Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Активные формы кислорода и их влияние на структуру и функцию белка 10
1.2. Влияние аминокислотного состава на чувствительность белка к окислению 12
1.3. Свободнорадикальное окисление и нативная структура белка 15
1.4. Окисление белков, катализируемое металлами 18
1.5. Ускоренная деградация молекул белка как следствие окислительной денатурации 21
1.6. Взаимодействие белков с продуктами перекисного окисления липидов 22
1.7. Неэнзиматическое гликозилирование белков 24
1.8. Оценка степени окисления белков в интактных клетках и модельных системах 28
1.9. Роль окислительной модификации в регуляции оборота белков . 32
1.10. Окислительная модификация белков как показатель степени оксидативного стресса 33
1.11. Влияние АФК на функциональную активность белков плазмы
крови 42
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Характеристика обследованных больных 45
2.2. Характеристика методов исследования 47
2.2.1. Исследование окислительной модификации белка в модельных системах. 49
2.2.2. Методы анализа активных форм кислорода и продуктов окислительной деградации макромолекул 51
2.2.3. Методы исследования антиоксидантной системы 54
2.2.4. Статистические методы 56
2.2.5. Характеристика используемых реактивов и оборудования... 56
Глава 3. Данные модельных опытов и методические аспекты определения карбонильных групп белков сыворотки крови 57
3.1. Изучение окислительной модификации белков в модельных опытах 57
3.1.1. Дифференциальные спектры динитрофенилгидразонов белков при их окислении в химических системах, генерирующих активные формы кислорода 57
3.1.2. Тушение триптофановой флуоресценции и образование битирозина 66
3.2. Методические аспекты определения карбонильных групп белков сыворотки крови 70
3.2.1. Выявление аналитической надежности метода определения карбонильных групп белков сыворотки крови. 70
3.2.2. Определение карбонильных групп во фракциях белков сыворотки крови 74
Глава 4. Карбонильные группы белков сыворотки крови в оценке «окислительного стресса» у пациентов с рассеяным склерозом 78
Глава 5. Карбонильные группы белков в оценке «окислительного стресса» при макулодистофии 92
Глава 6. Карбонильные группы белков сыворотки крови и оценка «окислительного стресса» у пациентов с сердечно-сосудистой патологией 101
Заключение 116
Выводы 124
Практические рекомендации 126
Список литературы 127
- Оценка степени окисления белков в интактных клетках и модельных системах
- Методы анализа активных форм кислорода и продуктов окислительной деградации макромолекул
- Дифференциальные спектры динитрофенилгидразонов белков при их окислении в химических системах, генерирующих активные формы кислорода
- Карбонильные группы белков в оценке «окислительного стресса» при макулодистофии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Процессы кислородного метаболизма в организме связаны с образованием активных форм кислорода (АФК), обладающих высокой реакционной способностью. Активность АФК связана с участием в метаболизме белков, липидов, нуклеиновых кислот, гликозамингликанов и заключается в способности вызывать окислительную модификацию биомолекул.
Для защиты клеточных компонентов от окисления в процессе эволюции живыми организмами была создана эффективная система антиоксидантной защиты (АОЗ). Она включает в себя ферменты, способные превращать АФК в неактивные метаболиты, металлсвязывающие белки, антиоксиданты, синтезируемые в организме и поступающие в организм с пищей.
Таким образом, степень выраженности окисления зависит от интенсивности генерации свободных радикалов и состояния системы антиоксидантной защиты. Нарушение активности этих систем приводит к интенсификации процессов перекисного окисления липидов, деструкции белков, нуклеиновых кислот и гликозамингликанов.
В настоящее время не вызывает сомнения важная роль АФК в развитии различного рода патологических процессов. Патогенетическая роль АФК выявлена почти для ста заболеваний человека. Их действие наиболее выражено при сердечно-сосудистой патологии, ишемических повреждениях нервной ткани, в развитии атеросклероза, при катаракте и других офтальмологических заболеваниях. Большинству патологических процессов, течение которых усугубляется участием АФК, свойственно так называемое состояние «окислительного стресса», характеризующееся усилением продукции этих субстанций.
