Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 14
1.1. Современные представления об окислительном стрессе 14
1.1.1. Повреждающие эффекты АФК . 19
1.2. Динамика прооксидантно-антиоксидантного статуса при ишемии головного мозга. 22
1.3. Метод ТЭС-терапии . 34
1.3.1. Перспективы использования ТЭС-терапии в неврологической практике . 39
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования . 42
2.1. Характеристика групп животных 42
2.2. Методы исследования 43
2.2.1. Методика наркоза . 43
2.2.2. Метод моделирования ишемического инсульта у крыс 43
2.2.3. Методика проведения ТЭС-терапии у крыс 45
2.2.4. Методика проведения эвтаназии у крыс 47
2.2.5. Методика забора крови 47
2.2.6. Методика иммуноферментного анализа содержания -эндорфина в сыворотке крови крыс 47
2.2.7. Методы гистологических исследований 48
2.2.8. Методика определения размеров очага ишемии в головном мозге у крыс . 52
2.2.9. Методики оценки прооксидантно-антиоксидантного статуса биологического материала 54
2.2.10. Амперометрический анализ антиокислительной активности 55
2.2.11. Определение активности каталазы . 56
2.2.12. Определение активности супероксиддисмутазы 57
2.5. Методы статистической обработки полученных результатов . 58
ГЛАВА III. Динамика гистологической картины очага ишемии при моделировании ишемического инсульта без использования и с применением тэс-терапии59
3.1. Динамика гистологической картины очага ишемии при моделировании ишемического инсульта59
3.2. Динамика гистологической картины очага ишемии при моделировании ишемического инсульта при использовании ТЭС-терапии 73
3.3. Динамика объема очага инфаркта мозга при моделировании ишемического инсульта без использования и с применением ТЭС-терапии 82
ГЛАВА IV. Динамика показателей системы про-/антиоксиданты у крыс с моделированным ишемическим инсультом и при использовании тэс-терапии85
4.1. Показатели системы про-/антиоксиданты у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 85
4.2. Показатели системы про-/антиоксиданты у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом при проведении ТЭС-терапии95
4.3. Активность эндорфинергической системы у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом 102
4.4. С Активность эндорфинергической системы у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом на фоне проведения ТЭС-терапии 104
ГЛАВА V. Обсуждение результатов 107
Выводы 122
Практические рекомендации 124 список литературы 125
- Динамика прооксидантно-антиоксидантного статуса при ишемии головного мозга
- Методика иммуноферментного анализа содержания -эндорфина в сыворотке крови крыс
- Динамика гистологической картины очага ишемии при моделировании ишемического инсульта
- Показатели системы про-/антиоксиданты у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом при проведении ТЭС-терапии
Динамика прооксидантно-антиоксидантного статуса при ишемии головного мозга
Снижении уровня мозгового кровотока (МК) менее 55-50 мл на 100 гр. в 1 мин вызывает первый критический уровень в виде торможения белкового синтеза [Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; И. Ф. Беленичев и соавт., 2009; О. А. Баранова, 2011]. Дальнейшее снижение МК, до 35 мл на 100 гр. в 1 мин – второй критический уровень – приводит к значительной активации гликолиза и увеличению концентрации лактата, развитию лактатного ацидоза и тканевого цитотоксического отёка [Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; И. Ф. Беленичев и соавт., 2009; О. А. Баранова, 2011]. Дальнейшее снижение МК до 20 мл на 100 гр. в 1 мин – третий критический уровень – приводит к снижению синтеза макроэргов, формированию энергетической недостаточности, к дисфункции каналов активного ионного транспорта (выходу К+ из клетки и перемещению Na+ и Са2+ в клетку), значительной дестабилизации клеточных мембран и избыточному высвобождению возбуждающих нейромедиаторов – глутамата и аспартата (возникает так называемая «глутаматная эксайтотоксичность»). Перевозбуждение NMDA-рецепторов (N-метил-Д-аспартат) является причиной раскрытия новых кальциевых каналов, вследствие чего обеспечивается дополнительный приток Са2+ в нейроны. Когда МК достигает 20% от нормальной величины (10-15 мл на 100 гр. в 1 мин), развивается аноксическая деполяризация мембран, которая считается главным критерием необратимого поражения клеток [Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; И. Ф. Беленичев и соавт., 2009; О. А. Баранова, 2011].
В развитии каскада патобиохимических и патофизиологических процессов при ишемии выделяют три основные этапа:
этап индукции (запуск);
этап амплификации (усиление повреждающего потенциала);
этап экспрессии (конечные реакции каскада) [Е. И. Гусев, В. И. Скворцова, 2000; Н. М. Жулев и соавт., 2004; И. Ф. Беленичев и соавт., 2009].
