Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы в большинстве стран мира, в том числе и в нашей стране наблюдается рост заболеваемости колоректальным раком (Г.И.Воробьев и соавт., 2005; Hawk Е.Т. et al., 2002; Levin В. et al., 2005). Ежегодно в мире регистрируется около 1 млн. новых случаев рака прямой и ободочной кишки (3-й по частоте показатель заболеваемости среди онкологических болезней), а умирает почти 500 тыс. человек (4-е место по показателю смертности) (Engstrom P.F., 2000; Parkin D.M. et al., 1999; В.В.Мартынюк, 2000; Н.Н.Симонов и соавт., 2000; Н.Н.Трапезников и соавт., 2000).
По прогнозу ожидается, что в XXI веке в России рак данной локализа-
ции займет первое место в структуре онкологической заболеваемости
(Н.Н.Симонов и соавт., 1997; Н.А.Яицкий и соавт., 2004; Е.М.Аксель и со-
авт., 2004). В России ежегодно колоректальным раком заболевают 50 тыс.
человек (3-е место у мужчин после рака легких и желудка и 2-е место у жен-
щин после рака молочной железы) при ежегодной смертности, равной 35 тыс.
Метастазы являются основным фактором, отягощающим прогноз коло-
ректального рака. Поэтому, в настоящее время проводится активный поиск дополнительных маркеров, которые предсказывают высокий риск опухолевой прогрессии (В.И.Киселев и соавт., 2005).
В настоящее время бурно развивается направление молекулярной ди-
агностики и оценки прогноза этих опухолей, а исследование особенностей
биологического поведения опухоли является в настоящее время одной из
наиболее актуальных областей онкологии (А.А.Новик и соавт., 2004; Von
Kleist S., 2008). Расширяются возможности иммуногистохимического выявления в клетках колоректального рака и в структурах внеклеточного матрикса особенностей экспрессии молекулярных маркеров, отражающих специфику биологической активности опухоли (В.В.Делекторская и соавт., 2008; Muller W. et al., 1998; Sarris M. et al., 2001; Ahmed F.E. et al., 2005). Среди опухолеассоциированных протеолитических ферментов ведущую роль играет система активаторов плазминогена, представленная двумя протеазами – тканевым и урокиназным активаторами плазминогена (uРА и tPA), а также металлопротеиназная система, состоящая из 25 представителей (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2008). Ключевую роль в семействе металлопротеиназ играют ММР-2 и ММР-9, функция которых связана с гидролизом коллагена базальных мембран (Е.С.Герштейн и соавт., 2008). uРА и tPA превращают неактивный зимоген плазминоген в плазмин, расщепляющий фибрин и белки внеклеточного матрикса, а также активирующий ММР-2 и ММР-9. Эти процессы способ-
ствуют разрушению базальных мембран и облегчают инвазию опухолевых
клеток. При этом важную роль в опухолевой прогрессии играют и их эндо-
генные ингибиторы (TIMP и PAI), которые могут способствовать протеоли-
тическому действию ферментов (Gershtein E. et al., 2007). ММР, сериновые
протеазы (uPA, tPA) не только облегчают опухолевый рост, раковую инвазию
и метастазирование, но и могут являться мишенью для противоопухолевой
терапии и лечения метастазов (Е.С.Герштейн и соавт., 2007; Mysliwill A.G. et
al., 2002; Waas E.T. et al., 2002; Gontero P. et al., 2004).
Основные белки базальных мембран (коллаген IV типа и ламинин) яв-
ляются не только структурным барьером для метастатического распростра-
нения раковых клеток, но и важной функциональной единицей, участвующей
в опухолевой прогрессии (Galbavy S. et al., 2002).
При этом деградирующие матрикс протеиназы не только ремоделиру-
ют архитектуру внеклеточного матрикса, но и воздействуют на различные
пути передачи сигнала в клетке, усиливают ангиогенез и способствует укло-
нению опухоли от программы апоптоза (Г.И.Абелев и соавт., 2008). Так, из-
вестно, что ключевым проангиогенным фактором является VEGF - гликопро-
теин, стимулирующий пролиферацию эндотелиальных клеток. Этот фактор
усиленно продуцируется также клетками ряда новообразований, способствуя
неоваскуляризации опухоли и усилению проницаемости сосудов (Gershtem
E.S. et al., 2006; Shin J.E. et al., 2007).
Апоптоз или его отдельные элементы выполняют важные физиологи-
ческие функции, при этом преодоление апоптоза является необходимым ус-
ловием успешного развития опухоли (С.Г.Аббасова и соавт., 2007). Один из
механизмов, регулирующих эти процессы в опухоли, связан с активностью
апоптоз-специфических белков системы Fas/FasL (Bennett M.W. et al., 2001;
O'Connell J. et al. 2000; Zhu Q. et al., 2005; Song E. et al., 2001).