В последние годы особенно большое внимание уделяется изучению роли АФК в метаболизме белков. Вызвано это, во-первых, тем, что белки оказались наиболее чувствительными к свободнорадикальному окислению по сравнению с другими биомолекулами, и, как полагают, их окисление является наиболее ранним показателем усиления продукции АФК. Во-вторых, интерес к окислительной модификации белков обусловлен той важной ролью, которую белки играют в живой клетке и в организме.
Влияние свободных радикалов на белки разного типа приводит к сложным модификациям в структуре белковой молекулы и, соответственно, к изменению ее физико-химических и биологических свойств. В зависимости от интенсивности генерации АФК степень окисления может быть различной: от единичных повреждений аминокислотных остатков до агрегации и фрагментации белковых молекул (Berlett B.S., Stadman E.R., 1997). Следствием этого могут стать нарушения в структуре активных центров ферментов, центров связывания белков-переносчиков, изменение антигенных свойств белков. Пути и конечные продукты окислительной модификации белков крайне сложны и многообразны, однако существует ряд характерных химических форм, которые образуются в большинстве случаев. К таким продуктам окисления относятся карбонилпроизводные белков. Было разработано несколько методов для определения содержания карбонильных групп белков (СО-групп), но наиболее чувствительным оказался метод, основанный на взаимодействии карбонильных групп с 2,4-динитрофенилгидразином (Oliver C.N., 1987; Chevion М. et al., 2000). До последнего времени этот метод успешно применялся в научных исследованиях при работе с модельными системами и с изолированными тканями. Эти успехи, естественно, привели к попыткам использовать данный метод для оценки степени окислительной модификации белков и как маркер окислительного стресса в клинической практике. Так как использование тканей в качестве клинического материала невозможно, основным объектом исследования стали сывороточные белки (Chevion М., 2000; Matteucci Е. et al, 2001). За последние годы в этом направлении был достигнут определенный прогресс, и в настоящий момент исследования не
7 прекращаются. Было отмечено повышение уровня карбонильных групп белков в сыворотке крови пациентов с болезнью Альцгеймера (Conrad С.С. et al., 2001), с хронической почечной недостаточностью (Himmelfabr J. et al., 2000), детей с ювенильным хроническим артритом (Renke J. et al., 2000), у хирургических больных в критических состояниях (Пасечник И.Н. и соавт., 2001).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что сывороточные белки действительно подвергаются окислительной модификации при различных патологических процессах и степень этой модификации может быть соотнесена с тяжестью заболевания, а также может быть использована в качестве контроля лечения и проведения антиоксидантной терапии.
Однако, несмотря на явный прогресс в этой области, еще остается немало вопросов, касающихся как характеристик самого метода, так и интерпретации полученных результатов.
Цель исследования: Оценить возможности метода определения карбонильных групп белков сыворотки крови для диагностики интенсивности процессов свободнорадикального окисления при различных заболеваниях и в условиях применения антиоксидантной терапии. Задачи исследования.
1. Исследовать параметры аналитической надежности метода определения карбонильных групп белков сыворотки крови (воспроизводимость, чувствительность, влияние способов хранения биоматериала и условий определения).
Выявить динамику образования карбонильных групп белков в опытах in vitro в зависимости от уровня продукции активных форм кислорода в различных химических системах.
Исследовать возможность определения карбонильных групп во фракциях альбуминов и глобулинов сыворотки, липопротеидов низкой и очень низкой плотности, иммунных комплексов.
4. Определить содержание карбонильных групп белков сыворотки крови, продуктов перекисного окисления липидов и параметров антиоксидантной системы у пациентов с различными заболеваниями: рассеянным склерозом, сердечно-сосудистой патологией, возрастной макулодистрофией до и после проведения антиоксидантной терапии. Сопоставить полученные данные с глубиной патологического процесса и эффективностью проводимой терапии.