Этап индукции. Значительный дефицит макроэргов в мозге приводит к нарушению функции Na+- K+ - АТФ-азной ферментной системы, которая управляет энергозависимым ионным транспортом. Нарушение активного ионного транспорта обусловливает пассивный отток К+ из клеток, приток Са2+, что приводит к деполяризации клеточных мембран. Внутриклеточное накопление ионов Са2+ при мозговой ишемии вызывает значительную перегрузку митохондрий с разобщением тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования и усилением катаболических процессов; оно сопровождается переходом Са2+ в активную форму посредством соединения с внутриклеточным рецептором кальмодулином, что ведёт к активации кальмодулинзависимых протеинкиназ, липаз и эндонуклеаз, фрагментации ДНК, гибели клетки [Е. И. Гусев и соавт., 1999; Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; И. Ф. Беленичев и соавт., 2009; Э. В. Супрун и соавт., 2010; О. А. Баранова, 2011].
Таким образом, уже на самых начальных этапах патобиохимического каскада, запущенного дефицитом макроэргов, начинается процесс внутриклеточного накопления Са2+, являющийся одним из ключевых механизмов запуска как некротической смерти нейрона, так и апоптоза [Е. И. Гусев и соавт., 1999; Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; И. Ф. Беленичев и соавт., 2009; Э. В. Супрун и соавт., 2010; О. А. Баранова, 2011]. Значимым путём поступления Са2+ в клетку являются агонистзависимые кальциевые каналы, в большей мере те, которые контролируются рецепторами, активирующимися возбуждающими аминоацидергическими медиаторами – глутаматом и аспартатом. Повышение их концентрации включает компенсаторные механизмы: обратный захват нейронами и астроцитами избытков из межклеточного пространства, пресинаптическое торможение выброса медиаторов, метаболическую утилизацию. При этом, в условиях ишемии нарушается высокоселективная система переноса глутамата и аспартата из синаптической щели в астроглию за счёт нарушения функции каналов активного ионного транспорта и астроцитоза [Е. И. Гусев и соавт., 1999; Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; О. А. Баранова, 2011]. Трансформируется система путей преобразования медиаторов; это приводит к тому, что абсолютная концентрация и время пребывания глутамата и аспартата в синаптической щели становится выше допустимых пределов, и процесс деполяризации мембран нейронов приобретает необратимый характер [Е. И. Гусев и соавт., 1999; Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; О. А. Баранова, 2011]. Этап амплификации. Этот этап связан с продолжающимся увеличением внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Подъем внутриклеточной концентрации Са2+ вместе с повышением содержания диацилглицерола (ДАГ) изменяет активность многих ферментов, участвующих в модификации мембранных белков, в том числе и глутаматных рецепторов. В результате увеличивается чувствительность нейронов к возбуждающим сигналам. Возникает «порочный круг»: повышенная возбудимость может способствовать дальнейшему накоплению Са2+ и повышенному выделения глутамата из нервных окончаний. Согласно экспериментальным данным, в областях мозга с плотно прилегающими нейронами, содержащими глутаматные рецепторы, одна массивно деполяризованная клетка индуцирует такое высвобождение глутамата, что возбуждает соседние нейроны. Далее в силу вступает «механизм домино» – последовательное распространение метаболических нарушений от нейрона к нейрону. Таким образом, события, происходящие на этапе амплификации, не только увеличивают накопление Са2+, но и усугубляют токсичное возбуждение окружающих нейронов [Е. И. Гусев и соавт., 1999; Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; Э. В. Супрун и соавт., 2010; О. А. Баранова, 2011].
Этап амплификации создаёт условия для третьего этапа – этапа экспрессии, на котором происходят необратимые изменения, приводящие к клеточной смерти. Механизмы, непосредственно повреждающие нейроны и глию, изучены наиболее полно [Е. И. Гусев и соавт., 1999; Н. И. Нечипуренко и соавт., 2008; О. А. Баранова, 2011].
Методика иммуноферментного анализа содержания -эндорфина в сыворотке крови крыс
За 12 часов до проведения эвтаназии у крыс из клеток удалялись кормушки с кормом. Подачу воды не прекращали. Эвтаназия крыс осуществлялась путем декапитации под стандартным наркозом. Животных умерщвляли, соблюдая правила проведения работ при использовании экспериментальных животных. В это же время у крыс проводился забор крови. У мертвых животных изымали головной мозг, для последующего гистологического исследования. Смерть животного устанавливали по отсутствию дыхания и сердечной деятельности.
