Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Морфо-функциональная характеристика нейтрофильных гранулоцитов 14
2.2. Характеристика белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов 20
2.2.1. Лактоферрин 21
2.2.2. Антимикробные пептиды. Структура. Классификация. Механизмы действия 26
2.2.2.1. Дефенсины нейтрофильных гранулоцитов крыс 33
2.3. Антимикробные белки и пептиды в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета 34
2.4. Физиология стресса 37
2.5. Стресс и иммунная система 40
2.5.1. Стресс и система крови 43
3. Методы исследования 46
3.1. Экспериментальные животные и модель исследования 46
3.2. Получение биологического материала 47 3.2.1. Получение экссудата 47
3.3. Выделение дефенсинов из нейтрофилов экссудата крыс 47
3.3.1. Экстракция катионных пептидов из лейкоцитарных клеток . 47
3.3.2. Ультрафильтрация 48
3.3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография 48
3.3.4. Удаление примеси липополисахарида 49
3.4. Электрофоретические методы 49
3.4.1 Электрофорез в кислой буферной системе 49
3.5. Иммунохимические методы исследования 50
3.5.1. Получение антисывороток к дефенсинам 50
3.5.1.1. Конъюгация дефенсинов крысы с овальбумином 50
3.5.1.2. Иммунизация кроликов конъюгатом дефенсинов с овальбумином 51
3.5.2. Выделение антител к дефенсинам крысы из антисывороток 52
3.5.2.1. Связывание дефенсинов крысы с цианоген бромид-активированной агарозной матрицей 52
3.5.2.2. Выделение из антисыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания 53
3.5.2.3. Выделение антител к дефенсинам крысы из фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом аффинной хромотографии 53
3.5.3. Конъюгация антител с пероксидазой хрена 54
3.5.4. Иммуноцитохимический метод анализа сыворотки на наличие специфических антител 54
3.5.5. Процедура иммуноферментного анализа по определению концентрации RatNP-3 в плазме крови экспериментальных крыс 55
3.5.6. Иммуноферментный анализ по определению концентрации кортикостерона 56
3.6. Цитологические методы исследования 58
3.6.1. Подсчет лейкоцитарной формулы крови 58
3.6.2. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева 58
3.7. Определение примеси ЛПС в пробах 59
3.8. Метод полимеразой цепной реакции 60
3.8.1. Выделение матричной РНК из спленоцитов крыс . 60
3.8.2. Получение кДНК из мРНК . 62
3.8.3. Проведение полимеразной цепной реакции . 62
3.9. Статистическая обработка результатов 64
4. Результаты и обсуждение . 65
4.1. Выделение дефенсинов крыс из нейтрофильных гранулоцитов . 65
4.1.1. Экстракция катионных белков и пептидов из лейкоцитов крысы и их фракционирование методом ультрафильтрации 65
4.1.2. Очистка и разделение дефенсинов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 67
4.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения концентрации RatNP-3 в биологических жидкостях крыс 70
4.3. Иммуномодулирующие свойства антимикробных белков и пептидов нейтрофильных гранулоцитов 75
4.3.1. Динамика изменений концентрации кортикостерона, распределения лейкоцитов в крови и дегрануляции нейтрофильных гранулоцитов у крыс при экспериментальном стрессе 75
4.3.2. Динамика изменений экспрессии генов цитокинов и TLR4 в селезенке крыс при экспериментальном стрессе 82
4.3.3. Влияние введения лактоферрина человека и дефенсина крысы RatNP-3 на лейкоцитарный состав крови, продукцию кортикостерона, экспрессию генов цитокинов и TLR4 крысы в отсутствии стрессирующего воздействия 88
4.3.4. Влияние введения лактоферрина человека на развитие стресс-реакции в условиях экспериментального стресса 94
4.3.5. Влияние введения лактоферрина и ЛПС на стресс-индуцированные изменения в экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов и TLR4 103
4.3.6. Влияние введения дефенсина крыс RatNP-3 на течение экспериментального стресса 110
4.3.7. Влияние введения антител к суммарной фракции дефенсинов крыс на течение экспериментального стресса 116
5. Заключение 119
6. Выводы 121
Список сокращений 123
Список литературы 124
- Антимикробные белки и пептиды в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета
- Иммунохимические методы исследования
- Экстракция катионных белков и пептидов из лейкоцитов крысы и их фракционирование методом ультрафильтрации
- Влияние введения лактоферрина и ЛПС на стресс-индуцированные изменения в экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов и TLR4
Введение к работе
Актуальность проблемы. Антимикробные белки (лактоферрин, пероксидазы, лизоцим, серпроцидины) и пептиды (дефенсины, кателицидины) животных являются ведущими молекулярными факторами врожденного иммунитета. За два последних десятилетия активного изучения этих белково-пептидных соединений были описаны их различные структурные и функциональные свойства, наиболее изученным из которых является их прямая антимикробная активность. В последнее время появляется все больше данных о том, что роль катионных антимикробных белков и пептидов в защитных реакциях организма не ограничивается только их антибиотическим действием. Особый интерес представляют иммуномодулирующие свойства этих соединений как эндогенных регуляторов иммунного ответа. Показано, что лактоферрин, связывая липид А, может оказывать влияние на иммунные реакции, в которые вовлечены липополисахариды, в частности, на высвобождение цитокинов клетками мононуклеарной фагоцитирующей системы (Brandenburg et al., 2001). Кроме того, лактоферрин может избирательно связываться с ДНК и влиять на экспрессию некоторых генов (He, Furmanski, 1995). Существуют публикации, указывающие на возможное участие белков нейтрофильных гранулоцитов - лактоферрина (Palma et al., 1992) и миелопероксидазы (Lefkowitz et al., 2000) в регуляции синтеза интерлейкина 1 – одного из ключевых модуляторов защитных функций организма (Корнева и др., 2000).
