Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль иммуногистохимических исследований в прогнозировании отдаленных результатов лечения больных со злокачественными новообразованиями .
Глава 2. Материалы и методы 32
Глава 3. Экспрессия иммуногистохимических маркеров (КІ67, топоизомераза На, р53 и Е-кадхерин) при плоскоклеточном раке легкого .
Глава 4. Экспрессия иммуногистохимических маркеров в зависимости от характеристик первичной опухоли и метастазирования в регионарные лимфатические узлы . 44
Глава 5. Особенности экспрессии иммуногистохимических маркеров при центральной и периферической клинико- анатомических формах плоскоклеточного рака легкого .
Глава 6. Клинико-прогностическое значение морфологических и экспрессии морфогенетических маркеров при ПРЛ. 73
Заключение 86
Выводы 93
Практические рекомендации 94
Список литературы 95
- Роль иммуногистохимических исследований в прогнозировании отдаленных результатов лечения больных со злокачественными новообразованиями
- Экспрессия иммуногистохимических маркеров (КІ67, топоизомераза На, р53 и Е-кадхерин) при плоскоклеточном раке легкого
- Экспрессия иммуногистохимических маркеров в зависимости от характеристик первичной опухоли и метастазирования в регионарные лимфатические узлы
- Особенности экспрессии иммуногистохимических маркеров при центральной и периферической клинико- анатомических формах плоскоклеточного рака легкого
Введение к работе
Рак легкого занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости в России, являясь основной причиной смертности мужского населения от злокачественных новообразований. Он объединяет группу опухолей, различающихся по клиническому течению, морфологическому строению, биологической природе, способности к метастазированию, темпам роста и прогнозу.
Основной проблемой в стадировании злокачественного новообразования является недостаточная разрешающая способность существующих методов диагностики, что не позволяет выявлять субклинические метастазы и обоснованно судить об истинной распространенности процесса. Между тем, именно скрытая диссеминация на момент диагностики обусловливает неэффективность хирургического вмешательства и требует системного лечения.
На долю плоскоклеточного РЛ приходится до 60% всех форм опухолей легкого.
Учитывая генетическую полиморфность НМРЛ и его низкую чувствительность к химиотерапии, высокую токсичность и стоимость применяемых препаратов, целесообразно более точно определять группу пациентов, подлежащих дополнительным видам послеоперационной терапии. Отсутствие данных о параметрах опухоли, характеризующих ее биологическую активность -скорость роста, интенсивность неоваскуляризации, метастатический потенциал, а также вероятность субклинического метастазирования - затрудняет адекватное прогнозирование течения заболевания, и, следовательно, выбор оптимальной тактики лечения. Разработка методов идентификации больных ПРЛ с плохим прогнозом должна включать изучение биологических свойств первичной опухоли.
Роль химиотерапии в лечении НМРЛ остается дискуссионной. НМРЛ относится к опухолям с низкой химиочувствительностью, однако химиотерапия НМРЛ - одно из наиболее динамично развивающихся направлений химиотерапии (XT) в онкологии. Разработка новых схем терапии на основе
традиционно применяемых препаратов платины, внедрение в клиническую практику новых противоопухолевых химиопрепаратов изменили возможности XT как местнораспространённых, так и диссеминированных форм НМРЛ.
В связи с этим, изучение морфогенетических маркеров, позволяющих стратифицировать больных ПРЛ по степени биологической активности опухоли, представляет особый интерес в плане оптимизации назначения лекарственной терапии.
Наиболее важными из предиктивных факторов при НМРЛ являются маркеры пролиферативной активности, апоптоза и межклеточного взаимодействия. Их прогностическая значимость и возможность клинического применения остаются предметом дискуссий, а их экспрессия и особенности взаимодействия при различных клинико-анатомических формах опухоли изучены недостаточно.
Цель работы:
Определить клинико-прогностическое значение иммуногистохимиче-ских маркеров пролиферации, апоптоза и межклеточной адгезии при плоскоклеточном раке легкого.
Задачи исследования:
Изучить экспрессию иммуногистохимических маркеров пролиферации, апоптоза и межклеточной адгезии в плоскоклеточном раке легкого
Оценить особенности плоскоклеточного рака легкого, используя иммуно-гистохимические маркеры пролиферации, апоптоза и межклеточной адгезии на различных этапах опухолевой прогрессии
Изучить связи уровней экспрессии иммуногистохимических маркеров с клинико-морфологическими характеристиками плоскоклеточного рака легкого (возрастом, полом, размером опухоли, наличием некроза, состоянием внутригрудных лимфатических узлов, клинико-анатомической формой).
Провести анализ выживаемости больных ПРЛ в зависимости от клини-ко-анатомических, морфологических и морфогенетических особенностей опухоли и оценить прогностическое значение изучаемых параметров.
