Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Внеклеточные протеолитические системы и компоненты внеклеточного матрикса в опухолях человека. Клиническая значимость и перспективы использования при раке толстой кишки 20
1.1. Внеклеточный матрикс и матрикс-деградирующие ферменты в опухолях человека 20
1.1.1. Роль металлопротеиназной системы в опухолевой прогрессии: ММР и TIMP при раке толстой кишки 22
1.1.2. Роль плазминогенной системы в опухолевой прогрессии: иРА, tPA и PAI-I при раке толстой кишки 29
1.2. Влияние активности внеклеточных протеолитических ферментов и их ингибиторов на процессы ангиогенеза и апоптоза в опухолях больных раком толстой кишки 30
1.2.1. Взаимосвязь белков семейства VEGF и маркеров протеолиза при прогрессии опухоли 31
1.2.2. Взаимосвязь системы Fas/FasL, маркеров ангиогенеза и протеолиза при прогрессии опухоли 37
1.3. Внеклеточные протеолитические системы и метастатическая активность рака толстой кишки 41
1.4. Компоненты базальных мембран при раке толстой кишки и их структурные нарушения под действием протеолитических ферментов 44
1.5. Прогностическая и предсказательная значимость содержания ферментов внеклеточного матрикса и компонентов базальных мембран в раке толстой кишки 48
Глава II. Материалы и методы исследования 55
2.1. Характеристика больных раком толстой кишки 55
2.2. Методы определения иммуногистохимических маркеров 62
2.3. Методы определения биохимических маркеров 64
2.4. Статистический анализ результатов исследования 67
Глава III. Иммуногистохимические и биохимические маркеры в опухоли и сыворотке крови больных раком толстой кишки (результаты собственных исследований) 69
3.1. Содержание ММР-9 в опухоли больных раком толстой кишки.. 69
3.2. Содержание коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки 72
3.3. Содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки 74
3.4. Содержание sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки 82
Глава IV. Связь содержания компонентов системы активации плазминогена в опухолях больных раком толстой кишки с экспрессией иммуногистохимических и биохимических маркеров 90
4.1. Содержание uPA, tPA и PAI-1 в ткани опухоли и неизмененной слизистой оболочке толстой кишки 90
4.2. Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом клинико-морфологических признаков заболевания 92
4.3. Связь содержания компонентов системы активации плазминогена с экспрессией ММР-9 и коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки 99
4.4. Связь содержания компонентов системы активации плазминогена в опухоли уровнями белков VEGF и sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки 100
Глава 5. Связь отдаленных результатов лечения с содержанием иммуногистохимических и биохимических маркеров в опухоли и сыворотке крови больных раком толстой кишки 102
Глава 6. Тканевые и сывороточные биохимические и иммуногистохимические маркеры у больных раком толстой кишки и риск развития метастазов в печени 115
Обсуждение результатов исследования 127
Выводы 143
Практические рекомендации 146
Литература 147
- Влияние активности внеклеточных протеолитических ферментов и их ингибиторов на процессы ангиогенеза и апоптоза в опухолях больных раком толстой кишки
- Статистический анализ результатов исследования
- Содержание коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки
- Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом клинико-морфологических признаков заболевания
Введение к работе
В последние годы в большинстве стран мира, в том числе и в нашей стране, наблюдается рост заболеваемости колоректальным раком (Н.Н.Трапезников и соавт., 2001; В.В.Маршак, 2004; Г.И.Воробьев и соавт., 2005; Hawk Е.Т. et al., 2002; Levin В. et al., 2005). Ежегодно в мире регистрируется около 1 млн. новых случаев рака прямой и ободочной кишки (3-й по частоте показатель заболеваемости среди онкологических болезней), а умирает почти 500 тыс. человек (4-е место по показателю смертности) (Engstrom P.F., 2000; Parkin D.M. et al., 1999; В.В.Мартынюк, 2004; Н.Н.Симонов и соавт., 2000,2004; Н.Н.Трапезников и соавт., 2000).
По прогнозу ожидается, что в XXI веке в России рак данной локализации займет первое место в структуре онкологической заболеваемости (Н.Н.Симонов и соавт., 2000; В.И.Чиссов и соавт., 2000; Н.А. Яицкий и соавт., 2004; М.И.Давыдов и соавт., 2004). В России ежегодно колоректальным раком заболевают 50 тыс. человек (3-е место у мужчин после рака легких и желудка и 2-е место у женщин после рака молочной железы) при ежегодной смертности, равной 35 тыс. В ' Москве колоректальный рак вышел на 1-е место среди причин смерти от онкологических заболеваний. При этом в России рак ободочной кишки выявляется в 1,2 раза чаще, чем прямой (Н.Н.Трапезников и соавт., 2001). Соотношение рака ободочной кишки к' раку прямой кишки в развитых странах составляет примерно 2:1 (Ю.М.Тимофеев, 2004). Колоректальный рак в экономически развитых странах занимает 3-е место по частоте заболеваемости и второе место среди причин смерти у онкологических больных.