Забор крови проводили в период эвтаназии. Под наркозом осуществляли выделение и венесекцию общей яремной вены. Сбор крови проводили добавлением 1000 Ед гепарина на 1 мл крови, с целью предотвращения ее свертывания. Крови собирали в объеме 3 мл в пластиковые центрифужные пробирки с пробкой. Затем ее центрифугировали на центрифуге ОП-12 (Россия) в течение 15 минут со скоростью 1500 об/мин. Часть плазмы крови собирали пастеровской пипеткой, замораживали в криопробирках и хранили в холодильнике при -70оC. Все ИФА исследования проведены на базе отдела клинической экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии ЦНИЛ ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России.
Уровень -эндорфина в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью набора «Elabscience Biotechnology Co., Ltd», (Китай). Набор представляет собой комплект, основным реагентом которого являются моноклональные антитела к -эндорфину, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгаты поликлональных антител к -эндорфину с биотином и калибровочные образцы, содержащие -эндорфин. На первой стадии анализа, исследуемые и контрольные образцы, инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах -эндорфин связывался с иммобилизованными антителами. Не связавшийся материал удаляли отмывкой буферным раствором из набора, основными компонентами которого являются фосфатно-солевой буфер с детергентом. Связавшийся -эндорфин взаимодействовал с конъюгатом №1 (антитела к -эндорфину с биотином). Не связавшийся конъюгат №1 удаляли отмывкой. На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливали добавлением раствора стоп-реагента - 0,1 N HCl и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Интенсивность окрашивания раствора в лунке пропорциональна количеству содержащегося в образце -эндорфина. Все этапы реакции проходили в термостатируемых условиях на шейкерах-инкубаторах «ST-3» (Латвия), учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации анализов проводили на фотометре вертикального сканирования «ANTHOS 2010» (Австрия) с помощью программного обеспечения «Auswerte-Softwere anthos labtec», версия 2.3.0.7.
Фиксация, проводка и заливка гистологического материала. Из материала, взятого после эвтаназии крыс: из тканей ГМ (половина органа из каждой группы) на границе очага ишемии вырезались кусочки размером 3 мм. Их фиксация проводилась в 10% нейтральном забуференном фосфатами формалине в течение 2 суток. Затем ткань ГМ выдерживали в проточной водопроводной воде в течение 2 часов. После этого выполняли ручную проводку забранного материала изопропиловым спиртом с минеральным маслом до парафина [М. В. Пешков, И. И. Дыгало, 2009]. Заливку выполняли парафином. Вырезали парафиновые блоки и устанавливали их на деревянные блоки.
Протокол гистологической проводки тканей (ручной) с применением изопропанола и минерального масла (время протокола 30 часов):
1. Изопропанол 60 минут - выливался после использования.
2. Изопропанол 60 минут - переливался в №1
3. Изопропанол 60 минут - переливался в №2
4. Изопропанол 60 минут - переливался в №3
5. Изопропанол 60 минут - переливался в №4. В каждой партии (40 кассет) использовали свежий реагент
6. Изопропанол: минеральное масло 5:1, 50оС - 90 минут. В каждой 3-й партии использовали свежий реагент.
7. Изопропанол: минеральное масло 2:1, 50оС - 90 минут. В каждой 3-й партии использовали свежий реагент.
Динамика гистологической картины очага ишемии при моделировании ишемического инсульта
У интактных крыс группы 1 на микропрепаратах ткани мозга, окрашенных гематоксилин-ээозином, установлено, что в теменной доле коры головного мозга (в зоне кровоснабжения правой средней мозговой артерии) выделяется шесть слоев, с разными видами клеток (рис. 3.1)
В I слое коры выявляются мелкие клетки веретеновидной формы (рис. 3.1.1). Во II, III и IV слоях коры видны в основном зернистые клетки. Они имеют общие черты морфологической организации и сливались между собой (рис. 3.1.2). V слой образуют многочисленные пирамидные клетки крупных размеров (рис. 1.3). VI слой плохо контурируется. Он состоит из веретеновидных клеток и сливается с V слоем (рис. 3.1.3).
Капилляры в ткани мозга (рис. 3.2.1) окружены оптически пустыми пространствами умеренных размеров. Они образованы плотно прилегающими к стенке капилляров отростками астроцитов (рис. 3.2.2). У интактных крыс группы 1, при окраске по Нисслю, на микропрепаратах ткани мозга отмечено преобладание нормохромных клеток в коре теменной доли головного мозга (в области кровоснабжения правой средней мозговой артерии) (рис. 3.3.1).