Выявить возможные биологические различия между ПНР Л и ЦІ IP Л.
6. Изучить возможность использования ИГХ исследований для выделения
групп больных с неблагоприятным прогнозом, подлежащих дополнитель
ной послеоперационной лекарственной терапии.
Научная новизна
1. Впервые установлены различия между клинико-анатомическими
формами ПРЛ, которые выражаются в следующем:
при центральном и периферическом раке легкого уровень экспрессии маркера р53 различен,
уровни экспрессии маркеров пролиферативной активности, р53 и межклеточной адгезии взаимно коррелированы только в ЦПРЛ,
реализация метастатического потенциала при ПНР Л в большей степени связана с повышением пролиферативной активности, а при ЦПРЛ -с мутацией гена супрессора р53.
2. Клинико-анатомическая форма опухоли является значимым прогности
ческим фактором при наличии метастазов в регионарные лимфатиче
ские узлы.
Научно-практическая значимость
Маркеры пролиферативной активности, мутации гена супрессора р53 и межклеточной адгезии (Е-кадхерин) являются вспомогательными характеристиками агрессивности опухолевого процесса и могут быть использованы в качестве дополнительных факторов прогноза с учетом клинико-анатом и ческой формы. Их применение в клинической практике позволяет стратифицировать
больных с учетом потенциальной агрессивности опухоли и может использоваться для назначения адъювантной терапии.
Положения выносимые на защиту:
1. Маркеры пролиферативной активности, мутации гена супрессора р53 и межклеточной адгезии (Е-кадхерин) являются ценными вспомогательными характеристиками агрессивности опухолевого процесса.
2. Имеются биологические различия между центральным (ЦПРЛ) и пери
ферическим (ГШРЛ) плоскоклеточным раком легкого (ПРЛ) которые за
ключаются в том, что характер взаимосвязи уровней экспрессии изу
чаемых ИГХ маркеров между собой и их прогностическая значимость в
опухолях ЦПРЛ и ГШРЛ различны. ЦПРЛ и ГШРЛ различаются также по
уровню экспрессии маркера мутации гена - супрессора р53.
3. Анализ корреляций между уровнями экспрессии ИГХ маркеров является
более чувствительным методом выявления биологических различий опухоле
вых процессов, чем сравнение уровней этих маркеров.
Роль иммуногистохимических исследований в прогнозировании отдаленных результатов лечения больных со злокачественными новообразованиями
Рак легкого занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости в России, являясь основной причиной смертности мужского населения от рака. Максимальный показатель заболеваемости РЛ у мужчин наблюдается в возрастной группе 65-75 лет (53,8%), у женщин - 70-74 года (66,8%). Практически у 2/3 первично выявленных в России больных РЛ диагностируется ШВ и IV стадии. Рак легкого объединяет группу опухолей, различающихся по клиническому течению, морфологическому строению, биологической природе, темпам роста и способности к метастазированию и прогнозу. Выделяют две основные группы: чувствительный к химио- и лучевой терапии мелкоклеточный (овсяноклеточный, лимфоцитоподобный, веретеноклеточный и полиморфноклеточный) и относительно резистентный к терапии немелко-клеточный (ПРЛ и АК разной степени дифференцировки, крупноклеточный и смешанный) рак [13].
Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 75% всех форм РЛ и представлен, в основном, плоскоклеточным РЛ (ПРЛ) — 70%. Гистологически для ПРЛ характерно 3 основных признака: внутриклеточное образование кератина, наличие межклеточных мостиков и формирование роговых жемчужин [13]. Выраженность этих признаков определяет степень дифференцировки: высоко-, умеренно- и низко дифференцированный ПРЛ.
Для ПРЛ характерно лимфогенное метастазирование в лимфатические узлы корня легкого, средостения и гематогенное в надпочечники, кости, печень, головной мозг. Выживаемость при ПРЛ значительно выше, чем при других формах рака легкого.
Несмотря на прогресс в хирургическом лечении, лучевой и химиотерапии, выживаемость больных ПРЛ за последние десятилетия мало изменилась. Прогноз течения заболевания до настоящего времени определяется TNM стадией и степенью дифференцировки опухоли. Так 5-летняя выживаемость больных НМРЛ после хирургического лечения при IA стадии (TiNOMO) составляет 63-81 %, IB - 44-60%, НА - 32-59%, ПВ - 32-50% и 13-32% при более поздних стадиях. У больных, имеющих опухоли сходной степени дифференцировки и распространения, отдаленные результаты хирургического лечения варьируют, что связано с различной морфогенетически обусловленной агрессивностью. При ПРЛ последняя служит одним из основных прогностических факторов, отражающих биологические особенности опухоли.