Отдаленные результаты лечения больных колоректальным раком напрямую зависят от ряда факторов, включающих стадию заболевания, степень дифференцировки опухоли, ее метастатический потенциал, а также от квалификации врача и на сегодняшний день их нельзя считать
7 удовлетворительными, так как показатели 5-летней выживаемости после радикальных операций по поводу колоректального рака не превышают 50-60% (В.И. Кныш и соавт., 1994; Nordlinder В. et al., 1994; Ю.А. Барсуков и соавт., 2006). Так, например, общая 5-летняя выживаемость в Европе составляет 40%, а среди больных с запущенной формой заболевания — не превышает 5%. Все это можно объяснить тем, что только у 20,5% больных раком ободочной кишки и у 31,1% — прямой кишки при первом обращении выявляют I-II стадии заболевания (Н.А.Яицкий и соавт., 2004; Г.И.Воробьев и соавт., 2005). У остальных выявляются III-IV стадии (Fujita S. et al., 2000; Verwaal VJ. et al., 2005). В России около 70% больных имеют III—IV стадию заболевания на этапе первичной диагностики (М.И.Давыдов и соавт., 2002; В.В.Пророков и соавт., 2004). При этом около 25% больных уже имеют метастазы в момент установления первичного диагноза рака толстой кишки (Н.И.Переводчикова, 2004; Ю.И.Патютко и соавт., 2006). Следовательно, приходится констатировать, что эти факторы не обеспечивают пока необходимого уровня ранней диагностики и должных результатов лечения (А.М.Ганичкин, 1975; Б.А.Бердов и соавт., 1986; В.Ф.Левшин и соавт., 1990; В.Л.Ривкин и соавт., 2001; Ragazzi R. et al., 2001).
Метастазы являются основным фактором, отягощающим прогноз колоректального рака. Несмотря на быстрое развитие методов диагностики, хирургического и комбинированного лечения заболевания, процент метастазов и рецидивов колоректального рака остается высоким (Н.Н.Трапезников и соавт., 2001; Е.Н.Имянитов, 2005). По данным отечественных и зарубежных авторов к моменту постановки диагноза около 25% больных уже имеют метастазы, а примерно у 50% метастазы разовьются в дальнейшем (М.И.Давыдов и соавт., 2005; Ю.А.Барсуков и соавт., 2006; Greenlee R.T. et al., 2000; Engstrom P.F., 2000). Метастазы в печени выявляются у 55%о больных, подвергшихся радикальному удалению первичной опухоли (Ю.И.Патютко и соавт., 2001). В этой связи, поиск дополнительных критериев, позволяющих оценить вероятность развития
8 метастазов и выделить группу больных с повышенным риском их развития, остается актуальной задачей (К.П.Хансон, 2005).
В настоящее время проводится активный поиск дополнительных маркеров, которые предсказывают высокий риск опухолевой прогрессии (А.С.Белохвостов и соавт., 2003; А.А.Иванов и соавт., 2005; В.И.Киселев и соавт., 2005; Gershtein E.S. et al., 2008; Suwa Т. et al., 2008). Для улучшения отдаленных результатов лечения необходима разработка дополнительных методов оценки метастатического потенциала раковых клеток и выявление среди больных раком толстой кишки групп риска, требующих адъювантной терапии после радикального хирургического вмешательства (А.П.Колесник и соавт., 2006). Правильная оценка биологических факторов, коррелирующих с прогнозом заболевания и продолжительностью жизни пациентов, важна не только при локализованных формах колоректального рака, но и после выявления отдаленных метастазов опухоли (Aldrighetti L. et al., 2005; Ambiru S.etal., 1999).
В настоящее время бурно развивается направление молекулярной диагностики и оценки прогноза злокачественных опухолей, а исследование особенностей биологического поведения опухоли является сегодня одной из наиболее актуальных областей онкологии (К.М.Пожарисский и соавт., 2000, 2004; В.В.Делекторская и соавт., 2003; А.А.Новик и соавт., 2004; Г.А.Франк и соавт., 2005; Von Kleist S., 2008). Эти методы делают диагностику колоректального рака более ранней и точной, и, что самое главное, позволяют назначить дифференцированное лечение (В.А.Исаков и соавт., 2002; Baldus S.E., 2003; Bendardaf R. et al., 2004; Ahmed F.E., 2005). Интенсивно разрабатываются и внедряются в клиническую практику дополнительные биохимические, иммуногистохимические и молекулярно-биологические методы исследования, которые характеризуют степень агрессивности опухолевого процесса и, кроме того, позволяют индивидуализировать прогноз клинического течения и чувствительность опухоли к проводимой терапии (О.В.Голубченко, 2003; А.Б.Моисеенко, 2003;
9 А.А.Новик и соавт., 2004; К.М.Пожарисский и соавт., 2004; Spano J.P. et al., 2005; Issa J.-P., 2008). Вместе с тем остается окончательно не решенной проблема прогнозирования течения заболевания у больных колоректальным раком после радикального лечения.