5. Провести анализ значимости определения содержания карбонильных групп белков сыворотки крови в диагностике «окислительного стресса» в сравнении с другими параметрами оценки интенсивности свободнорадикальньгх процессов.
Научная новизна. В результате работы получены новые данные о диагностической значимости метода определения карбонильных групп белков сыворотки крови для оценки состояния процессов свободнорадикального окисления при различных заболеваниях и в условиях применения антиоксидантной терапии. Впервые определены параметры аналитической надежности данного метода и дана сравнительная характеристика различных маркеров «окислительного стресса». Новизна работы заключается в исследовании окислительного повреждения различных фракций белков сыворотки крови.
Практическая значимость работы. В результате работы разработаны методические рекомендации по определению карбонильных групп белков сыворотки крови в клинической практике. Выработаны рекомендации по интерпретации результатов исследования окислительной модификации белков сыворотки крови при различных заболеваниях.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Метод оценки окислительной модификации белков сыворотки крови по уровню карбонильных групп, определяемых по реакции с 2,4-ДНФГ, может быть использован в клинической практике, так как соответствует критериям аналитической надежности. Интерпретация результатов
9 определения карбонильных групп белков сыворотки должна проводиться на основе представлений о зависимости степени окислительной модификации белков от концентрации в среде активных форм кислорода и от типа белка. Гиперпродукция активных форм кислорода, вызывающая более глубокие изменения структуры белковой молекулы, может приводить к снижению выявляемости карбонильных групп белков.
2. Содержание карбонильных групп в белках сыворотки крови проявляет себя как самостоятельный показатель, характеризующий выраженность «окислительного стресса» и глубину окислительного повреждения белков, при различных патологических состояниях (рассеянный склероз, макулодистрофия, сердечно-сосудистая патология).
3. Возрастание карбонильных групп в белках липопротеидов низкой и очень низкой плотности, свидетельствующее об их окислительной модификации, характеризует атерогенные свойства этих липопротеидов, их определение может быть использовано в клинической лабораторной диагностике как дополнительный критерий риска развития атеросклероза.
Апробация работ. Результаты исследования были доложены на XIII научной конференции молодых ученых и специалистов ВМА им. Кирова (Санкт-Петербург, 1996), на международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 1999), на Всероссийской научной конференции «Биохимия - медицине» (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на VI международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002), на Первой Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2002).
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Оценка степени окисления белков в интактных клетках и модельных системах
Белки, модифицированные АФК, являются предпочтительными субстратами для протеаз и легче подвергаются деградации по сравнению с дативными белками. Это положение позволяет определить степень окисления, анализируя степень выраженности протеолиза. Изучение протеолиза основано на анализе аминокислот и маленьких пептидов, освобожденных в результате действия на белки протеолитических систем. В качестве таких систем используют клеточные экстракты или препараты чистых ферментов таких, как трипсин и химотрипсин. В настоящий момент существует несколько подходов для решения этой задачи как при работе с интактными клетками, так и при изучении чистых белков. Белки интактных клеток могут быть метаболически помечены инкубацией клеток с аминокислотами, содержащими радиоизотопы. Заново синтезированные белки будут содержать в себе радиоактивные метки. После воздействия свободных радикалов, лизиса клеток и осаждения белков измеряют с помощью счетчика кислоторастворимые свободные аминокислоты и пептиды, отщепившиеся от меченых белков в результате протеолиза внутриклеточными протеолитическими ферментами (Pacifici R., Davies J.K.A., 1990).
Если изучаются чистые белки, то их метят метальными группами, содержащими [3Щ, [14С] и [13С]. Это достигается взаимодействием с меченым формальдегидом и ЫаВЬЦ в качестве восстановителя. Метильные группы присоединяются к свободным аминогруппам, в первую очередь к Lys. Кроме метилирования используют радиоиодирование (125J и 131J), а также флуоресцентные метки. После окисления белков, протеолитического воздействия и осаждения ТХУ производят подсчет освобожденных меченых аминокислот и пептидных фрагментов.