Применяемые в настоящее время методы лечения рака легкого полного излечения обеспечить не могут. Основным по значимости и эффективности компонентом лечения больных НМРЛ является хирургический, однако имеются клинико-экспериментальные обоснования применения лучевой и лекарственной противоопухолевой терапии. Это обусловлено, в первую очередь, высокой частотой лимфогенных и гематогенных метастазов и отсутствием исходной информации о распространенности опухоли. Необходимость применения системной химиотерапии при ранних стадиях злокачественного процесса дискутируется. Ряд авторов признает, что на момент диагностики в большинстве случаев так называемый «ранний» рак легкого представляет собой распространенный процесс, что требует дополнительного лекарственного лечения [6].
В настоящее время химиотерапия НМРЛ - одно из наиболее динамично развивающихся направлений химиотерапии в онкологии. Разработка новых схем терапии изменили возможности XT как местнораспространённых, так и диссеминированных форм НМРЛ. С помощью современных подходов удалось увеличить медиану выживаемости больных, получавших комбинированную XT при распространенном НМРЛ, от 4 до 8-10 месяцев. Одногодичная выживаемость увеличилась с 11-14 до 32-37%) [8]. Сегодня активно изучаются вопросы комбинированного лечения с использованием неоадьювантной химиотерапии. Учитывая генетическую полиморфность и низкую химио-чувствительность НМРЛ, высокую токсичность применяемых в его лечении препаратов, их высокую стоимость, едва ли целесообразно рекомендовать назначение полихимиотерапии всем без исключения больным с данной нозологической формой. Отсутствие данных о параметрах опухоли, характеризующих ее биологическую активность, - скорость роста, интенсивность неоваску-ляризации, метастатический потенциал, а также вероятность субклинического метастазирования, затрудняют адекватную оценку прогноза течения заболевания, и, следовательно, выбор оптимальной тактики лечения. Разработка методов идентификации больных ПРЛ с плохим прогнозом должна включать изучение биологических свойств первичной опухоли. Наиболее важными из предиктивных факторов при НМРЛ являются маркеры пролиферативной активности, апоптоза и межклеточного взаимодействия.
Одним из активно изучаемых свойств опухоли, оказывающим влияние на клиническое течение ПРЛ является пролиферативная активность (ПА).
Злокачественность опухоли во многом определяется скоростью ее роста. В связи с этим, определение пролиферативного пула является перспективным способом клинической оценки опухоли - определения вероятности наличия субклинической диссеминации, скорости метастазирования, ответа на терапию и прогноза. При выборе индивидуальной такики лечения уровень пролиферативной активности является одним из решающих факторов.
На современном этапе оптимальным маркером пролиферации считается КІ67, поскольку этот протеин постоянно присутствует во всех фазах митоти-ческого цикла и быстро исчезает при завершении клеточного деления. Период полураспада этого протеина, названного КІ67, составляет 60 - 90 мин., поэтому после выхода клетки из митотического цикла антиген не выявляется. Ген, кодирующий Ki-67, локализован на 10-й хромосоме в положении 10q25ter [19]. Антиген Ki-67 предположительно относится к регуляторным белкам, поскольку его появление совпадает с моментом вступления клетки в митотиче-ский цикл, а содержание меняется фазозависимо. Ki-67 начинает определяться в ядре с середины Gl-фазы. По мере прохождения последующих S- и Є2-фаз его количество постепенно нарастает и достигает пика в митозе. По окончании митотического цикла белок быстро катаболизируется и перестает выявляться. Физиологическая роль антигена Кі-67 в жизни клетки пока не ясна.
Использование различных методик обработки и иммуногистохимическо-го окрашивания материала выявило значительный разброс в значениях индекса КІ67, как в пределах одной опухоли, так и при сравнении различных опухолей, что свидетельствует о необходимости стандартизации выбора антител и условий подготовки материала и проведения ИГХ анализа.
Работы по изучению возможности клинического применения экспрессии КІ67 многочисленны. Так, уровень ПА в этом качестве исследовался как при РЛ, так и при других новообразованиях.
Использование различного порога разделения на «высокий» и «низкий» уровни экспрессии КІ67 затрудняют сравнение результатов, полученных разными исследовательскими группами. В качестве cut off point - порога разделения - используются медиана, среднее значение или другой совещательно установленный уровень. I. N. Soomro et al. [122] анализировали выживаемость больных РЛ при значении cut off point 5%. В работе С. Pfister et al. [125] порог разделения был принят в 10%, однако дополнительной прогностической информации о послеоперационном рецидиве рака мочевого пузыря получено не было. У A. Quintero et al. [100], напротив, ПА свыше 13% связана с большим размером опухоли, рецидивом, прогрессией и выживаемостью и накоплением р53. Cut off point КІ67, равный 20%, оказался оправдан при по-чечно-клеточном раке [179], опухолях головы и шеи [102, 115]; 25% - при НМРЛ [71], и РМЖ [135]; 40% - при опухолях головы и шеи [132].