Одной из самых распространенных причин, вызывающих изменения иммунного ответа, являются стрессирующие воздействия, которые приводят к перераспределительным реакциям лейкоцитов крови, изменению гормонального уровня и продукции цитокинов (Корнева, Шхинек, 1988; Webster et al., 2002). Несмотря на то, что нейтрофилез является давно известным и одним из классических проявлений стресс-реакции, биологический смысл этого явления остается до конца не ясным. Поиски ведутся преимущественно в направлении изучения стресс-индуцированных изменений функциональной активности этих клеток (Khanfer et al., 2010; Ellard et al., 2001). В то же время можно предположить, что те антимикробные белки и пептиды, которые секретируются из нейтрофилов, обладают не только антибиотическим действием, но и в соответствии с принципами регуляции физиологических реакций могут оказывать влияние на развитие стресс-реакции и иммунного ответа. Показано, что введение лактоферрина изменяет поведенческие реакции у крыс в тесте «замирания», вызванного страхом (Kamemori et al., 2004) и нормализует иммунный ответ у животных, подвергнутых иммобилизационному стрессу (Zimecki et al., 2005). В свою очередь, стрессорные гормоны влияют на степень насыщения лактоферрина железом и его функциональные свойства (Sandrini et al., 2010). Установлено, что дефенсины могут влиять на антителообразование (Brogden et al., 2003) и на уровень кортикостероидов в условиях экспериментального стресса у животных (Шамова и др., 1993; Орлов, 1998). Совокупность рассмотренных данных свидетельствуют о многостороннем характере взаимодействий между антимикробными белками и пептидами, цитокиновой сетью и стрессорными гормонами, многие стороны биологической значимости которых остаются в значительной степени не изученными.
Настоящая работа посвящена изучению роли антимикробных белков и пептидов как эндогенных иммуномодуляторов в регуляции иммунных и нейроэндокринных реакций при экспериментальном стрессе.
Целью работы явилось изучение иммуномодулирующего действия антимикробного белка лактоферрина и пептидов дефенсинов в условиях стрессирующего воздействия на организм экспериментальных животных.
Задачи исследования:
-
Выделить в высокоочищенном виде дефенсины из лейкоцитов крысы, получить поликлональные антитела к ним и на их основе разработать иммуноферментную тест-систему для выявления дефенсина крысы RatNP-3 в биологических жидкостях.
-
Исследовать секрецию содержимого гранул нейтрофильных гранулоцитов крыс, оцениваемую по динамике изменений концентрации эндогенных дефенсинов в плазме крови крыс с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы, в условиях экспериментального стрессирующего воздействия.
-
Изучить динамику изменений экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов в клетках селезенки крыс в условиях иммуносупрессивного стрессирующего воздействия (плавание в холодной воде), введения дефенсина крысы RatNP-3, лактоферрина человека и ЛПС.
4. Исследовать динамику стресс-индуцированных изменений продукции кортикостерона и
перераспределения лейкоцитов крови при введении экспериментальным животным дефенсина
крысы RatNP-3 и лактоферрина человека.
5. Изучить стресс-индуцированную продукцию кортикостерона у крыс в условиях
выведения эндогенных дефенсинов из циркуляции с использованием специфических антител.
Научная новизна работы
1. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления дефенсинов крысы в
биологических жидкостях. Установлено, что средняя концентрация дефенсина RatNP-3 в плазме
крови у интактных животных составляет 36±6,18 нг/мл (среднее±ошибка среднего), а
относительное содержание – 9,82±3,02 нг/1 млн нейтрофилов.
2. Впервые показано, что в условиях экспериментального стресса (плавание в холодной
воде при температуре +2-4С) имеет место повышение экспрессии генов противовоспалительного
цитокина IL-4 и паттерн-распознающего рецептора TLR4 в клетках селезенки экспериментальных
животных.
3. Впервые продемонстрировано, что введение дефенсина RatNP-3 и лактоферрина
человека экспериментальным животным модулирует перераспределение лейкоцитов крови,
уровень экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов в клетках селезенки крыс и снижает
уровень кортикостерона при экспериментальном стрессе.
4. Впервые показано, что выведение эндогенных дефенсинов крысы из циркуляции с использованием специфических антител влияет на продукцию кортикостерона при экспериментальном стрессе.
Теоретическая и практическая значимость результатов работы
Исследование направлено на изучение роли молекулярных компонентов системы
врожденного иммунитета – антимикробных белков и пептидов, в реализации и регуляции
нейроэндокриноиммунных взаимодействий в условиях стрессирующего воздействия на организм.