Основой для выделения клинически значимых молекулярных факторов послужило открытие наблюдаемых в процессе развития и прогрессии опухоли структурных и функциональных изменений онкогенов и генов-супрессоров (Б.П.Копнин, 2000; Vogelstein В. et al.,1988; Pasche В. et al., 2003). Особенности экспрессии кодируемых этими генами белков могут выявляться с помощью биохимического иммуноферментного определения данных показателей в сыворотке крови и в ткани опухоли больных колоректальным раком (Kahlenberg M.S. et al., 2003; Davies R.J. et al., 2005). Кроме того, расширяются возможности иммуногистохимического выявления в клетках колоректального рака и в структурах внеклеточного матрикса особенностей экспрессии молекулярных маркеров, отражающих специфику биологической активности опухоли (В.В.Делекторская и соавт., 2008; Ahmed F.E. et al., 2007; Muller W. et al., 1998; Sarris M., Lee C.S., 2001).
На сегодняшний день, несмотря на многообразие клинических и молекулярных маркеров, свидетельствующих о прогрессировании опухолевого процесса, представляется целесообразным дальнейшее изучение клинической значимости существующих и поиск новых маркеров, имеющих прогностическое значение при колоректальном раке (Р.И.Якубовская, 2000; Н.А.Корсакова и соавт., 2003; Yamada Н. et al., 2001; Д.В.Залетаев и соавт., 2004; Ф.Л.Киселев, 2005).
В этом плане актуальным является изучение процессов перестройки внеклеточного матрикса в опухоли, которое осуществляется факторами роста и системой протеаз (Forte A. et al., 2002; Neal СР. et al., 2006; Gershtein E.S. et al., 2008). Среди опухолеассоциированных протеолитических ферментов ведущую роль играет система активаторов плазминогена, представленная двумя протеазами - тканевым и урокиназным активаторами плазминогена
10 (uPA и tPA), а также металлопротеиназная система, состоящая из 25 представителей (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2008; Berney C.R. et al., 1998,1999). Ключевую роль в семействе металлопротеиназ играют ММР-2 и ММР-9, функция которых связана с гидролизом коллагена базальных мембран (Е.С.Герштейн и соавт., 2008; Brabletz Т. et al., 2000; Boedefeld W.M. et al., 2003; Chen J.Q. et al., 2004; Duan G.J. et al., 2004). uPA и tPA превращают неактивный зимоген плазминоген в плазмин, расщепляющий фибрин и белки внеклеточного матрикса, а также активирующий ММР-2 и ММР-9. Эти процессы способствуют разрушению базальных мембран и облегчают инвазию опухолевых клеток. Следует отметить, что все указанные протеазы расщепляют компоненты внеклеточного матрикса, но при этом важную роль в опухолевой прогрессии играют и их эндогенные ингибиторы (TIMP и PAI), причем отдельные из них могут способствовать протеолитическому действию ферментов (М.А.Пальцев и соавт., 2003; Gershtein Е. et al., 2007). ММР, сериновые протеазы (uPA, tPA) не только облегчают опухолевый рост, раковую инвазию и метастазирование, но и могут являться мишенью для противоопухолевой терапии и лечения метастазов (Е.С.Герштейн и соавт., 2007; Mysliwill A.G., Ornstein D.L., 2002; Waas Е.Т. et al., 2002; Gontero P. et al., 2004; Rosen L.S., 2005; Wadler S. et al., 2007).
Основные белки базальных мембран (коллаген IV типа и ламинин) являются не только структурным барьером для метастатического распространения раковых клеток, но и важной функциональной единицей, участвующей в опухолевой прогрессии (Galbavy S. et al., 2002).
Процесс опухолевой прогрессии требует взаимодействия многочисленных молекулярных факторов, при этом деградирующие матрикс протеиназы не только ремоделируют архитектуру внеклеточного матрикса, но и воздействуют на различные пути передачи сигнала в клетке, усиливают ангиогенез и способствует уклонению от программы апоптоза в опухоли
(М.А.Пальцев и соавт., 2003; В.И.Киселев и соавт., 2005; Г.И.Абелев и соавт., 2008; Mignatti P. et al., 1996).
Так, известно, что ключевым проангиогенным фактором является VEGF — гликопротеин, стимулирующий пролиферацию эндотелиальных клеток. Этот фактор усиленно продуцируется клетками ряда новообразований, способствуя неоваскуляризации опухоли, усилению проницаемости сосудов, и активации лимфогенного метастазирования (С.В.Луценко и соавт., 2004; М. А.Пальцев, 2004; Не Y. et al., 2005; Gershtein Е. S. et al., 2006; Shin J. E. et al., 2007).