Экспрессия иммуногистохимических маркеров (КІ67, топоизомераза На, р53 и Е-кадхерин) при плоскоклеточном раке легкого
Степень злокачественности опухоли во многом определяется скоростью ее роста. В.связи с этим определение пролиферативного пула является перспективным для клинической ценки опухоли - определения субклинического метастазирования, ответа на терапию и прогноза. Одним из активно изучаемых свойств опухоли, оказывающим влияние на выбор индивидуальной тактики лечения ПРЛ, является пролиферативная активность (ПА), характеризуемая несколькими различными маркерами. В нашем исследовании использованы КІ67 и топоизомераза Па.
ИГХ маркер пролиферирующих клеток КІ67, являющийся продуктом реакции с МКА клона NCL-Ki67-MM1, обнаруживается в ядрах опухолевых клеток. Распределение уровней экспрессии КІ67 в описываемой когорте не является нормальным, а подчиняется закону гамма-распределения (рис. 3.1). Антиген топоизомераза На, так же как и КІ67, располагается в ядре опухолевой клетки и экспрессируется в Gl, S, G2 и М-фазах клеточного цикла, он не выявляется в непролиферирующих клетках и может быть использован в качестве дополнительного маркера ПА. В последнее время этому вопросу посвящено много работ как у нас в стране, так и за рубежом, однако результаты, полученные в ходе проведенных исследований, зачастую противоречивы и пока не позволяют использовать их в клинической практике.
Как видно из табл. 3.1, уровень экспрессии топоизомеразы На практически совпадает с уровнем КІ67 - среднее значение на 4%, а медиана на 4,5% меньше, чем у КІ67. Характеристики изменчивости (minimum, maximum, стандартное отклонение) почти одинаковы. Распределение уровней экспрессии топоизомеразы На также не является нормальным, а подчиняется закону Вейбулла (рис.3.2).
В связи с "ненормальностью" законов распределения ИГХ маркеров, при дальнейшем анализе использованы методы непараметрической стастистики.
Маркер апоптоза р53 является основным геном, запускающим апоптоз в фазе G1 клеточного цикла; если репарация поврежденной ДНК невыполнима, он контролирует транскрипцию и функцию других генов. «Дикий» ген р53 является короткоживущим (несколько минут), а «мутантный» р53, синтезирующий белок р53, стабилен и определяется в опухоли при ИГХ исследовании, либо методом ПЦР-диагностики. При НМРЛ у 60-80% больных наблюдается экспрессия «мутантного» гена р53, с которым ряд авторов связывают неблагоприятный прогноз, что поддерживается далеко не всеми исследователями [145].
В нашем исследовании у 41 пациента (67,2%) отмечена положительная реакция, а у 20 (32,8%) реакция на онкоген р53 была негативной (далее в некоторых ситуациях обе группы больных проанализированы отдельно).
Особую проблему при анализе экспрессии р53 представляет учет так называемых р53-негативных опухолей (нами обозначаются, как р530), так как в литературе нет единого мнения об уровне разделения (cut off point), который разными исследователями принимается в пределах 0-25% [16].
В нашем исследовании «р53 негативными» считались анализы с полным отсутствием специфического окрашивания. Распределение уровней экспрессии р53 в общей выборке (с включением нулевых значений) полимодальное (рис. 3.3), не приближающееся ни к одному из законов распределения. Корреляционный анализ проведен нами без исключения «нулевых» значений, а под- группы больных с р53-негативными и р53-позитивными опухолями анализировались раздельно.
Феномен межклеточной адгезии формируется при участии нескольких белков, в числе которых супрессор инвазивности Е-кадхерин - адгезивная молекула, осуществляющая сцепление опухолевых клеток, - находится на поверхности мембран и в межклеточных пространствах. Потеря или редукция его экспрессии приводит к подавлению межклеточной адгезии, что освобождает клетки от прикрепления и позволяет им мигрировать, тем самым повышая метастатический потенциал опухоли. В изученной нами литературе для оценки ИГХ маркеров использовались абсолютные значения параметров (средние, медианы, дисперсии и т.п.). Показано, что ни один отдельно взятый ИГХ маркер не отражает злокачественный потенциал опухоли [4], однако вопросы корреляции и взаимодействия между ними освещены недостаточно. Исследование этих вопросов представляется необходимым для: 1)углубления фундаментальных знаний о биологии опухоли, 2) комплексной оценки используемых в клинической практике прогностических маркеров и 3) исключения малоинформативных или дублирующих анализов.
В общей выборке при анализе парных корреляций исследуемых ИГХ маркеров выявлены достоверные (р 0,01) связи экспрессии КІ67 с топоизо-меразой Па (R=0,71), с р53 (R=0,23) и Е-кадхерином (R=0,20). Аналогичная ассоциация высокого уровня КІ67 с накоплением р53 в опухоли описана J. М. Brown et al. [28]. Топоизомераза На, кроме КІ67, достоверно связана с экспрессией р53 (R=0,28, р 0,01). Оба маркера пролиферации сходно коррелируют с другими исследуемыми параметрами, что согласуется с данными литературы [135].