Получены приоритетные данные о взаимодействии компонентов цитокиновой сети –
провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, стрессорных гормонов, антимикробных
пептидов дефенсинов и антимикробного белка лактоферрина в процессе регуляции защитных
функций организма при экспериментальном стрессирующем воздействии. В частности, получены
доказательства участия эндогенных дефенсинов в регуляции уровня глюкокортикоидов в крови.
Показано, что в условиях экспериментального стресса в клетках селезенки возрастает экспрессия
гена паттерн-распознающего рецептора TLR4, что говорит об активации рецепторных механизмов
врожденного иммунитета в условиях, не связанных напрямую с взаимодействием организма с
патогенами. Продемонстрировано, что введение дефенсинов и лактоферрина нормализует стресс-
индуцированые изменения количества нейтрофильных гранулоцитов в крови и экспрессии генов
цитокина IL-4 и TLR4 в клетках селезенки. Результаты работы способствуют расширению
представлений о механизмах реализации и регуляции нейроэндокриноиммунных взаимодействий
у животных в условиях стрессирующего воздействия. Полученные данные об
иммуномодулирующем действии антимикробных белков и пептидов могут иметь важное практическое значение для разработки на их основе новых лекарственных препаратов, сочетающих в себе свойства антибиотиков и иммуномодуляторов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления дефенсина крысы RatNP-3 в
биологических жидкостях. Установлено что средняя концентрация дефенсина RatNP-3 в плазме
крови у интактных животных составляет 36±6,18 нг/мл (среднее±ошибка среднего), а
относительное содержание – 9,82±3,02 нг/1 млн нейтрофилов. Эмоционально-физическое
стрессирующее воздействие (плавание в холодной воде) вызывает повышенную секрецию
дефенсинов, оцениваемую по концентрации дефенсина RatNP-3, отнесенной к абсолютному
количеству нейтрофилов.
2. Введение лактоферрина человека и дефенсина RatNP-3 снижает индуцированное
стрессом повышение концентрации кортикостерона в крови крыс через 30 минут после
аппликации стресса.
3. Лактоферрин человека и дефенсин RatNP-3 нормализуют стресс-индуцированный сдвиг
лейкоцитарной формулы крови.
-
Дефенсин RatNP-3 и лактоферрин человека снижают стресс-индуцированное повышение экспрессии гена противовоспалительного цитокина IL-4, а также гена паттерн-распознающего рецептора TLR4 в спленоцитах крыс на сроке 3 часа после аппликации стресса.
-
Введение ЛПС не влияет на модулирующее действие лактоферрина в отношении стресс-индуцированной экспрессии генов IL-4 и TLR4 в селезенке крыс и это иммуномодулирующее действие не связано с кортикостатической активностью лактоферрина.
6. Введение антител к дефенсинам крысы влияет на стресс-индуцированный уровень
корикостерона в крови, поддерживая высокий уровень гормона через 3 часа после
стрессирующего воздействия.
Личное участие автора. Соискателем лично проводились все лабораторные исследования, статистическая обработка, анализ и обощение данных, подготовка материала к публикациям.
Степень достоверности и апробация результатов.
Научные положения, выносимые на защиту, подтверждены экспериментальными данными, полученными с применением современных патофизиологических, биохимических и молекулярно-биологических методов. Достоверность результатов обеспечена разнообразием применяемых методов, корректной обработкой данных на основе методов статистического анализа. Материалы диссертации изложены в 9-и публикациях, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК, в том числе представлены на международных и Всероссийских конференциях: III Международный Симпозиум “Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии”, 7 – 10 июня, 2011 г.; IV Международный Симпозиум “Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии”, 18 – 21 июня, 2013 г., Санкт-Петербург, Россия; Объединенный иммунологический форум – 2013, 30 июня – 5 июля 2013 года, Нижний Новгород, Россия; 38-ой Конгресс Федерации Европейских биохимических обществ, Санкт-Петербург, Россия, 6 – 11 июля, 2013 г.; XI Международная конференция по лактоферрину: структура, функции и применение, 6 – 10 октября, 2013 г., Рим, Италия.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах и включает 50 рисунков, 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Библиографический указатель содержит 247 источников, в том числе 28 работ на русском и 219 – на иностранных языках.
Антимикробные белки и пептиды в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета
К настоящему времени накоплено множество данных, свидетельствующих о важной роли антимикробных белков и пептидов в биологических реакциях, имеющих отношение к воспалению, врожденному и адаптивному иммунитету [40; 96; 121; 204; 229].
Лактоферрин может поддерживать пролиферацию, дифференцировку и активацию клеток иммунной системы и модулировать некоторые иммунные реакции. С другой стороны, лактоферрин действует как противовоспалительный фактор. Благодаря его антимикробной активности и способности связывать компоненты бактериальных клеток (ЛПС) или их рецепторов (CD14), лактоферрин может предотвращать развитие воспаления и связанное с ним повреждение тканей, подавлять высвобождение провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода [143]. Противовоспалительный эффект лактоферрина проявляется также в способности снижать продукцию некоторых провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли и интерлейкинов IL-1 и IL-6 [138; 153]. В некоторых исследованиях продемонстрирована способность ЛФ повышать продукцию противовоспалительного интерлейкина IL-10 клетками [124], что можно рассматривать в качестве одной из составляющих противовоспалительного действия лактоферринов.