Апоптоз или его отдельные элементы выполняют важные физиологические функции, при этом преодоление апоптоза является необходимым условием успешного развития опухоли (А.Ю.Барышников и соавт., 1996, 2002; А.А.Фильченков, 1998,2003; Н.Н.Белушкина, 2003, 2004; С.Г.Аббасова и соавт., 2007; Е.Ф.Лушников и соавт., 2001; Grell V. et al., 1994). Один из механизмов, регулирующих эти процессы в опухоли, связан с активностью апоптоз-специфических белков системы Fas/FasL (Н.Н.Белушкина и соавт., 2004; Bennett M.W. et al., 2001; O'Connell J. et al. 2000; Zhu Q. et al., 2005; Song E. et al., 2001).
Относительно недавно получены первые клинические исследования по неоангиогенезу и Fas-зависимому апоптозу при солидных опухолях, в том числе и колоректальном раке (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2001; С.Г.Аббасова и соавт., 2007). Показано, что повышенный уровень продукции ключевого активатора ангиогенеза - VEGF (С.В.Луценко и соавт., 2004; Е.В.Черноглазова, -2004; Folkman J., 1992) и ингибитора апоптоза -растворимого Fas-антигена (sFas) у больных некоторыми злокачественными новообразованиями может свидетельствовать о высоком «метастатическом потенциале» опухоли, что является неблагоприятным прогностическим фактором (В.С.Новиков, 1996; С.Р.Уманский, 1996; А.А.Фильченков и соавт., 1999; С.М.Киселев и соавт., 2005). Однако эти данные основаны пока на незначительном числе наблюдений. Кроме того, не изучали одновременно
12 факторы ангиогенеза и апоптоза с использованием малоинвазивных биохимических методов исследования в сыворотке крови, что также затрудняет обсуждение представленных в литературе результатов.
Таким образом, к формированию метастатического фенотипа клеток рака толстой кишки приводит изменение активности таких молекулярных факторов как ММР (ММР-2 и ММР-9), ключевых компонентов системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1), основных компонентов базальных мембран (коллаген IV типа, ламинин), проангиогенных факторов (VEGF), маркеров апоптоза (sFas).
Влияние молекулярных факторов при раке толстой кишки на клиническое течение и прогноз заболевания изучено недостаточно, несмотря на то, что накапливается все больше данных о нарушениях их нормальной экспрессии и функционирования. Многие вопросы, касающиеся корреляции клинико-морфологических характеристик опухоли и изменений биологических показателей, происходящих в процессе прогрессирования рака толстой кишки, нуждаются в уточнении. Этим- определяется актуальность изучения молекулярных критериев, прогнозирующих агрессивность течения колоректального рака.
Цель работы.
Изучение особенностей экспрессии молекулярно-биологических маркеров внеклеточного матрикса, ангиогенеза, апоптоза в опухоли, сыворотке крови больных раком толстой кишки и роли комплекса этих факторов в оценке прогноза заболевания.
Задачи исследования.
1. Изучить биохимические и иммуногистохимические особенности экспрессии ММР-9 в первичных опухолях больных раком толстой кишки и в прилежащей к опухоли непораженной слизистой оболочке.
2. Исследовать особенности экспрессии структурных компонентов
базальных мембран (коллагена IV типа) в злокачественных опухолях
толстой кишки.
3. Провести сравнительный анализ особенностей экспрессии ферментов
внеклеточного матрикса и компонентов базальных мембран и выявить их
взаимосвязь с основными клиническими\ и морфологическими параметрами
заболевания.
4. Провести иммуноферментное определение молекулярно-
биологических маркеров неоангиогенеза (VEGF) и апоптоза (sFas) в
сыворотке крови больных раком толстой: кишки и изучить корреляцию
биохимических показателей с основными клинико-морфологическими
параметрами заболевания.
Провести»; иммуноферментное определение- содержания компонентов системы активации; плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) в* опухоли больных колоректальнымраком и изучить корреляцию биохимических показателей с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания.
Определить прогностическую значимость биохимических и иммуногистохимических особенностей экспрессии белковых маркеров у. больных раком толстой кишки.
. 1. Провести; статистическую обработку данных и на основании многофакторного анализа результатов исследования выделить значимые и независимые прогностические показатели призраке толстой*кишки:
Научная новизна;
Проведен комплексный- клинический;. морфологический и биохимический анализ современных молекулярно-биологйческих маркеров у больных раком толстой кишки, таких как протелитические ферменты и компоненты внеклеточного матрикса, факторы неоангиогенеза и апоптоза.
14 Обнаружена повышенная экспрессия ММР-9 в ткани опухоли больных раком толстой кишки у 48,7% пациентов. При этом частота выявления высокой экспрессии белка достоверно повышалась до 80% у больных при IVb стадии, при низкой степени дифференцировки опухоли (80%) и при наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах (82,4%).
У 57,2% больных раком толстой кишки выявлена низкая экспрессия коллагена IV типа в опухоли, причем частота выявления низкой экспрессии белка достоверно повышалась у пациентов в IVb стадии (85%), при низкой степени дифференцировки опухоли (76%), при выраженной глубине инвазии в стенку кишки (75%>), а также при наличии инвазии клеток рака в кровеносные сосуды (86,3%).
