис. 4.2).
К 3 суткам в плазме крови животных группы №2 уровень ИЛ-1 составил 1798,99±586,25 пг/мл, по сравнению с 1 сутками он стал достоверно (р0,05) больше на 74,17% и на 98,28% достоверно больше (р0,05), чем в плазме крови у животных группы №1. Рисунок 4.2. Изменения содержания ИЛ-1 при экспериментальном ишемическом инсульте.
К 7 суткам после моделирования ИИ в плазме крови животных группы №2 содержание ИЛ-1 по сравнению с 1 сутками было достоверно (р0,05) больше на 25,43%. По сравнению с 3 сутками уровень стал достоверно (р0,05) меньше на 65,36% и составило 623,08±56,97 пг/мл (табл. 4.2.). Это достоверно (р0,05) больше на 95,03%, чем в плазме крови животных группы №1 (рис. 4.2).
На 14 сутки после моделирования ИИ в плазме крови у животных группы №2 содержание ИЛ-1 вернулся к уровню 1 суток. По сравнению с 3 сутками уровень ИЛ-1 стал на 77,33% достоверно меньше (р0,05). По отношению к 7 суткам был достоверно (р0,05) меньше на 34,56% и составил 407,73±125,34 пг/мл (табл. 4.2. и рис. 4.2.).
Итак, уровень ИЛ-1 с началом ишемии значительно возрастал, достигая максимума к 7 суткам. К 14 суткам он снижался до уровня, наблюдаемого в 1 сутки после моделирования ИИ. Однако содержание ИЛ-1 оставалось выше контроля на 75,8%.