Ионы железа необходимы в качестве катализаторов генерации активных форм кислорода. Поэтому лактоферрин, связывая Fe3+, может уменьшить продукцию активных форм кислорода лейкоцитами в очагах воспаления [234]. Существуют противоречивые мнения относительно влияния лактоферрина на пролиферацию лимфоцитов. Так Эседжи с соавторами [29] сообщают о его стимулирующем действии на этот процесс, тогда как Эшорн [43] и Ричи [113] установили противоположный эффект. На клеточном уровне ЛФ увеличивает число натуральных киллеров (NK) [144], повышает мобилизацию нейтрофилов в кровь [187], индуцирует фагоцитоз [220] и может модулировать миелопоэз [63].
Поскольку молекула ЛФ положительно заряжена, она способна связываться с отрицательно заряженными соединениями на поверхности различных клеток иммунной системы [47]. Можно предположить, что такое взаимодействие может инициировать сигнальные пути, приводящие к различного рода клеточным реакциям, таким как активация, дифференцировка и пролиферация. Также было показано, что ЛФ транспортируется в ядро, где он может связываться с ДНК и активировать экспрессию отдельных групп генов [50; 219]. АМП влияют на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки) и эпителиальные клетки, определяя отдельные стороны взаимодействия врожденной и адаптивной иммунной систем. Для млекопитающих была показана роль АМП в реализации таких клеточных функций, как хемотаксис, апоптоз, транскрипция генов и продукция цитокинов [200]. Кроме того, существуют данные, свидетельствующие о том, что пептиды подавляют индуцированную бактериями продукцию цитокинов, стимулируют заживление ран и ангиогенез [1; 28]. Некоторые кателицидины и дефенсины являются хемокинами для клеток иммунной системы, индуцируют синтез и секрецию цитокинов, а также высвобождение гистамина из тучных клеток [92; 173]. В совокупности это способствует мобилизации клеток врожденного и адаптивного иммунитета. -Дефенсины, а также -дефенсины человека хемотаксичны для моноцитов, Т-клеток и незрелых дендритных клеток [166; 117; 114]. Индуцированная дефенсинами дегрануляция тучных клеток и повышение продукции ИЛ-8 при воспалительных процессах способствуют привлечению и накоплению нейтрофилов. Дефенсины человека усиливают активность фагоцитоза макрофагами [108]. В условиях in vivo дефенсины могут участвовать в регуляции активности системы комплемента [125]. Продемонстрировано, что дефенсины в условиях in vitro способны увеличивать клеточную пролиферацию и цитокиновый ответ CD4+ T клеток через индукцию IFN-, IL-10 и IL-6, а также посредством модуляции экспрессии костимулирующих молекул [160]. Кателицидины коровы, свиньи, человека и мыши являются хемоаттрактантами практически для всех лейкоцитов периферической крови [62]. Кроме того, кателицидин человека LL-37 может влиять на дифференцировку незрелых дендритных клеток и Т-клеточную поляризацию в пользу Th1 ответов [221], в то время как дефенсины человека оказывают влияние в противоположном направлении [79], что указывает на способность АМП быть связующим звеном врожденного и адаптивного иммунитета.
В исследованиях in vivo с использованием совместного введения дефенсина человека с антигенами у мышей наблюдалась повышенная продукция специфических сывороточных антител. Этот факт свидетельствует о том, что АМП участвуют и в гуморальном (Th2-зависимом) ответе, и дает основания предполагать, что АМП могут обладать адъювант-подобными свойствами [79]. Аналогично -дефенсины человека и -дефенсины мыши могут способствовать индукции антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, тем самым поддерживая Th1-зависимый клеточный ответ и потенциально противоопухолевый иммунитет [160]. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что катионные пептиды являются молекулами, которые играют важную роль во взаимодействии врожденного и адаптивного иммунитета, функционируя в качестве сигнальных молекул (аларминов), влияющих на инициацию, поляризацию и развитие адаптивного иммунного ответа. Задача понимания механизмов иммуномодулирующих функций катионных пептидов становится все более актуальной [199]. Как уже упоминалось ранее, в опытах in vitro и in vivo было показано, что некоторые -дефенсины обладают ингибирующим действием на АКТГ индуцированный стероидогенез клетками коркового слоя надпочечников, в связи с чем они получили также название «кортикостатины». Впервые кортикостатическая активность дефенсинов была установлена для дефенсинов кролика с использованием биологического теста in vitro, основанного на измерении секретированного культурой клеток надпочечников крыс кортикостерона. [128]. Позже кортикостатическая активность была выявлена у дефенсинов человека, крысы и морской свинки [209]. В работах сотрудников Отдела общей патологии и патофизиологии ФГБУ НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН было показано, что введение дефенсинов животным (мыши, крысы), подвергнутым экспериментальному стрессу, снижает уровень кортикостерона в крови и отменяет стресс-индуцированную иммуносупрессию [2; 22]. Полученные данные открывают перспективы в изучении роли нейтрофилов и их антимикробных соединений в регуляции защитных функций при различных неблагоприятных воздействиях, включая стрессирующие воздействия.