Обнаружено, что уровень ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки был достоверно выше по сравнению с контролем. Причем, достоверно более высокое содержание VEGF выявлено в сыворотке крови больных при IV стадии колоректального рака, тогда как концентрация VEGF у больных раком толстой кишки при I и Иа стадиях опухоли не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей. Содержание маркера достоверно повышалось при увеличении глубины инвазии опухоли и при наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах.
Содержание VEGF при низкой степени дифференцировки колоректального рака было достоверно выше, чем при высокой. Одновременно с увеличением концентрации VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и низкая экспрессия коллагена IV типа.
Впервые обнаружено, что sFas выявлялся в 2 раза чаще (57,8%) у больных колоректальным раком по сравнению с контролем, а его содержание
15 в группе практически здоровых людей было ниже, чем у больных. При этом уровни sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки зависели от стадии заболевания, хотя при I стадии не отличались от содержания маркера у практически здоровых людей. Достоверно выше было содержание sFas при значительной глубине инвазии, при наличии инвазии в кровеносные сосуды, при неблагоприятных уровнях экспрессии белков ММР-9 и коллагена IV типа.
Обнаружено, что содержание uPA и tPA в ткани опухоли больных раком толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой. При этом уровни uPA и tPA в ткани первичной опухоли зависели от ряда клинико-морфологических характеристик опухоли.
Полученные данные свидетельствуют о том, что новый подход к прогнозированию клинического течения колоректального рака основан на использовании комплексного определения согласованных изменений экспрессии изученных молекулярно-биологических маркеров в опухоли и сыворотке крови больных для определения влияния данных показателей на инвазивный потенциал опухоли, ее метастатический потенциал и выживаемость пациентов. На основании исследования молекулярных характеристик колоректального рака разработаны критерии, позволяющие идентифицировать случаи с повышенным риском развития отдаленных метастазов.
Впервые при раке толстой кишки изучена корреляция между экспрессией белков базальных мембран, факторов неоангиогенез, апоптоза, активностью матриксных металлопротеиназ и компонентов системы активации плазминогена. Изучение особенностей экспрессии белковых маркеров в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком позволило уточнить некоторые патогенетические механизмы прогрессирования опухоли.
Практическая значимость.
На основе анализа некоторых молекулярно-биологических характеристик опухоли определены критерии для выявления наиболее прогностически неблагоприятных случаев и предрасположенности больных колоректальным раком к развитию метастазов. Так, показатели общей выживаемости больных колоректальным раком при высоком уровне экспрессии ММР-9 в первичной опухоли в 3 раза достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка, а 5-летняя безрецидивная выживаемость пациентов ниже в 1,5 раза. Показатели общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки зависели от уровня исходной концентрации ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови и при высоких его значениях (от 800 пг/мл и более), они были достоверно ниже, чем при значении VEGF менее 400 пг/мл. При этом, высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли больных колоректальным раком был связан с повышенными исходными уровнями VEGF в сыворотке крови. Общая 5-летняя выживаемость больных колоректальным раком при уровнях sFas в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была достоверно ниже. Кроме того, обнаружено, что безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки достоверно различалась между больными по пороговому уровню 3 нг/мг белка для иРА, 2 нг/мг белка для tPA и 2 нг/мг белка для PAI-1. Многофакторный анализ выявил наиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценке общего прогноза рака толстой кишки: ММР-9-коллаген ГУ типа, MMP-9-uPA, MMP-9-PAI-1, коллаген IV типа-РА1-1 и при прогнозе отдаленных метастазов MMP-9-sFas.
Таким образом, настоящее исследование представляет практический интерес для оценки послеоперационного прогноза больных раком толстой кишки и выделения групп повышенного риска развития метастазов и
17 рецидивов, требующих дополнительного лечения или более тщательного динамического наблюдения.
Апробация работы.
Основные положения работы были доложены и обсуждены на: Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологии» (Барнаул, 7-8 июня 2005г.); VI Всероссийском съезде онкологов (Ростов-на-Дону, 9-14 октября 2005г.); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.); на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.); Международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1 -2 июня 2006г.); Российской научно-практической конференции с международным участием: «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (Барнаул, 4-5 июля 2006г.); IV съезде онкологов и радиологов СНГ (Баку, 28 сентября - 1 октября 2006г.); X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 21-23 ноября 2006г.); XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.); XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008г.).
Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции с участием сотрудников кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Московского государственного медико-стоматологического университета, лаборатории клинической биохимии, хирургического отделения проктологии, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН 12 июня 2008г.
18 Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе в изданиях, рекомендуемых ВАК, - 7 печатных работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 173 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов w практических рекомендаций. Текст иллюстрирован 58 таблицами и 23 рисунками. Указатель литературы содержит 74 работы отечественных авторов и 186 — зарубежных.