Относительно недавно получены первые клинические исследования по
неоангиогенезу и Fas-зависимому апоптозу при солидных опухолях, в том
числе и колоректальном раке (С.Г.Аббасова и соавт., 2007). Показано, что
повышенный уровень продукции ключевого активатора ангиогенеза - VEGF
и ингибитора апоптоза - растворимого Fas-антигена (sFas) у больных некото-
рыми злокачественными новообразованиями может свидетельствовать о вы-
соком «метастатическом потенциале» опухоли, что является неблагоприят-
ным прогностическим фактором (А.А.Фильченков и соавт., 1999;
С.М.Киселев и соавт., 2003). Однако эти данные основаны пока на незначи-
тельном числе наблюдений. Кроме того, не изучали одновременно факторы
ангиогенеза и апоптоза с использованием малоинвазивных биохимических
методов исследования в сыворотке крови, что также затрудняет обсуждение
представленных в литературе результатов.
Несмотря на то, что накапливается все больше данных о нарушениях
нормальной экспрессии и функционирования молекулярных факторов при
раке толстой кишки, их влияние на клиническое течение и прогноз заболева-
ния изучено недостаточно. Многие вопросы, касающиеся корреляции клини-
ко-морфологических характеристик опухоли и изменений биологических по-
казателей, происходящих в процессе прогрессирования рака толстой кишки,
нуждаются в уточнении. Этим определяется актуальность изучения молеку-
лярных критериев, прогнозирующих агрессивность течения колоректального
рака.
Цель работы.
Изучение особенностей экспрессии молекулярно-биологических мар-
керов внеклеточного матрикса, ангиогенеза, апоптоза в опухоли, сыворотке
крови больных раком толстой кишки и роли комплекса этих факторов в
оценке прогноза заболевания.
Задачи исследования.
1. Изучить биохимические и иммуногистохимические особенности
экспрессии ММР-9 в первичных опухолях больных раком толстой кишки и в
прилежащей к опухоли непораженной слизистой оболочке.
2. Исследовать особенности экспрессии структурных компонентов ба-
зальных мембран (коллагена IV типа) в злокачественных опухолях толстой
кишки.
3. Провести сравнительный анализ особенностей экспрессии фермен-
тов внеклеточного матрикса и компонентов базальных мембран и выявить их
взаимосвязь с основными клиническими и морфологическими параметрами
заболевания.
4. Провести иммуноферментное определение молекулярно-
биологических маркеров неоангиогенеза (VEGF) и апоптоза (sFas) в сыво-
ротке крови больных раком толстой кишки и изучить корреляцию биохими-ческих показателей с основными клинико-морфологическими параметрами
заболевания.
-
Провести иммуноферментное определение содержания компонентов
системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) в опухоли больных коло-
ректальным раком и изучить корреляцию биохимических показателей с ос-
новными клинико-морфологическими характеристиками заболевания. -
Определить прогностическую значимость биохимических и имму-
ногистохимических особенностей экспрессии белковых маркеров у больных
раком толстой кишки. -
Провести статистическую обработку данных и на основании много-
факторного анализа результатов исследования выделить значимые и незави-
симые прогностические показатели при раке толстой кишки.
Научная новизна.
Проведен комплексный клинический, морфологический и
биохимический анализ современных молекулярно-биологических маркеров у
больных раком толстой кишки, таких как протелитические ферменты и ком-
поненты внеклеточного матрикса, факторы неоангиогенеза и апоптоза.
Обнаружена повышенная экспрессия ММР-9 в ткани опухоли больных
раком толстой кишки у 48,7% пациентов. При этом, частота выявления высо-
кой экспрессии белка достоверно повышалась до 80% у больных при мета-
стазах в печени, при низкой степени дифференцировки опухоли (80%) и при
наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах (82,4%).
У 57,2% больных раком толстой кишки выявлена низкая экспрессия
коллагена IV типа в опухоли, причем частота выявления низкой экспрессии
белка достоверно повышалась у пациентов с метастазами в печени (85%),
при низкой степени дифференцировки опухоли (76%), при выраженной глу-
бине инвазии в стенку кишки (75%), а также при наличии инвазии клеток ра-
ка в кровеносные сосуды (86,3%).
Обнаружено что уровень ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки был достоверно выше по сравнению с контролем. Причем, достоверно более высокое содержание VEGF выявлено в сыворотке крови больных при местнораспространенной и IV стадии колоректального рака, тогда как концентрация VEGF у больных раком толстой кишки при I и Па стадиях опухоли не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей.