Использование меток не всегда возможно, поэтому были разработаны нерадиоактивные методы анализа протеолиза. Например, так как клетки млекопитающих не способны синтезировать все аминокислоты и, в частности, аланин, то появление свободного аланина в супернатанте клеток может служить маркером деградации белков. Количество свободного аланина можно измерить по приросту флуоресценции при восстановлении NAD+ в NADH после добавления аланиндегидрогеназы (Pacifici R., Davies J.K.A., 1990).
Измерить количество свободных аминокислот можно, используя флуоресцирующие реагенты (например, флуоресцеинамин), избирательно связывающиеся с первичными аминогруппами, число которых возрастает в су-пернатанте с увеличением степени деградации белка (Davies K.J.A., Delsignore М.Е., 1987).
Более полные и достоверные сведения о протеолизе можно получить, проведя полный аминокислотный анализ.
Для исследования судьбы отдельных белков, подвергнутых свободно-радикальной обработке, используют такие методы, как двумерный гель-электрофорез с применением авторадиографии и иммунопреципитацию (Pacifici R., Davies J.K.A., 1990). Двумерным электрофорезом разделяют белки в зависимости от размера и заряда. Сканированием измеряют уменьшение окраски пятен, что свидетельствует о протеолитическом распаде. Индивидуальные белки могут быть иммунопреципитированы из клеточных экстрактов. Взаимодействие антиген-антитело высокоспецифично и снижение связывания свидетельствует о деградации протеина.
Степень окисления можно оценить по потере белком его биологической активности. Для этого измеряется способность белка выполнять ту или иную функцию (например, ферментативная активность или способность связывать определенные метаболиты) до и после окисления. По снижению активности судят о структурных изменениях в молекуле.
Достижения в развитии таких современных методов анализа структуры, как высокоэффективная жидкостная хроматография, ЭПР- и ЯМР-спекрометрия позволяют провести наиболее полный анализ продуктов сво-боднорадикального окисления белков.Таким образом, для оценки окислительной деструкции белков под воздействием АФК имеется возможность использовать довольно простые и одновременно чувствительные методы.
Роль окислительной модификации в регуляции оборота белков. Процессы окислительной модификации протекают в нормально функционирующем организме за счет систем окисления, катализируемого металлами. Появление в клетке окисленных белков активирует мультикаталитиче-ские протеазы, избирательно разрушающих дефектные белки. В настоящий момент окисление белков рассматривают как один из факторов регуляции синтеза и распада белка и считают, что скорость оборота внутриклеточных белков зависит от соотношения процессов окислительной модификации с последующим протеолизом и синтезом de novo. Селективный протеолиз предотвращает накопление в клетке окисленных молекул и образование протеиновых агрегатов (Stadman E.R., Levine R.L., 2000).
Однако в процессе старения организма повышается чувствительность многих белков к окислению, катализируемому металлами, и в тканях накапливаются их окисленные формы, в частности, модифицированные формы ряда ключевых ферментов со сниженной каталитической активностью и температурной устойчивостью. Предполагают, что это также может быть связано с инактивацией протеазных комплексов и основных ферментов АОЗ. Таким образом, скорость оборота белков с возрастом снижается, что обусловлено, по крайней мере, частично, окислительной модификацией белка. Эта концепция основывается на следующих наблюдениях:
Методы анализа активных форм кислорода и продуктов окислительной деградации макромолекул