Положения, выносимые на защиту:
1! Наиболее- высокие уровни> экспрессии ММР-9' выявлены в опухоли у преобладающего ^ большинства больных раком толстой* кишюг при поздних стадиях заболевания; при низкой- степени' дифференцировки-опухоли, а также при наличии,инвазии карциномы в кровеносных сосудах. При этом, общая 5-летняя выживаемость больных раком-толстой'кишки при высоком уровне экспрессии ММР-9 достоверно ниже, чемшри низкой экспрессии белка.
Низкий-уровень экспрессии коллагена IV типа достоверно чаще выявляли в опухолях у больных колоректальным раком, при распространенном; процессе, при низкой степени* дифференцировки опухоли- прш выраженной глубине инвазии опухоли- в« стенку кишки, а также при наличии инвазии опухоли і в кровеносных сосудах. Показатели? общей 5-летней выживаемости больных с низкой экспрессией, коллагена' IV типа* в опухоли были достоверно ниже, чем при высокой*экспрессии;маркера.
Исходная концентрация'ключевого активатора неоангиогенеза'УІЮР в^
19 сыворотке крови больных раком толстой кишки была достоверно выше по сравнению с практически здоровыми людьми. При этом, уровень маркера достоверно повышался в сыворотке крови больных с увеличением глубины инвазии опухоли в стенку кишки, при прорастании опухоли в кровеносные сосуды, при низкой степени дифференцировки опухоли.
Самые низкие показатели общей 5-летней выживаемости отмечены среди больных раком толстой кишки с высокими уровнями VEGF (от 800 пг/мл и более). При этом высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли был связан с повышенными исходными показателями VEGF в сыворотке крови, тогда как при низких исходных значениях VEGF чаще выявляли высокую экспрессию коллагена IV типа'в первичной опухоли.
Почти в 2 раза чаще sFas выявляли в сыворотке крови больных колоректальным раком, а его уровни были достоверно выше по сравнению с практически здоровыми людьми; при этом, общая 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки при уровнях sFas в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была достоверно ниже.
Содержание uPA и tPA в ткани опухоли больных раком толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой и зависело от основных клинико-морфологических характеристик заболевания, а именно, распространенности опухолевого процесса, степени дифференцировки опухоли, глубины прорастания в стенку кишки и кровеносные сосуды.
Безрецидивная выживаемость больных колоректальным раком достоверно различалась по порогу уровню 3 нг/мг белка для uPA, 2 нг/мг белка для tPA и 2 нг/мг белка для PAI-1.
Выявлены наиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценке общего прогноза у больных раком толстой кишки: ММР-9/коллаген IV типа, MMP-9/uPA, MMP-9/PAI-1, коллаген IV типа/РАЫ и при прогнозе отдаленных метастазов - MMP-9/sFas.
Влияние активности внеклеточных протеолитических ферментов и их ингибиторов на процессы ангиогенеза и апоптоза в опухолях больных раком толстой кишки
Металлопротеиназная и плазминогенная протеолитические системы влияют на целый ряд процессов, связанных с опухолевой прогрессией, в частности на миграцию, адгезию, ангиогенез, дифференцировку, апоптоз и пролиферацию опухолевых клеток.
Согласно современным представлениям, ММР можно отнести к наиболее важным факторам агрессивности опухолевого роста. В ряду новых функций ММР, открытых в исследованиях последних лет, ключевую роль в опухолевой прогрессии играют мощный ангиогенный эффект и поддержание / жизнеспособности опухолевых клеток с помощью участия в выходе депонированных факторов роста и преодоления программы апоптоза (loachim Е.Е. et al., 1998; Curran S. et al., 2000; Egeblad M. et al, 2002; Leeman M.F. et al., 2003; Chakraborti S. et al., 2003; Li B.H. et al., 2003; Yoon S.O. et al., 2003; Visse R., 2003; Rundhaug J.E., 2005).
Многочисленные работы подтверждают существование тесной связи между уровнями экспрессии внеклеточных протеаз и факторами, контролирующими прогрессию и метастазирование рака толстой кишки, процессы ангиогенеза и апоптоза в опухоли, такими как VEGF, Fas антиген, коллаген ГУ типа (loachim Е.Е. et al., 1999; Feng G. et al., 2000; Murray D. et al., 2004; Jin J.S.etal., 2006).
В последние годы большое внимание уделяется проблеме неоангиогенеза и исследованию конкретных молекул, участвующих в регуляции образования и роста новых сосудов в злокачественных опухолях (В.И. Киселев и соавт., 2005; Gasparini G., 2000). Ключевым положительным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor - VEGF), который важен как при нормальном процессе роста, так и при различных патологических состояниях, в том числе при развитии и прогрессии злокачественных новообразований. Показано, в частности, что VEGF играет важную роль в неоангиогенезе при колоректальном раке (Shin J.E. et al., 2007). питательные вещества секретировали VEGF. VEGF - гликопротеин, связывающийся только с эндотелиальными клетками и стимулирующий их пролиферацию. Под действием VEGF ослабляются межклеточные контакты и активируются эндотелиальные клетки, находящиеся в: состоянии покоя. Затем последние начинают продуцировать ферменты, в том числе ММР и активаторы плазминогена, разрушающие базальную мембрану. При расщеплении белков внеклеточного матрикса образуются факторы, обладающие как про-, так и антиангиогенной активностью. Лизис белков внеклеточного, матрикса регулируется ингибиторами протеаз (ТІМР или РАІ). Ослабление контактов между эндотелиальными клетками и разрушение базальной мембраны способствуют миграции и пролиферации эндотелиальньгх клеток с последующим формированием незрелых кровеносных сосудов. Затем, отдельные сосуды объединяются в общую циркуляторную сеть, через которую кровь и начинают поступать к тканям, клетки которых
Таким образом, VEGF является важнейшей молекулой с проангиогенными свойствами, которая также регулирует протеолитическую систему, ответственную за ремоделирование внеклеточного матрикса.