Иммунохимические методы исследования
1 мг дефенсина (или смеси дефенсинов) разводили в 500 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера с pH 7,0. К полученному раствору добавили 5 мг яичного овальбумина, предварительно разведенного в 500 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера с pH 7,0. К полученной смеси добавляли 1 мл свежеприготовленного 0,02% раствора глутаральдегида в 0,1 М натрий-фосфатном буфере с pH 7,0. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 500 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера с pH 7,0 и удаляли глутаральдегид на колонке PD-10 согласно инструкции, приложенной к колонкам.
В полученных пробах замеряли оптическую плотность на электроспектрофотометре Beckman Coulter DU 720 при длине волны =280 нм, и определяли содержание коньюгата в пробах с учетом коэффициента экстинкции овальбумина E1%280 = 7,16 Иммунизация кроликов коньюгатом овальбумина с дефенсинами проводилась по следующей схеме (из расчета на одно животное): - 1-ая иммунизация в подушечки задних лап: 200 мкл конъюгата с концентрацией 1,2-1,5 мг/мл смешивали и суспендировали с 250 мкл полного адъюванта Фрейнда - 2-ая иммунизация на 29-31 день после 1-ой иммунизации, подкожно вдоль линии позвоночника: 200 мкл конъюгата с концентрацией 1,2-1,5 мг/мл смешивали и суспендировали с 250 мкл неполного адъюванта Фрейнда - 3-я иммунизация на 29-31 день после 2-ой иммунизации, подкожно вдоль линии позвоночника: 200 мкл конъюгата с концентрацией 1,2-1,5 мг/мл смешивали и суспендировали с 250 мкл неполного адъюванта Фрейнда
Через 10 дней после 3-ей иммунизации, производился забор крови из ушной вены в стеклянные пробирки, общим объемом 20-30 мл. Кровь ставили в термостат на 60 минут при 37С для образования сгустка, затем обводили сгусток стеклянной палочкой и ставили на ночь на 4С. Сгусток отделяли, а сыворотку консервировали мертиолатом натрия до концентрации 0,01 %, и хранили при 4С.
При необходимости иммунизацию с последующим забором крови повторяли, но не ранее 14 дней с последней иммунизации. 3.5.2. Выделение антител к дефенсинам крысы из антисывороток
Для создания аффинной колонки было взято 700 мкг суммарной фракции крысиных дефенсинов и 0,5 г цианоген бромид-активированной агарозной матрицы фирмы Sigma. Связывание антигена с матрицей проводили согласно протоколу, приложенному к матрице:
- 0,5 г активированной агарозы смешивали с 30 мл охлажденной 1 мМ HCl
- Поместили полученную смесь в пластиковую пробирку–колонку, промыли смесь 200 мл охлажденной 1 мМ HCl.
- Далее колонку промывали 30 мл дистиллированной воды, затем 3 мл 0,2 М буфера бура-борная кислота с pH 8.0, содержащего 1 М NaCl.
- К 2 мл смеси дефенсинов (1,2 мг) добавили 2 мл 0,2 М буфера бура-борная кислота с pH 8.0 и содержащего 1 М NaCl (замерили оптическую плотность при 280 нм).
- Нанесли смесь дефенсинов на колонку.
- Колонку инкубировали на качалке 3 часа при комнатной температуре.
- Удалили жидкость из колонки, померили в ней оптическую плотность при 280 нм, и по разнице с предыдущим измерением определили количество не связавшихся дефенсинов.
- Полученную колонку со связанными дефенсинами уравновесили раствором 0,2 М глицина и оставили на ночь при 4 С.
- Промыли колонку 4 раза поочередно 0,2 М буфером бура-борная кислота с pH 8.0 и 0,1 М натрий-ацетатным буфером, содержащим 1 М NaCl.
- Уравновесили колонку 1 М NaCl и хранили при 4С до использования. 3.5.2.2. Выделение из антисыворотки фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом высаливания
К 10 мл иммунной сыворотки добавляли 5 мл насыщенного (4 М) раствора (NH4)2SO4. Полученный осадок отделяли центрифугированием на центрифуге К-24 3000 об/мин (600 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали. Осадок растворяли в 5 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляли 4 мл 4 М раствора (NH4)2SO4. Осадок вновь отделяли центрифугированием. Процедуру высаливания повторяли еще 2 раза. Полученный осадок, содержащий иммуноглобулины, растворяли в воде и ставили на ночь на диализ при +4С. Для диализа использовали мембрану фирмы Sigma, с порами пропускающими молекулы до 12 кДа. Диализ проводили против 0,01 М натрий-фосфатного буфера, с pH 7,2 , содержащего 0,15 М NaCl.
Выделение антител к дефенсинам крысы из фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами, методом аффинной хроматографии
- Аффинную колонку со связанными дефенсинами промывали 0,01 М натрий-фосфатным буфером с pH 7,2, содержащим 0,15 М NaCl (исходный буфер), в объеме 3 мл.
- На колонку наносили 5 мл полученной после диализа фракции белков, обогащенной иммуноглобулинами.