Первую группу составили 30 пациентов (13 мужчин и 17 женщин) с диагнозом рассеянный склероз (PC). По типу течения PC все пациенты были разделены на три группы: ремитпфущий (РТ), первично-прогредиентный (ППТ), то есть с прогрессированием заболевания без обострений, и вторично-прогредиентный (Bllll), при котором после периода ремитгирующего течения идет прогрессирование вне обострений. Длительность заболевания колебалась от 3 до 16 лет. Об активности процесса судили по длительности ремиссий и частоте обострений и оценивали ее в баллах: 0 - ремиссия или отсутствие прогрессирова-ния при ВТПТ или ППТ; 1 - легкое обострение, продолжающееся восстановление после обострения или умеренное прогрессирование при ВТПТ или ППТ; 2 - отчетливое или сильное обострение, или быстрое прогрессирование. Тяжесть состояния от 0 до 3 баллов соответствовала легким или умеренным нарушениям функциональных систем, а от 3 до 7 баллов - резким и грубым нарушениям одной или более функциональных систем (Kurtzke J.F., 1983). Группа пациентов (7 человек) прошла курс антиоксидантной терапии, которая включала а-липоевую кислоту (эспа-липон) в/в капельно по 600 мг 1 раз в день -10 дней и далее 600 мг внутрь - 20 дней, никотинамид в/в капельно 500 мг 1 раз в день - 10 дней и далее 400 мг в 4 приема внутрь - 20 дней, ацетилцистеин 600 мг 2 раза в день - 30 дней, альфа-токоферола ацетат 40 мг 2 раза в день - 30 дней, бета-каротин 10 мг 2 раза в день - 30 дней, аскорбиновую кислоту 100 мг 2 раза в день - 30 дней, селен 50 мкг 2 раза в день - 30 дней, трентал 400 мг 3 раза в день - 30 дней, церебролизин 5 мл в/в 1 раз в день - 10 дней, амантадин (ПК-мерц) 100 мг 2 раза в день - 30 дней. Клиническая часть данного раздела была выполнена Г.Н. Бисагой, доцентом кафедры нервных болезней ВМА.
Во вторую группу вошли 46 пациентов в возрасте от 20 до 75 лет с диагнозом макулодистрофия, которые были разделены по формам заболевания - возрастная макулодистрофия (ВМД, п=17), вторичная центральная хороире-тинальная дистрофия (ВЦХРД, п=21), врожденная патология сетчатки, наследственно-обусловленная дистрофия (ТРА, п=6). Среди сопутствующей патологии отмечали наличие атеросклероза сосудов головного мозга, гипертоническую болезнь, дисциркуляторную энцефалопатию. 25 пациентов получали получали антиоксидантныи препарат адрузен-цинко на протяжении не менее 3-х месяцев (прием по инструкции). Всем обследованным был проведен курс терапии с применением рекомбинантного препарата СОД (в/в, по 16 мг в день в течение 10-ти дней). Клиническое сопровождение данного раздела проводила доцент кафедры офтальмологии ВМА Журавлева Л.В.
Следующую группу составили 99 пациентов с патологией сердечнососудистой системы (ГБ, ИБС и их сочетание), проходивших обследование и лечение во Всероссийском центре экстренной и радиационной медицины в 2002-2003 годах. Из них 72 человека были "ликвидаторами" последствий аварии на Чернобыльской АЭС (ЛПА), 26 человек не имели в анамнезе контакта с радиационным фактором или другими неблагоприятными факторами внешней среды (контрольная группа).
В группу ЛПА были включены жители Санкт-Петербурга, участвовавшие в аварийно-спасательных работах на ЧАЭС в 1986 году, в возрасте от 41 до 62 лет, с зафиксированной дозой более 20 сГр, с наличием заболеваний сердечно-сосудистой системы (ССС), из анализа были исключены пациенты с онкологическими заболеваниями, гепатитом, туберкулезом, черепно-мозговыми травмами.
Среди сопуствующей патологии отмечали дисциркуляторную энцефалопатию (ДЭ), ожирение, варикозную болезнь, хронический гастрит, хронический бронхит, язвенную болезнь.
Для участников ЛПА была характерна полиорганность патологии. В нашем исследовании ИБС была диагностирована у 63,8 % ликвидаторов, ГБ - у 96,4% , у 62,1% ликвидаторов имелось сочетание ИБС и ГБ, 9,7% ликвидаторов перенесли инфаркт миокарда, дисциркуляторная энцефалопатия смешанного генеза имела место у 94% обследованных, атеросклероз артерий нижних конечностей - у 18%, у 35,6% ликвидаторов были диагностированы заболевания желудочно-кишечного тракта, у 14,6% выявлены различные нарушения функции внешнего дыхания или установлен диагноз хронического бронхита. Данный раздел работы выполнен совместно с Юшкевич Е.В. (врач-кардиолог) и Тихомировой О.В. (ведущий научный сотрудник, начальник НИЛ клинической нейрофизиологии) ВЦЭРМ МЧС России.