Они симметричной формы с равномерно распределенной хроматофильной субстанцией цитоплазмы и ядрами округлой формы (рис. 3.3.2).
Для выявления ДНК, содержащейся в ядрах клеток нейроглии коры головного мозга (в зоне кровоснабжения ПСМА), использовали реакцию Фельгена (специфическая реакция фуксинсернистой кислоты с альдегидными группами дезоксирибозы, полученной путем мягкого кислотного гидролиза ДНК. Ее результатом является образование стойкого красителя красно-фиолетового цвета). На микропрепаратах ткани мозга, окрашенных по Чиаччио, выявлено четкое окрашивание, полученное за счет перехода в красный цвет. Из-за окрашивания липидов суданом черным фон становился серо-зеленоватого цвета (рис. 3.4).
Через 1 сутки после моделирования ИИ на микропрепаратах ткани мозга крыс группы 2, окрашенных гематоксилин-эозином, можно выявить область формирующегося инфаркта мозга (рис. 3.5.1).
На микропрепаратах видны, появляющиеся клетки-тени (рис. 3.5.3), единичные нейтрофилы (рис. 3.5.4). Появляются признаки перицеллюлярного отека ткани мозга (рис. 3.5.5). На периферии очага некроза мозговой ткани развивается клеточный ответ (рис. 3.5.2). В центре области ишемии капилляры запустевают и становятся незаметными на общем фоне (рис. 3.5). По периферии очага ишемии они хорошо прокрашиваются (рис. 3.6), в них заметны признаки отека эндотелиоцитов (рис. 3.6.1) и стаза крови. Отмечается адгезия нейтрофилов к эндотелию капилляров (рис. 3.6.2). В некоторых капиллярах заметны признаки сдавления сосудов отечными ножками астроцитов.
Через 1 сутки после моделирования ИИ, при окраске по Нисслю, на микропрепаратах ткани мозга появляются гиперхромные дистрофически измененные нейроны (рис. 3.7.1). Видны признаки инфильтрации ткани мозга нейтрофилами (рис. 3.7.2). Отмечаются единичные проявления нейронофагии (рис. 3.7.3). В нейронах выявляется практически полный тигролиз (признаки распада хроматофильной субстанции Ниссля) (рис. 3.7.4).
На микропрепаратах ткани мозга, окрашенных по Чиаччио, в те же сроки после моделирования ИИ, в очаге ишемии наблюдается гипохромия ядер клеток (рис. 3.8.1), что возможно отражает происходящие в некротизированных клетках процессы деполимеризации ДНК.
Кроме того, отражением процесса демиелинизации нервных волокон является повышение восприимчивости ткани по периферии очага ишемии к окраске суданом черным (рис. 3.8.2). В очаге ишемии становится видна значительная разреженность нейропиля, что указывает на выраженность перицеллюлярного отека (рис. 3.8).
На 3 сутки после моделирования ИИ, при окраске гематоксилин-эозином, на микропрепаратах ткани мозга четко контурируется зона инфаркта мозга (рис. 3.9.1). Обращает также внимание появление значительной воспалительной клеточной инфильтрации области инфаркта ткани мозга (рис. 3.9.2). В последующем этот инфильтрат служит основой при формировании глиомезодермального рубца. Значительно увеличивается количество погибших нейронов (множественные клетки-тени) (рис. 3.9.3). Из-за выраженного перицеллюлярного отека усиливается разреженность нейропиля.
Скопление множества мелких круглых клеток отмечается на границе между зоной инфаркта в ткани мозга и интактной тканью. Они предположительно лейкоцитарного и лимфоцитарного происхождения. По периферии очага ишемии отчетливо прокрашиваются капилляры, в них выявляются признаки стаза крови (рис 3.10.1), а также явления адгез нейтрофилов к эндотелию капилляров и их миграция в ткань мозга (рис. 10.2). На 3 сутки после моделирования ИИ, при окраске по Нисслю, на микропрепаратах ткани мозга животных группы 2, видны дистрофически измененные нейроны (рис. 3.11.1), отмечаются признаки нейронофагии (рис. 3.11.2) и выраженная воспалительная клеточная инфильтрация (рис. 3.11.3).
При окраске по Чиаччио на 3 сутки, после моделирования ИИ, на микропрепаратах ткани мозга крыс группы 2 отчетливо контурируется зона деструкции ткани мозга (рис. 3.12.1). Отсутствие в ней ядер, окрашенных в красный цвет, свидетельствует о деполимеризации ДНК. На периферии зоны деструкции видна область воспалительной клеточной инфильтрации (рис. 3.12.2).