Экспрессия иммуногистохимических маркеров в зависимости от характеристик первичной опухоли и метастазирования в регионарные лимфатические узлы
Считается, что размер первичной опухоли является одним из важных прогностических критериев при раке легкого. В исследуемой выборке размер первичной опухоли колебался от 5до ПО мм. Гистограмма распределения представлена на рис. 4.1, наилучшим приближением к фактическим данным является логнормальное распределение с медианой порядка 33 мм, что близко к общепринятому порогу разделения 30 мм; в дальнейшем мы приняли разделение опухолей на подгруппы до 30 мм включительно и более 30 мм.
Статистический анализ показал отсутствие существенных различий в уровнях экспрессии ИГХ маркеров и достоверное их различие по сроку наблюдения (р 0,01). Данные литературы по этому вопросу неоднозначны.
Проведено сравнение коэффициентов корреляции ИГХ маркеров в подгруппах ПРЛ по размерам первичной опухоли — до и более 30 мм. Представленные в табл. 4.2 результаты анализа корреляций между экспрессией исследуемых маркеров и размерами опухоли, показывают наличие почти функциональной связи экспрессии КІ67 с топоизомеразой Па в обеих подгруппах (R=0,59 и R =0,73, р 0,01). Маркеры пролиферации КІ67 и топоизомераза Па в группе опухолей до 30 мм включительно достоверно коррелируют с экспрессией Е-кадхерина (р=0,04), а в группе опухолей более 30 мм - с р53 (р 0,01). Это, возможно, свидетельствует о различной роли Е-кадхерина на разных стадиях развития опухоли и об усилении влияния апоптоза при увеличении размеров опухоли. Имеющееся в литературе предположение о связи экспрессии р53 с опухолевой прогрессией подтверждается выявлением его гиперэкспрессии при III-IV стадиях процесса [35, 36, 124]. Отсутствие достоверных количественных изменений активности р53 позволяет предположить, что при прогрессии опухоли происходят качественные изменения. Таблица 4.2.
Таким образом, при изучении взаимосвязи ИГХ маркеров с размерами первичной опухоли получены следующие основные результаты: размер опухоли достоверно коррелирует только с наличием некроза в опухоли; существенных различий в уровнях экспрессии ИГХ маркеров при опухолях разного размера не обнаружено; связь экспрессии КІ67 с топоизомеразой Па почти функциональна и не зависит от размеров опухоли; маркеры пролиферации КІ67 и топоизомераза Па в подгруппе опухолей до 30мм достоверно коррелируют с экспрессией Е-кадхерина, а в подгруппе опухолей более 30мм - с экспрессией р53. Изменения экспрессии маркеров КІ67, топоизомеразы Па, р53 и Е-кадхерина в опухолях с различной степенью дифференцировки показаны на рис. 4.2.
Е-кадхерин 3,07 3,02 3,32 2,74 0.91 Приведенные в таблице данные показывают достоверное повышение экспрессии КІ67 в низкодифференцированном ПРЛ по сравнению с умерен-нодифференцированным (р=0,03), при этом высоко- и умереннодифференци-рованные опухоли по ПА не различались (р=0,61 для экспрессии КІ67 и 0,70 для топоизомеразы Па). Выявлены различия на грани достоверности в экспрессии топоизомеразы Па между умеренно- и низкодифференцированными (р=0,06) и высоко- и низкодифференцированными (р=0,06) опухолями. Размер опухоли не связан со степенью дифференцировки. Различия в экспрессии р53, как в парных так и во множественных сравнениях не достоверны.
Литературные данные [94, 149] свидетельствуют об обратной связи между пролиферативной активностью и степенью дифференцировки опухоли. Полученные нами результаты в целом укладываются в эту закономерность
Взаимосвязь топоизомеразы Па со степенью дифференцировки опухоли подтверждена во многих работах для различных карцином и ассоциирована с дедифференцировкой и потенциально агрессивным фенотипом [58, 173, 174, 176]. И в этом отношении полученные нами результаты согласуются с данными литературы.
Аналогичный анализ был проведен в подгруппах больных с метастазами и без метастазов в регионарные лимфатические узлы. Статистически достоверные различия не выявлены.