Еще одну группу обследованных составили 28 пациентов с кардиаль-ным синдромом X (Х-синдром), которым были проведены клинические и функциональные исследования на кафедре патофизиологии ВМА Лавинской Н.Н. Группа состояла из 11 женщин и 17 мужчин в возрасте от 30 до 60 лет с типичной клинической картиной стенокардии, характерными признаками ишемии на электрокардиограмме при нагрузочных тестах и достоверным отсутствием признаков гемодинамически значимых стенозов венечных артерий при ангиографиче-ском исследовании
В качестве группы здоровых лиц было обследовано 62 первичных донора: 23 женщины и 39 мужчин в возрасте от 18 до 30 лет без признаков хронических заболеваний, зарегистрированные на донорском пункте станции переливания крови Военно-медицинской академии в течение 2002-2003 гг. Основным правилом при анализе продуктов СРО и компонентов АОС являлось проведение исследования в день забора материала. В некоторых случаях биологический материал сохранялся при температуре минус 20С. Сыворотку крови получали обычным способом. Для проведения анализа в эритроцитах, кровь центрифугировали при 3000 об/мин. 15 минут, плазму отбрасывали и эритроциты промывали два-три раза изотоническим раствором. Эритроцитарную массу использовали для получения гемолизата в соответствии с методом определения того или иного параметра. При работе с лейкоцитами и тромбоцитами периферической крови использовали силиконированные или полиэтиленовые пробирки. Для исследования процессов СРО в лейкоцитах и тромбоцитах их выделяли из периферической крови по методике на фиколл-верографиновом градиенте (Зыбина Н.Н., Лавинская Н.Н., 1994). Для разделения клеточных элементов периферической крови использовали ее центрифугирование в градиенте плотности. 8 мл крови забирали в пробирку с 3 мл полиглюкина и 2 каплями гепарина. Кровь отстаивали 60 мин. при температуре 25 С. Слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, центрифугировали, осадок лейкоцитов ресуспендиро-вали и использовали для биохимических исследований. Для разделения лейкоцитов плазму, обогащенную лейкоцитами, наслаивали на 2 мл среды с градиентом и центрифугировали 35 мин. при 1500 об./мин.
Дифференциальные спектры динитрофенилгидразонов белков при их окислении в химических системах, генерирующих активные формы кислорода
До последнего времени основным показателем, используемым для оценки состояния окислительного стресса, был уровень продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, (ТБК-АП). Однако этот метод имеет ряд ограничений в применении. Так, например, из-за интерференции в ходе анализа невозможно использовать для определения ТБК-АП гемолизирован-ную сыворотку или сыворотку, содержащую повышенное количество билирубина. Единственным возможным выходом в данной ситуации могло бы стать использование метода определения СО-групп белков. Для выяснения этого вопроса была исследована сыворотка пациентов с острой формой гепатита В (с гипербилирубинемией). Из литературных данных известно, что для этого патологического состояния характерно усиление продукции активных форм кислорода и интенсификация процессов свободнорадикального окисления. Действительно, оказалось, что уровень карбонильных групп белков сыворотки крови у пациентов с острым гепатитом был значительно повышен по сравнению с нормой - 1,66 нмоль/мг белка (Р 0,05), при интервале нормальных значений от 0,81 до 1,05 нмоль/мг.
Таким образом, данные нашего исследования выявили принципиальную возможность использования метода определения карбонильных групп белков сыворотки крови для оценки состояния «окислительного стресса» у пациентов с повышенной концентрацией билирубина в сыворотке.
Согласно данным литературы и результатам наших модельных опытов механизмы окисления белков могут быть разными. Было проведено исследование возможности использования метода определения СО-групп для оценки степени окислительной модификации белков различных белковых фракций сыворотки крови: альбуминов, глобулинов, ЛПНП, ЛПОНП и ЦИК.