Показатели системы про-/антиоксиданты у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом при проведении ТЭС-терапии
В терапии повреждения ГМ, обусловленного ишемией, широкое применение нашли антиоксиданты и цитонейропротекторы [А. А. Фирсов и соавт., 2012]. Однако только медикаментозных методов коррекции, в условиях нарушения сознания и питания при остром ИИ бывает недостаточно. Показано, что ТЭС-терапия инициирует опиоид-опосредованное прекондиционирование и может усиливать антирадикальную защиту [В. Г. Борисенко и соавт, 2008; Е. А. Губарева и соавт., 2008]. Это определило вероятность ее нейропротекторного влияния при использовании в острейший период экспериментального ИИ.
Для выявления возможных позитивных протекторных эффектов при ИИ были проведены исследования по моделирования экспериментального ИИ у крыс и одновременному использованию у них ТЭС-терапии (экспериментальные животные группа 3). При моделировании острого ИИ, как было показано выше у животных 2 группы, без использования ТЭС, существенные сдвиги в системе АОЗ крови возникали уже на 1 сутки. При этом у животных 3 группы в 1 сутки моделирования ИИ и применения ТЭС изменения в системе АОЗ были сопоставимыми с таковыми в 2 группе.
При изучении активности ферментов антирадикальной и антиоксидантной защиты эритроцитов, также выявлен дисбаланс в системе АОЗ. Активность СОД прогрессивно возрастала до 7 суток после моделирования ИИ (табл. 4.4., рис. 4.5). В 1 сутки прирост активности СОД составил 30,8%, что достоверно не отличалось от животных 2 группы, но было значимо выше показателей контрольной группы.
К 3 суткам активность фермента возросла на 46,2% по сравнению с исходными данными и на 11,8% по отношению к 1 суткам (прирост статистически незначим). На 7 седьмые сутки прирост активности СОД по отношению к исходной величине достиг 69,2% (рис. 4.5), а по сравнению с 3 сутками – только 15,8% (прирост статистически незначим).
Затем к 14 суткам происходило значительное снижение данного показателя по отношению к 7 суткам (на 57,1%), при этом активность СОД возвращалась к исходным значениям (рис. 4.5). При этом необходимо отметить, что у животных 2 группы, без использования ТЭС-терапии она оставалась на 22,1% выше контрольных показателей.
Частичная коррекция активности на фоне ТЭС-терапии является благоприятным фактором. Известно, что в результате действия СОД происходит репарация и/или редукция количественных повреждений клеток, возникших в результате воздействия неконтролируемых реакций СРО [Казимирко В. К. и соавт., 2004]. Поэтому в медицинской прктике нашли широкое распространени препараты СОД, в частности РЕКСОД.
В отличие от динамики СОД активность КАТ, фермента второй линии системы АОЗ, в период с 1 по 7 сутки снижалась (табл. 4.4). Динамика активности этого фермента до 7 суток соответствовала таковой у животных 2 группы. Однако прослеживалась тенденция к менее выраженному снижению активности КАТ у животных 3 группы (рис. 4.6). Так, на 1 сутки активность КАТ была снижена на 27,4%, на 3 сутки была снижена на 49,7% по отношению к исходным данным. На 7 сутки отмечался ее рост по отношению к 3 суткам на 41,1% и ее значения соответствовали значениям 1 суток.
К 14 суткам происходило дальнейшее увеличения активности КАТ на 26,0% относительно 7 суток и она, в отличие от животных 2 группы, возвращалась практически к нормальным значениям контроля, что свидетельствует о нормализации работы ферментного звена системы АОЗ на фоне курсового применения ТЭС-терапии. Положительная динамика изменения нарушенной активности ферментов 1 и 2 линии антиоксидантной защиты свидетельствует о включении стресс-лимитирующих систем при развитии ОС на фоне ТЭС-терапии, за счет ее центральных эффектов и доказывает гомеостатические эффекты влияния ТЭС-терапии на нарушенные показатели обмена веществ при острых стрессовых состояниях, что было показано в более ранних работах исследователей, как в эксперименте, так и в клинике.
АОА плазмы крови - это интегральный показатель, отражающий ее способность противодействовать развитию свободнорадикальных реакций и накоплнию продуктов СРО [В. Л. Кожура, К. В. Таланцев, И. С. Новодержкина и др., 2000]. Этот показатель показывает суммарные эффекты синергического действия всех компонентов системы АОЗ, и прежде всего, ее неферментного звена.
АОА плазмы крови у экспериментальных животных уже на 1 сутки моделирования ИИ возрастала на 45,6%, относительно показателя в группе интактных животных, что было характерно также и для животных 2 группы (табл. 4.5., рис.4.7).