В связи с тем, что оценка экспрессии Е-кадхерина в баллах является полуколичественной и, в известной степени, субъективной, проведено условное разделение на подгруппы с «высокой» (4 и 6 баллов) и «низкой» (1 и 2 балла) экспрессией. В этих группах было проведено изучение экспрессии Е-кадхерина (табл. 4.4). Как видно из таблицы, опухоли G] и G2 , а также Gi и G3 достоверно различаются по количеству р53-негативных случаев, а в группах G2 и G3 сходны, т.е. в опухолях низкой степени злокачественности экспрессия мутантного р53 встречается реже, что согласуется с данными литературы [28, 32, 131]. Таблица 4.4
При сравнении отношения количества опухолей с высоким и низким уровнем экспрессии Е-кадхерина при различных степенях дифференцировки, обнаружено, что при G3 отмечается преобладание низкого уровня экспрессии Е-кадхерина. Полученные данные отражают известное в литературе мнение, о том, что степень дифференцировки опухоли коррелирует с уровнем экспрессии Е-кадхерина [76, 85, 168]. Однако в нашем исследовании в ПРЛ достоверное преобладание опухолей с высоким уровнем экспрессии Е-кадхерина наблюдается только в группе с промежуточной степенью злокачественности G2.
Проведено изучение уровня экспрессии ИГХ маркеров в зависимости от степени дифференцировки опухоли. Сравнение по критерию Краскела-Уоллиса достоверных различий экспрессии изучаемых ИГХ маркеров не выявило.
Представляют интерес не только средние величины экспрессии изучаемых маркеров, но и их взаимодействия между собой при различной степени дифференцировки, что изучено методом корреляционного анализа (табл. 4.5). Таблица 4.5 Корреляции изучаемых параметров при различных степенях дифференцировки опухоли
Как видно из таблицы, корреляция между уровнями экспрессии маркеров пролиферативной активности - КІ67 и топизомеразы На - является достоверно высокой независимо от степени дифференцировки опухоли.
Анализ парных корреляций показал, что в высокодифференцирован-ных опухолях (Gi) все изучаемые ИГХ параметры коррелированы с высоким уровнем достоверности (р 0,04). При снижении дифференцировки (группы G2 и G3) эти зависимости становятся недостоверными, за исключением корреляции экспрессии КІ67 и топоизомеразы Па, которая несколько ослабевает в умереннодифференцированных (R=0,57, р 0,01) и усиливается в низкодиффе-ренцированных опухолях (R=0,85, р 0,01). Корреляция экспрессии топоизомеразы Па и р53 в группе G2 - на грани достоверности (р=0,08).
Полученные данные позволяют предположить, что высоко-дифференцированные опухоли ПРЛ являются более высокоорганизованными системами. В низкодифференцированных же имеется очевидный дисбаланс между основными определяющими жизнедеятельность опухоли процессами - пролиферацией, апоптозом и межклеточной адгезией.
При изучении взаимосвязей ИГХ маркеров со степенью гистологической дифференцировки получены следующие результаты: экспрессия КІ67 в низкодифференцированном ПРЛ выше чем в уме-реннодифференцированном; различия между высоко- и низкодиф-ференцированными опухолями лищь приближаются к достоверным; высоко- и умереннодифференцированные опухоли не различаются по пролиферативной активности; аналогичные тенденции выявлена и в отношении экспрессии топоизомеразы Па. различия в экспрессии р53 несущественны ни при парных , ни при множественных сравнениях. в высокодифференцированных опухолях (Gj) все изучаемые ИГХ параметры взаимнокоррелированы с высоким уровнем достоверности; при снижении дифференцировки (группы G2 и G3) зависимости недостоверны, за исключением корреляции маркеров пролиферативной активности.
Результатом дисбаланса процессов пролиферации, клеточной гибели и неоангиогенеза является гипоксия, приводящая при определенных условиях к некрозу в опухолевой ткани. Некроз в опухоли обусловлен двумя основными причинами - ишемией (из-за отставания процессов неоангиогенеза от ПА) и сосудистым стазом (повышенное давление внутри опухоли в негерметичных сосудах при отсутствии внутренней лимфатической системы приводит к компрессии сосудов и, возможно, центральному некрозу). Клинические и экспериментальные данные позволяют предположить, что гипоксия способствует возникновению более агрессивного фенотипа. Однако остается неясным, является ли некроз в опухоли независимым прогностическим фактором.
Особенности экспрессии иммуногистохимических маркеров при центральной и периферической клинико- анатомических формах плоскоклеточного рака легкого
Исследованы взаимосвязи этих параметров внутри различных форм ПРЛ (табл. 5.2, рис. 5.1). При обеих формах ПРЛ имеются взаимосвязи КІ67 и р53 с топоизомеразой Па. Кроме этого, при ЦПРЛ взаимосвязаны уровни экспрессии КІ67, топоизомеразы Па, р53 и Е-кадхерина, в то время как при ППРЛ наблюдается только корреляции КІ67 и топоизомеразы На с экспрессией р53; т.е. экспрессия Е-кадхерина при ППРЛ не связана ни с одним из изучаемых маркеров, тогда, как при ЦПРЛ и при повышении ПА, и при гиперэкспрессии р53 усиливается межклеточная адгезия. Коэффициенты корреляции достоверно различаются только для связей КІ67, топоизомеразы На и р53 с Е-кадхерином, что может свидетельствовать о наличии некоторых биологических различий между ЦПРЛ и ППРЛ.