Попытки определения содержания карбонильных групп во фракциях белков потребовали использования различных методов разделения белковых смесей.
Разделение белков на фракции альбуминов и глобулинов проводили методом высаливания, используя 40% раствор сернокислого аммония (СКА). Методику высаливания проводили по рекомендациям Зубиной И.М. (2001): к 3 мл сыворотки крови при перемешивании добавляли 2 мл охлажденного раствора СКА (рН 6,1), для более полного осаждения глобулинов смесь выдерживали 40 минут при 8С, затем цетрифугировали 40 минут при 5500 об./мин. Супернатант, содержащий альбумины, очищали от СКА с помощью диализа при температуре 16-18С против десятикратного объема воды при постоянном перемешивании в течение 6 часов. После диализа белковый раствор концентрировали, удаляя воду за счет осмотических сил. Для этого диализный мешок помещали в сухой ПЭГ 6000. Полученный раствор альбуминов использовали для дальнейшего анализа содержания карбонильных групп. Осадок глобулинов растворяли в фосфатном буфере (рН 7,4) и также проводили определение содержания карбонильных групп.
Полученные результаты по уровню карбонильных групп не выявили определенных закономерностей в содержании этих маркеров окислительного повреждения во фракциях белков, полученных методом высаливания. Вероятно, это было связано не отсутствием искомых закономерностей, а с несовершенством методов выделения и очистки. Учитывая трудоемкость методики было решено отказаться от использования данного подхода к изучению окислительной модификации белков.
В последние годы широкое распространение получило предположение об участии окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в инициации процесса атерогенеза и появилось большое количество работ, посвященных изучению свободнорадикального окисления липидного компонента липопротеидов низкой и высокой плотности. Однако, будучи более чувствительными к окислению, именно белки должны представлять собой основные мишени для воздействия свободных радикалов в условиях оксидативного стресса, что и было показано в опытах in vitro (Zarev S. et al., 2002). Данные об окислительной модификации белков липопротеиновых частиц in vivo в литературе отсутствуют.
Для того чтобы оценить степень окислительной модификации белков ЛПНП и ЛПОНП сыворотки крови, измеренной как уровень содержания СО-групп в липопротеидах, мы в своей работе попытались выделить липопро-теиновые частицы двумя параллельными методами. Во-первых, был использован метод осаждения ЛПНП и ЛПОНП фосфорновольфрамовой кислотой (ФВК) с использованием набора фирмы "Randox", и, во-вторых, осаждение липопротеинов сыворотки крови (ЛПНП и ЛПОНП) гепарином в присутствии ионов кальция (Колб В.Г., Камышников B.C., 1976). После осаждения и в первом и во втором случае осадок центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 минут, затем непосредственно в осадке, содержащем ЛПНП и ЛПОНП, определяли содержание карбонильных групп. Данные, полученные при определении уровня карбонильных групп в ЛПНП и ЛПОНП в группе здоровых лиц, представлены в таблице 3.2.2.1.
Из представленных результатов видно, что использование предложенного нами подхода к определению карбонильных групп в белках липопро-теидов низкой и очень низкой плотности может быть предложено для оценки степени окислительной модификации этих белков.
Окислительная модификация иммуноглобулинов сыворотки крови так же может привести к потере или изменению биологической функции этих важнейших компонентов белковой составляющей плазмы крови. Для того чтобы оценить принципиальную возможность определения маркеров окислительного повреждения во фракции иммуноглобулинов, мы попытались осадить циркулирующие иммунные комплексы 5% раствором полиэтиленглико-ля (Szondy E.et al., 1983) и в осадке, полученном после инкубации смеси в течение 30 минут в ледяной бане и трехкратной промывки 2,5% ПЭГ, определить содержание СО-групп. Однако нам не удалось выявить наличие 2,4-ДНФ-гидразонов белка, вероятно, вследствие малого количества осаждаемого белкового материала.