- Промывали колонку 3 мл исходного буфера. Затем промывали натрий-фосфатным буфером с pH 7,2, содержащим 0,3 М NaCl.
- Связавшиеся иммуноглобулины элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером с pH 3,0, содержащим 0,1 М NaCl.
- Элюат ставили на диализ против исходного буфера на ночь при температуре 4С. В качестве консерванта к полученному раствору антител добавляли мертиолат натрия до 0,01%. Колонку уравновешивали 1 М раствором NaCl и хранили при 4С.
Конъюгаты получали периодатным методом [14]. 0,8 мг пероксидазы хрена растворили в 100 мкл воды. К полученному раствору добавили 200 мкл свежеприготовленного 0,1 М раствора периодата натрия (NaIO4). Далее смесь перемешивали в течение 20 мин в стеклянном флаконе. В полученной смеси произвели замену раствора на 1 мМ натрий-ацетатный буфер с pH 4,4, путем фильтрации на фильтрующих колонках Millipore Centrifugal Filtr Units 100 000 MWGO. Довели pH смеси до 9-9,5 , добавлением 2 мкл 0,2 М Na2Co3, и сразу добавили 100 мкл раствора иммуноглобулинов в концентрации 10 мг/мл в 0,05 М карбонат-бикарбонатный буфере pH 9,5. Смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Затем к смеси добавили 10 мкл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия (NaBH4), в концентрации 4 мг/мл. Перемешивали 2 часа при температуре 4С. Полученный конъюгат перевели в 0,1 М боратный буфер с pH 7,4. К 50 мкл конъюгата добавили 20 мкл глицерина и хранили при температуре -20С.
Иммуноцитохимический метод анализа сыворотки на наличие специфических антител
1) Мазки крови интактных крыс высушивали в течение 15-30 минут. Фиксировали охлажденным ацетоном 5 минут. Затем мазки промывали в трех сменах забуференного физраствора. Процедуру промывки производили после каждой инкубации.
2) Проводили блокировку эндогенной пероксидазы, в растворе метанол-перекись в течение 20 мин. Раствор готовили смешиванием 29 мл метанола и 1 мл 30% перекиси водорода.
\3) Наносили на мазки иммунные и неиммунные (в качестве контроля) сыворотки в разведении 1:4 (растворитель физиологический раствор.) и инкубировали их 40 мин во влажных камерах при 37 С.
4) Инкубировали мазки с конъюгатом антител к иммуноглобулинам кролика с пероксидазой хрена (разведение 1:2000), при 37С 40 мин.
5) Затем нанесли на мазки раствор диаминобензидина (ДАБ) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Мазки еще раз тщательно промыли.
Раствор ДАБ готовили следующим образом: к 6 мг диаминобензидина добавили 10 мл 0,05 М трисового буфера с pH 7,6 и 100 мкл 1% перекиси.
Результат наблюдали визуально микроскопированием, сравнивая иммунные и неимунные сыворотки. Отдельно контролировали этап блокирования эндогенной пероксидазы.
Процедура иммуноферментного анализа по определению концентрации RatNP-3 в плазме крови экспериментальных крыс
Антитела к RatNP-3 разводили до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,0. Вносили полученный раствор в количестве 100 мкл в каждую лунку планшета, предназначенную для дальнейшего анализа. Инкубировали в течение ночи при 4 С.
После инкубации провели четырехкратную промывку лунок планшета 0,01 М натрий-фосфатным буфером c pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,05% ТВИН-20 (промывочный раствор) согласно следующей схеме. В каждую лунку нанесли промывочный раствор в объеме 150 мкл, выдерживали 20 сек. Затем резко опорожняли планшет переворачиванием, и дополнительно осушали лунки опрокидыванием планшета на фильтровальную бумагу. Затем следовал следующий промывочный цикл. Плазму крови экспериментальных крыс разводили в 100 раз 0,01 М натрий-фосфатном буфером pH 7.4 содержащим 0,15 М NaCl, 0.05% ТВИН 56 20 и 1% БСА (раствор для проб). В этом же растворе развели контроли -RatNP-3 в концентрациях 0, 0,2 , 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 2 и 4 нг/мл. Перед нанесением проб, проводили предварительную инкубацию планшета с буфером для разведения (100 мкл в лунке) в течение часа при комнатной температуре. Затем планшет полностью опорожняли и наносили пробы и стандарты по 100 мкл в каждую лунку планшета, согласно заранее заготовленной для эксперимента схеме. Инкубировали в течение ночи при 4С. Затем лунки промывали по схеме описанной ранее.
Экстракция катионных белков и пептидов из лейкоцитов крысы и их фракционирование методом ультрафильтрации
Экстракцию дефенсинов проводили 10% уксусной кислотой (см. раздел 3.3.1) из нейтрофильных гранулоцитов перитонеального экссудата. Выбор экстрагента был обусловлен положительным зарядом выделяемых молекул, которые хорошо растворимы в кислых растворах. В результате проведенной экстракции были получены «экстракт 1», «экстракт 2» и «экстракт 3».