Результаты показывают, что при ППРЛ экспрессия КІ67 достоверно связана с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы (р=0,03), а при ЦПРЛ такая связь отсутствует (р=0,62), т.е. в ППРЛ более высокая ПА свойственна метастазирующим опухолям, а в ЦПРЛ уровень ПА с регионарным мета-стазированием не связан (рис.5.2). Гиперкспрессия р53, наоборот, не связана с поражением внутригрудных лимфатических узлов в ППРЛ (р=0,41) и связана в ЦПРЛ (р=0,04).
Одним из параметров, влияющих на прогноз при злокачественных новообразованиях, является размер первичной опухоли. Это в полной мере относится лишь к ППРЛ, поскольку в основе стадирования ЦПРЛ лежит анатомический принцип, ориентированный на возможность проведения оперативного лечения и символ Т определяется не объемом опухолевой массы, а ее взаимоотношением с окружающими структурами. Нами при дальнейшем анализе использовался размер опухоли без учета значения символа Т.
В опухолях разного размера ( 30 мм и 30мм) различие в экспрессии КІ67 в ППРЛ отсутствует (р=0,37), а в ЦПРЛ в опухолях размером 30 мм ПА выше (р=О,03). Экспрессия топоизомеразы Па сходна в обеих формах.
В распадающихся и нераспадающихся опухолях различия в экспрессии топоизомеразы Па отсутствуют при ППРЛ (р=0,40-0,57) и сомнительны при ЦПРЛ (р=0,86 по критерию Манна - Уитни и р=0,03 по критерию Вальда-Вольфовица). В ППРЛ, по мере увеличения экспрессии Е-кадхерина, вероятность развития некроза возрастает (рис.5.3 - р=0,03). Boxplot bv Group Variable E cad
ЦПРЛ 50 25 50 25 т 1Достоверность, р: по критерию % 0.01, по F- критерию Фишера 0,01 Данные таблицы показывают, что различие уровней экспрессии р53 в некоторой степени обусловлено процентным соотношением р53-негативных значений в обеих формах ПРЛ - при ППРЛ их 20 %, а при ЦПРЛ - 50% (рис.6.5). Известно [16], что при определении экспрессии р53 иммуногисто-химическим методом отсутствие специфической окраски возможно в двух случаях: 1) «дикий» тип р53, с сохраненной активностью в опухоли и 2) мутантний ген р53 с «нулевым» фенотипом без транскрипции белка р53 -ложноотрицательные случаи. По мнению Е.А. Коган, случаи с отсутствием синтеза какого либо белка р53 составляют примерно 20 % негативных по р53 случаев, а в целом инактивация р53 при РЛ достигает 70% случаев.
Проведено сравнение коэффициентов корреляции экспрессии изучаемых ИГХ маркеров между собой при ППРЛ и ЦПРЛ (в подгруппах N0 и N+) в зависимости от наличия или отсутствия поражения регионарных лимфатических узлов (табл. 5.5).
Слабая связь обоих маркеров ПА с экспрессией р53 достоверна только в неметастатическом ППРЛ, где гиперэкспрессия р53 связана с усилением пролиферации (R=0,29). Наличие слабой связи экспрессии маркеров ПА и р53 только при ППРЛ в данном случае можно, хотя бы частично, объяснить большей долей опухолей с мутантным р53 (см. рис. 5.5). При поражении лимфатических узлов взаимодействие отсутствует в обоих формах ПРЛ.
Корреляция маркеров ПА с экспрессией Е-кадхерина отсутствует в ППРЛ, в ЦПРЛ же она достоверная положительная средней силы (R=0.41-0,59, р=0,01-0,02), т.е., по мере роста ПА опухоли степень межклеточной адгезии повышается. Корреляция между высоким уровнем экспрессии Е-кадхерина и гиперэкспрессией р53 ( R =0,53, р 0,01) существует только в метастатическом ЦПРЛ.
Наблюдаемая в опухолях ЦПРЛ размером до 30 мм связь КІ67 с экспрессией Е-кадхерина, исчезает в опухолях большего размера, но при этом появляется сильная связь экспрессии р53 и Е-кадхерина и средней силы связь экспрессии р53 и КІ67. Таким образом, полученные результаты показывают, что в ходе опухолевой прогрессии ЦПРЛ влияние процессов пролиферации на межклеточную адгезию ослабевает, и усиливается влияние апоптоза. Представленные данные показывают также разнонаправленный характер изменения взаимодействия маркеров пролиферации и апоптоза по мере роста опухоли: в ППРЛ корреляция ослабевает, тогда, как в ЦПРЛ - усиливается. Это свидетельствует о различных биологических особенностях клинико- анатомических форм ПРЛ.