Содержание маркера достоверно повышалось при увеличении глубины инвазии опухоли в стенку кишки и при наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах. Содержание VEGF при низкой степени дифференцировки колоректального рака было достоверно выше, чем при высокой. Одновременно с увеличением концентрации VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно низкая экспрессия коллагена IV типа.
Впервые обнаружено, что sFas выявлялся в 2 раза чаще у больных ко-
лоректальным раком по сравнению с контролем, а его содержание в сыво-
ротке крови практически здоровых людей было ниже, чем у больных. При
этом, уровни sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки зависели
от стадии заболевания, хотя при I стадии не отличались от содержания мар-
кера у практически здоровых людей. Достоверно выше было содержание sFas
при значительной глубине инвазии, при наличии инвазии в кровеносные со-
суды, при неблагоприятных уровнях экспрессии белков ММР-9 и коллагена
IV типа.
Обнаружено, что содержание uРА и tPA в ткани опухоли больных ра-
ком толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой.
При этом, уровни uРА и tPA в ткани первичной опухоли зависели от ряда
клинико-морфологических характеристик опухоли.
Полученные данные свидетельствуют о том, что новый подход к про-
гнозированию клинического течения колоректального рака основан на ис-
пользовании комплексного анализа согласованных изменений экспрессии изученных молекулярно-биологических маркеров в опухоли и сыворотке крови больных с целью определения связи данных показателей с инвазивным и метастатическим потенциалом опухоли, а стало быть, и выживаемостью пациентов. На основании исследования молекулярно-биологических характеристик колоректального рака разработаны критерии, позволяющие идентифицировать случаи с повышенным риском развития отдаленных метастазов.
Впервые при раке толстой кишки изучена корреляция между экспрессией белков базальных мембран, факторов неоангиогенеза, апоптоза, активностью матриксных металлопротеиназ и компонентов системы активации плазминогена. Изучение особенностей экспрессии белковых маркеров в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком позволило уточнить некоторые патогенетические механизмы прогрессирования опухоли.
Практическая значимость.
На основе анализа некоторых молекулярно-биологических характери-
стик опухоли определены критерии для выявления наиболее прогностически
неблагоприятных случаев и предрасположенности, больных колоректальным
раком к развитию метастазов. Так, показатели общей выживаемости больных
колоректальным раком при высоком уровне экспрессии ММР-9 в первичной
опухоли в 3 раза достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка, а 5-
летняя безрецидивная выживаемость пациентов ниже в 1,5 раза. Показатели
общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки зависели от
уровня исходной концентрации ключевого активатора неоангиогенеза VEGF
в сыворотке крови и при высоких его значениях (от 800 пг/мл и более), они
были достоверно ниже, чем при значении VEGF менее 400 пг/мл. При этом,
высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли больных колорек-
тальным раком был связан с повышенными исходными уровнями VEGF в
сыворотке крови. Общая 5-летняя выживаемость больных колоректальным
раком при уровнях sFas в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была досто-
верно ниже. Кроме того, обнаружено, что безрецидивная выживаемость
больных раком толстой кишки достоверно различалась между больными по пороговому уровню 3 нг/мг белка для иРА, 2 нг/мг белка для tPA и 2 нг/мг
белка для PAI-1. Многофакторный анализ выявил наиболее неблагоприятные
сочетания маркеров при оценке общего прогноза рака толстой кишки: ММР-
9-коллаген IV типа, MMP-9-uPA, MMP-9-PAI-1, коллаген IV типа-PAI-l и
при прогнозе отдаленных метастазов MMP-9-sFas.
Таким образом, настоящее исследование представляет практический
интерес для оценки послеоперационного прогноза больных раком толстой
кишки и выделения групп повышенного риска развития метастазов и реци-
дивов, требующих дополнительного лечения или более тщательного динами-
ческого наблюдения.
Апробация работы.
Апробация диссертации проведена на совместной научной конферен-
ции с участием сотрудников кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Московского государственного медико-стоматологического
университета, лаборатории клинической биохимии, хирургического отделе-
ния проктологии, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ
клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра
им. Н.Н.Блохина РАМН 12 июня 2008г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных
работ, в том числе в изданиях, рекомендуемых ВАК – 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 177 стра-
ницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и ме-
тодов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, обсуж-
дения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций.
Текст иллюстрирован 58 таблицами и 23 рисунками. Указатель литературы
содержит 74 работ отечественных и 186 зарубежных авторов.
Положения, выносимые на защиту;