Известно шесть изоформ данного фактора. В состав: семейства VEGF-подобных белков входят VEGF-A VEGF-B,: VEGF-G, VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (P1GF). У человека выделены- 4 изоформы VEGF-А: VEGF 121,. VEGF 165, VEGF189 и VEGF206; которые образуются в результате альтернативного сплайсинга мРЫК VEGF. VEGF 165 является наиболее распространённой и значимой : изоформой. Более крупные изоформы находятся: в латентном состоянии во внеклеточном матриксе до того момента, как они высвобождаются под действием-протеолитических ферментов, таких как плазмин или ММП-9. VEGF-A играет важную роль в удержании эндотелиальных клеток новообразованных кровеносных сосудов, у которых еще нет перицитов, препятствуя апоптозу эндотелиальных клеток и обратному развитию незрелых сосудов (Gerber Н.Р. et al., 1999).
Структурно близкие между собой белки данного семейства являются лигандами для рецепторов VEGF, к которым относятся VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, нейтропилин-1 (табл. 1.3). VEGF-A может связываться с близкими по строению рецепторными белками VEGFR-1 (Flt-І) и VEGFR-2 (Flk-1/KDR), обладающими тирозинкиназной активностью. Эти рецепторы экспрессируются клетками эндотелия стенки кровеносных сосудов, и связывание с ними VEGF запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток, их выживание и пролиферацию (Ferrara N., 2003). Стимулируя эндотелиальные клетки, VEGF влияет на развитие новых кровеносных сосудов и, таким образом, играет центральную роль в процессе ангиогенеза; Кроме того, данный белок способствует выживанию незрелых кровеносных сосудов, выполняя функцию сосудистой поддержки (Ferrara N., 2002; Shinkaruk S. et al., 2003; Lee S.et al., 2007).
Статистический анализ результатов исследования
Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 7.0 for Windows и Microsoft Office Excel 2003. Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия %2. Различия между показателями считались статистически значимыми прир 0,05 (С. Гланц, 1999).
Анализ прогностической значимости содержания маркеров и построение кривых выживаемости проводили методом Каплан-Майера (Kaplan EX., Meier P. II J. Am. Stat. Assti. - 1958. - Vol.53. - P.457-481).
Достоверность различий в выживаемости оценивали с помощью "Лог-ранк теста" ("Log-rank test"). Многофакторный анализ проводили методом регрессионного анализа по Сох (Proportional hazard (Сох) regression model).
Статистический анализ прогностической значимости содержания иммуногистохимических и биохимических маркеров в опухолях больных раком толстой кишки проводили с учетом основных клинико-морфологических признаков и показателей общей и безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки. На основе данных однофакторного анализа проведен многофакторный анализ прогностической значимости комплекса клинико-морфологических признаков с учетом показателей экспрессии биохимических и иммуногистохимических маркеров.
Экспрессия ММР-9 определена в первичной опухоли у 187 больных раком толстой кишки.
Больные раком толстой кишки по уровню экспрессии ММР-9 разделились примерно поровну. Так 51,3% пациентов были с низкой экспрессией ММР-9 в опухоли и 48,7% пациентов — с высокой экспрессией этого белка.
Накопление фермента в опухоли больных раком толстой кишки происходило в цитоплазме раковых клеток и компонентах стромы вокруг опухолевых комплексов (фибробластах, макрофагах, стенках сосудов, лейкоцитарных элементах). Цитоплазматическая реакция высокой интенсивности часто наблюдалась в низко- и умереннодифференцированных аденокарциномах толстой кишки, а редуцированная или очаговая экспрессия маркера — в структурах высокодифференцированных аденокарцином. Как правило, выявлялось гомогенное окрашивание цитоплазмы раковых клеток (рис. 3.1).
Интенсивность окрашивания компонентов внеклеточного матрикса не была связана со степенью дифференцировки опухоли и зависела от характера стромы и выраженности десмопластической реакции.
Экспрессия протеазы в нормальных тканях толстой кишки была слабопозитивной. Экспрессия фермента в опухолях больных раком толстой кишки зависела от ряда клинико-морфологических характеристик заболевания. В таблице 3.1 представлены данные об экспрессии ММР-9 в опухоли больных раком толстой кишки с учетом основных клинико-морфологических признаков болезни.