Спектр белковых молекул в полученных фракциях (рис. 4.1.1.1) анализировали методом электрофореза в кислой среде (см. раздел 3.4.1). Так как электрофоретическая подвижность является постоянной характеристикой белковой молекулы в условиях электрофореза определенного вида, то и положение соответствующих ей электрофоретических полос на электрофореграммах неизменно. Расположение электрофоретических полос искомых пептидов известно и определяется относительно контроля -полученных ранее в лаборатории общей патологии и патофизиологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН дефенсинов крысы по методу Eisenhauer с соавторами [189].
Основная часть дефенсинов извлекалась из клеток во время 1-ой экстракции (дорожка 2). «Экстракт 2» и «экстракт 3» также содержат дефенсины, однако, в гораздо меньшем количестве. Помимо дефенсинов на электрофореграммах экстрактов присутствуют также другие белки и пептиды, от большей части которых удалось избавиться путем ультрафильтрации (см. раздел 3.3.2) через фильтр с номинальной отсекаемой массой 10 кДа YM-10 (рис 4.1.1.2)., так как молекулярные массы выделяемых пептидов меньше данного значения. Рис. 4.1.1.2. Электрофореграмма экстрактов после ультрафильтрации на YM-10.
Далее ультрафильтраты экстрактов концентрировали на фильтре с номинальной отсекаемой массой 1 кДа YM-1 для отделения низкомолекулярных соединений. Ввиду гетерогенности фракций, полученных после ультрафильтрации, для получения индивидуальных фракций катионных пептидов требовалось дальнейшее разделение. Дальнейшее разделение и очистку катионных пептидов крысы осуществляли в соответствии с методикой, описанной в разделе 3.3.3. Ультрафильтраты экстрактов были подвергнуты очистке с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) в градиенте концентраций ацетонитрила 0-60 % за 60 минут, в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФУ). Разделение осуществляли на колонке Altech C-18. Скорость элюции составляла 1 мл/мин. Объем собираемых фракций составлял 1 мл. Детекцию осуществляли при длине волны 225 нм. Порядок проведения всех разделений, а также учет и анализ их результатов проводили по одной и той же схеме.
На хроматограмме (рис. 4.1.2.1) представлен результат разделения пробы сконцентрированного ультрафильтрата «экстракта 1».
Аликвоты фракций, элюирующиеся с 20 по 35 минуту, высушивали под вакуумом в центрифуге Speed Vac CS-18, растворяли в 0,01 % растворе уксусной кислоты и использовали для последующей оценки гетерогенности.
Гетерогенность полученных фракций оценивали с помощью электрофореза в кислой среде (рис. 4.1.2.2). Рис. 4.1.2.2. Электрофореграмма фракций 27-29 c ВЭЖХ, содержащих дефенсины
Электрофоретический анализ показал наличие чистой фракции RatNP-3 в пробе 27, очищенных, но неразделенных RatNP-1 и RatNP-2 в пробе 28, а также очищенного RatNP-4 в пробе 29.
В итоге, после проведения 16 процедур обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии нами было получено следующее количество очищенных пептидов:
При рехроматографии фракции, содержащей RatNP-1+RatNP-2 в условия более пологого градиента концентрации ацетонитрила - 20-40% за 40 минут в 0,1% ТФУ, удалось получить по 100 мкг очищенных RatNP-1 и RatNP-2.
Только RatNP-3 был получен в количестве достаточном для исследования иммуномодулирующего действия дефенсинов.
AРазработка иммуноферментной тест-системы для определения концентрации RatNP-3 в биологических жидкостях крыс
Для создания иммуноферментной тест-системы был получен конъюгат RatNP-3 с овальбумином (см. раздел 3.5.1.1), которым были иммунизированы кролики и получены антисыворотки к дефенсину RatNP-3 (см. раздел 3.5.1).
Полученную в результате иммунизации сыворотку проверяли на наличие специфических антител иммуноцитохимическим методом (см. раздел 3.5.4). Результат оценивали визуально по степени окрашенности гранул нейтрофилов на мазках крови интактных крыс (Рис. 4.2.1). При использовании неиммунных кроличьих сывороток окрашивание не наблюдалось.
Иммуноцитохимический анализ антисыворотки к дефенсину RatNP-3. А – увеличение объектива х10, Б – увеличение объектива х100. Для выделения из антисывороток специфических антител была получена аффинная колонка на основе цианоген бромид-активированной агарозной матрицы с пришитыми дефенсинами крысы RatNP-1 - RatNP-4 (см. раздел 3.5.2.1), с помощью которой из антисыворотки были выделены специфические поликлональные антитела к RatNP-3 (см. разделы 3.5.2.2 и 3.5.2.3). Антитела использовали в качестве первичных антител в иммуноферментной тест-системе, а также для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена (см. раздел 3.5.3).
Использовали следующую процедуру для количественной оценки содержания дефенсина RatNP-3 в плазме крови крыс:
Антитела к RatNP-3 разводили до концентрации 10 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере с pH 9,0. Вносили полученный раствор в количестве 100 мкл в каждую лунку планшета, предназначенную для дальнейшего анализа. Инкубировали тест-систему в течение ночи при 4 С.
После инкубации проводили четырехкратную промывку лунок планшета 0,01% натрий-фосфатным буфером c pH 7,4 содержащем 0,15 М NaCl, 0,05% ТВИН-20 (промывочный раствор).