Проведенный анализ позволил выявить следующие закономерности: ЦПРЛ и ППРЛ достоверно различаются только по уровню экспрессии р53; уровень экспрессии Е-кадхерина при ППРЛ не коррелирует ни с маркерами ПА (КІ67 и топоизомераза Па), ни с экспрессией р53, тогда, как при ЦПРЛ степень межклеточной адгезии достоверно связана и с уровнем пролиферации и с гиперэкспрессией р53; коэффициенты корреляции связей КІ67, топоизомеразы Па и р53 с Е-кадхерином достоверно различаются, что может свидетельствовать о различной роли Е-кадхерина в ППРЛ и ЦПРЛ; в ППРЛ пролиферативная активность связана с регионарным метаста-зированием, в отличие от ЦПРЛ где данная зависимость не прослеживается; гиперэкспрессия р53не связана с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы в ППРЛ и связана в ЦПРЛ, это позволяет предположить, что на реализацию метастатического потенциала при ППРЛ влияет пролиферативная активность, а при ЦПРЛ - мутации гена супрессора р53. экспрессия КІ67 не различается в опухолях разного размера в ППРЛ и достоверно различается в ЦПРЛ; в обеих формах ПРЛ некроз в опухоли встречается примерно с одинаковой частотой, но в ППРЛ, по мере увеличения экспрессии Е-кадхерина, вероятность возникновения некроза возрастает; высокодифференцированные опухоли ППРЛ и ЦПРЛ различаются по экспрессии р53, что свидетельствует о различной роли апоптоза в этих подгруппах; разное влияние экспрессии р53 обусловлено различием доли нулевых значений в разных формах ПРЛ - 20% при ППРЛ vs. 50% при ЦПРЛ; в неметастатическом ППРЛ гиперэкспрессия р53 связана с усилением пролиферации (R=0,29), а при поражении лимфатических узлов указанное взаимодействие отсутствует в обоих формах ПРЛ; в ЦПРЛ по мере увеличения количества пролиферирующих опухолевых клеток степень межклеточной адгезии повышается, в ППРЛ же эта зависимость отсутствует; только в метастатическом ЦПРЛ выявлена корреляция между высоким уровнем экспрессии Е-кадхерина и гиперэкспрессией р53 (R=0,53, р 0,01); расчеты в подгруппах без метастазов в лимфатические узлы при различных размерах опухоли ( 30мм и 30 мм) показали ряд различий между ППРЛ и ЦПРЛ; взаимосвязь экспрессии маркеров КІ67 и р53 наблюдается при ППРЛ в опухолях размером до 30 мм, а при ЦПРЛ - более 30 мм; наблюдаемая в опухолях ЦПРЛ до 30 мм связь КІ67 с экспрессией Е-кадхерина исчезает в опухолях более 30 мм, при этом появляются сильная связь экспрессии р53 и Е-кадхерина и средней силы связь экспрессии р53 и КІ67. Таким образом, изучение закономерностей экспрессии ИГХ маркеров при ПРЛ позволило вывить различный характер взаимодействия между кли-нико-морфологическими и ИГХ маркерами в ППРЛ и ЦПРЛ. При ППРЛ экспрессия Е-кадхерина не связана с уровнями экспрессии маркеров пролиферации (КІ67 и топоизомераза Па) и мутации р53, тогда, как при ЦПРЛ достоверны связи всех четырех маркеров, что может свидетельствовать о различной роли Е-кадхерина в разных формах ПРЛ. Основные клинико-анатомические формы ПРЛ достоверно различаются по уровню экспрессии р53, в том числе и за счет доли нулевых значений в разных формах — 20% при ППРЛ vs. 50% при ЦПРЛ. Уровень экспрессии маркеров ПА в ППРЛ связан с регионарным метастазированием, в отличие от ЦПРЛ где данная зависимость не прослеживается; гиперэкспрессия р53, наоборот, не связана с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы в ППРЛ и связана в ЦПРЛ. Результаты расчетов позволяют высказать обоснованное предположение о том, что реализацию метастатического потенциала в ППРЛ определяет уровень ПА, а в ЦПРЛ - экспрессия р53. В ходе опухолевой прогрессии ЦПРЛ влияние процессов пролиферации на межклеточную адгезию ослабевает, а влияние апоптоза усиливается. Неодинаков и характер взаимодействия маркеров пролиферации и апоптоза при основных клинико-анатомических формах ПРЛ: по мере роста опухоли ППРЛ корреляция ослабевает, в ЦПРЛ же она усиливается. Представленные данные дают определенные основания рассматривать ЦПРЛ и ППРЛ, как опухолевые процессы, различающиеся на молекулярно-биологическом уровне.