На основе проведенных исследований мы сделали вывод о том, что метод определения карбонильных групп белков может быть использован для изучения окислительной модификации в белках липопротеидов, во фракциях альбуминов и глобулинов сыворотки крови. Карбонильные группы белков иммунных комплексов не выявляются данным методом.
Карбонильные группы белков в оценке «окислительного стресса» при макулодистофии
Дальнейший анализ полученных результатов проводили в зависимости от пола, возраста, диагноза, варианта течения заболевания, его активности, длительности и тяжести.
При анализе полученных результатов в зависимости от пола пациентов оказалось, что мужчины с PC имели повышенный уровень карбонильных групп в белках сыворотки крови по сравнению с женщинами (табл. 4.2). При этом у всех мужчин из обследованной группы уровень карбонилпроизводных белков превышал верхнюю границу нормы. Кроме того, в двух случаях уровень карбонильных групп превышал нормальные значения в 2-2,5 раза. У женщин наряду со значениями, превышающими верхнюю границу нормы, с равной вероятностью встречались сниженные значения параметра по сравнению с нормой. В пяти случаях из пятнадцати уровень карбонильных групп у женщин соответствовал нормальным значениям.
Параллельно увеличению количества карбонильных групп в белках, образование которых является свидетельством свободнорадикального повреждения белков, возрастало содержание конечных продуктов ПОЛ в сыворотке крови пациентов мужского пола. Только у одного мужчины уровень ТБК-АП был в пределах нормальных величин, а еще у трех он был меньше 4,0 мкмоль/л. У жен 81 шин, наоборот, содержание ТБК-АП больше 4,0 мкмоль/л было только у трех из пятнадцати. При этом именно у мужчин были выявлены самые низкие значения восстановленного глутатиона. Только два человека из пятнадцати имели содержание восстановленного глутатиона больше 2,2 мкмоль/л эритроцитов при нижней границе нормы 2,1 мкмоль/л. Активности антиоксидантных ферментов СОД и ка-талазы не различались в зависимости от пола пациентов, хотя у мужчин чаще встречались значения активности СОД более высокие, но в пределах нормальных величин. Следует отметить, что при обследовании здоровых лиц не было выявлено различий по полу.
Дальнейший анализ данных, полученных при обследовании пациентов с PC, выявил отсутствие различий исследуемых параметров в зависимости от возраста пациентов (табл. 4.3). Следующим этапом обработки полученных результатов стал анализ данных в зависимости от варианта течения заболевания. Для пациентов с первично-прогредиентным типом течения был характерен следующий вариант сдвигов параметров свободнорадикального окисления (табл. 4.4): у всех пациентов этой группы показатели окислительной модификации белков сыворотки крови (СО-группы) были выше 1,12 нмоль/мг белка (при верхней границе нормы - 1,05 нмоль/мг белка). Кроме того, для этих пациентов были характерны самые высокие значения базального уровня продуктов ПОЛ (ГБК-АП) и самые низкие уровни восстановленного глутатиона. Важно отметить, что в группе с ремиттирующим течением заболевания вариабельность изученных показателей была очень большой. Так, уровень СО-групп колебался от 0,52 до 1,93 нмоль/мг белка, то есть от очень низких значений до значений превышающих границу нормы. Такие же колебания наблюдались и при исследовании других параметров: ТБК-АПбаз. - от 1,15 до 4,89 мкмоль/л; восстановленный глутатион - от 1,12 до 3,65 мкмоль/л; СОД - от 3,17 до 9,2 отн.едУмг белка; каталаза - от 2,3 до 13,8 едУмл. Как видно, в эту группу попали пациенты с результатами, выходящими далеко за пределы как нижней, так и верхней границы нормы, что свидетельствует о большой неоднородности данной группы. У пациентов с вторично-прогредиентным течением заболевания, наоборот, результаты очень однородны: уровень СО-групп во всех случаях оказался сниженным и не превышал 0,81 нмоль/мг белка, остальные параметры укладывались в интервалы нормальных значений. Однако ввиду малочисленности этой группы в настоящее время трудно сделать определенные выводы.