Влияние введения лактоферрина и ЛПС на стресс-индуцированные изменения в экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов и TLR4
Для оценки иммуномодулирующих свойств лактоферрина (так же как и других иммуномодуляторов) нередко используются модели с ЛПС-индуцированным изменением продукции цитокинов. В частности, на таких моделях показано, что ЛФ может ингибировать ЛПС-индуцированное повышение секреции IL-6, TNF-, IL-1 и IL-8 клеточной линией моноцитов человека THP-1 [138; 140].
Влияние стрессирующего воздействия на эту сторону иммуномодулирующего действия ЛФ ранее не изучалось.
Мы исследовали влияние ЛФ на экспрессию генов про- и противовоспалительных цитокинов, а также паттерн-распознающего рецептора TLR4 в условиях стрессирующего воздействия и введения ЛПС.
Показано, что введение ЛПС без стресса достоверно повышает экспрессию генов IL-4 и IL-6 в спленоцитах крыс на сроке 3 часа после введения, а также понижает экспрессию гена TLR4 на сроке 3 часа после введения по сравнению с интактными животными (Рис. 4.3.5.1). Достоверных изменений в экспрессии изучаемых генов под действием ЛПС через 30 минут не выявлено.
В условиях стрессирующего воздействия и введения ЛПС имеет место повышение экспрессии всех исследуемых генов через 3 часа после аппликации стимуляторов (Рис. 4.3.5.2).
Введение лактоферрина не оказывает влияния на экспрессию генов IL-4, IL-6 и TLR4 на сроке 30 минут после введения ЛПС и аппликации стресса (Рис. 4.3.5.3).
В тоже время введение ЛФ снижает экспрессию генов IL-4 и TLR4 через 3 часа после комплексного воздействия, но не изменяет экспрессию гена IL-6 (Рис.4.3.5.4.).
Следует отметить, что введение ЛФ не вызывало снижения повышенного уровня кортикостерона в крови, вызванного комбинированным воздействием стресса и введения ЛПС (Рис. 4.3.5.5.; Рис. 4.3.5.6.).Следует отметить, что введение ЛФ не вызывало снижения повышенного уровня кортикостерона в крови, вызванного комбинированным воздействием стресса и введения ЛПС (Рис. 4.3.5.5.; Рис. 4.3.5.6.).
Таким образом, в рамках данного эксперимента, показано, что введение ЛФ на фоне инъекции ЛПС при эмоционально-физическом стрессе не влияет на индуцированное ЛПС изменение в экспрессии гена цитокина IL-6 в спленоцитах крысы, и, в свою очередь, ЛПС не влияет на модулирующее действие ЛФ в отношении стресс-индуцированной экспрессии генов IL-4 и TLR4.
Механизмы такого кортикостатического и иммуномодулирующего действия пока не ясны. Это могут быть центральные механизмы, реализуемые благодаря способности лактоферрина аккумулироваться в структурах мозга, таких как гиппокамп [145], так и периферические, обусловленные взаимодействием с различными сайтами связывания на иммунных клетках [147]. Также мы не можем исключить и прямого взаимодействия ЛФ с рецепторами АКТГ на клетках надпочечников. В то же время можно увидеть, что модулирующее действие ЛФ на экспрессию генов IL-4 и TLR4 в селезенке не связано с его кортикостатической активностью.
Влияние введения дефенсина крыс RatNP-3 на течение экспериментального стресса Ранее канадскими исследователями было показано, что некоторые изоформы дефенсинов, названные кортикостатинами, в условиях культуры клеток обладают тормозящим действием на АКТГ-индуцированный стероидогенез клетками коркового слоя надпочечников. Однако, исследуемый нами дефенсин крысы RatNP-3, хотя и называется кортикостатином 3, в этих опытах in vitro не проявлял заметной кортикостатической активности [209].
Мы исследовали кортикостатическое действие RatNP-3 в условиях in vivo и показали, что введение дефенсина RatNP-3 достоверно снижало индуцированное стрессом повышение кортикостерона в крови крыс через 30 минут после аппликации стресса (Рис. 4.3.6.1).
Полученные результаты позволяют предположить опосредованный механизм действия RatNP-3 на стероидогенез при стрессе (либо совместное с каким-либо эндогенным фактором).
1. Концентрация кортикостерона в сыворотке крови крыс через 30 минут и 3 часа после введения RatNP-3 и аппликации стрессирующего воздействия. P 0,0005 по post-hoc t-критерию по методу Бонферрони
На данный момент не существует опубликованных работ, посвященных влиянию дефенсинов на клеточный состав крови. Нами впервые была установлена способность дефенсина крысы влиять на перераспределение лейкоцитов в крови при экспериментальном стрессе. Установлено, что введение дефенсина RatNP-3 нормализует процентное содержание нейтрофилов в крови экспериментальных крыс на сроках 30 минут и 3 часа после аппликации стресса (Рис. 4.3.6.2.) и снижает индуцированное стрессом повышение общего числа нейтрофилов через 3 часа после стресса (Рис. 4.3.6.3). Полученный результат говорит о включении возможного механизма обратной связи, в основе которого лежит повышение продукта секреции нейтрофилов в крови, снижающее в свою очередь содержание самих циркулирующих нейтрофилов.