Отметим, что высокая экспрессия ММР-9 выявлена достоверно чаще в опухоли пациентов при IVb стадии рака толстой кишки (в 2 раза), при солидном и солидно-альвеолярном гистологическом варианте строения опухоли (в 2 раза), при низкой степени дифференцировки опухоли (в 4 раза), при прорастании опухолью всех слоев стенки кишки и врастании в жировую клетчатку (в 1,7 раза чаще), при наличии инвазии опухоли в сосуды (в 4 раза).
Содержание коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки
Экспрессия коллагена IV типа определена в опухоли у 187 больных раком толстой кишки. У 42,8% больных раком толстой кишки выявлена высокая экспрессия коллагена IV типа, у 57,2% пациентов - низкая экспрессия белка.
В опухолях больных раком толстой кишки коллаген IV типа был выявлен в базальных мембранах вокруг железистых раковых комплексов, а также кровеносных сосудов (рис. 3.2). Эпителий нормальной слизистой оболочки толстой кишки не был окрашен маркером. Экспрессия белка в части высоко- и умереннодифференцированных аденокарцином толстой кишки была представлена непрерывными линиями или отдельными фрагментами коллаген IV-содержащих базальных мембран.
Экспрессия коллагена IV типа в базальных мембранах вокруг железистых структур и сосудов в ысо код ифференциро ванной аденокарциномы толстой кишки (х!50). Стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод. Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера.
В низкодифференцированных опухолях в большинстве случаев контуры базальных мембран не выявлялись, а структуры коллагена IV типа в большом количестве присутствовали в тонких волокнах внеклеточного матрикса опухоли.
В таблице 3.2 представлены данные об экспрессии коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки с учетом основных клинико-морфологических признаков заболевания.
Отметим, что низкая экспрессия коллагена IV типа выявлялась достоверно чаще в опухоли пациентов при IVa и IVb стадиях заболевания (примерно в 2-5 раз), при солидном варианте гистологического строения (в 2-3 раза чаще), при низкой степени дифференцировки опухоли (в 3 раза чаще), при прорастании опухолью всех слоев стенки кишки и жировой клетчатки (в 2-2,5 раза чаще), при наличии инвазии опухоли в сосуды (в 6 раз).
Таким образом, экспрессия коллагена IV типа в опухоли достоверно отражала наиболее важные клинические признаки рака толстой кишки.
Слабая реактивность или отсутствие коллаген IV-содержащих базальных мембран часто сочетались с повышенной экспрессией ММР-9 в цитоплазме клеток рака толстой кишки. VEGF определен в сыворотке крови 187 больных раком толстой кишки. Содержание маркера колебалось от 100 до 1800 пг/мл, в среднем составляя 752,2±26,2 пг/мл, медиана показателя равнялась 700 пг/мл. Распределение VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки представлено на рисунке 3.3, наиболее часто его содержание находилось в интервале от 400 до 600 пг/мл (55 пациентов, что составило 29,4%). У 26 (13,9%) больных содержание VEGF было менее 400 пг/мл, у 41 больного (21,9%) - в интервале от 600 до 800 пг/мл, у 65 пациентов (34,8%) значения маркера превышали 800 пг/мл.
В группе практически здоровых людей содержание VEGF в сыворотке крови в среднем составило 311,4+18,9 пг/мл, медиана 301 пг/мл и было достоверно ниже, чем в сыворотке крови больных раком толстой кишки (р-0,0001).
Следует отметить, что содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки по половому признаку различалось недостоверно и составило 735,8+38,0 пг/мл в группе мужчин и 766,1±36,3 пг/мл в группе женщин (р=0,57).
Анализ содержания VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки с учетом стадии заболевания показал, что концентрация маркера отражает стадию опухолевого процесса (р=0,0001) (табл. 3.3).
При этом концентрация VEGF у больных раком толстой кишки I и Па стадии не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей и, таким образом, показатель не обладал диагностической способностью при ранних стадиях заболевания, что, несомненно, снижало его ценность.
Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом клинико-морфологических признаков заболевания
Оценили содержание основных компонентов системы плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом клинико-морфологических признаков заболевания. Достоверно более высокое содержание uPA, tPA и PAI-1 выявлено в опухолях больных мужского пола по сравнению с женским (р=0,01) (табл. 4.2). При изучении содержания компонентов системы активации плазминогена с учетом возраста больных раком толстой кишки выявлено достоверно более высокое их содержание в опухоли больных в возрасте до 60 лет по сравнению с группой пациентов от 60 лет и старшее (табл. 4.3), что косвенно может указывать на более агрессивное течение заболевания у пациентов моложе 60 лет.
Наибольший интерес для практикующих врачей представляет изучение связи показателей системы активации плазминогена в опухолевой ткани больных раком толстой кишки со стадией заболевания. Выявлено достоверное повышение uPA при увеличении местной распространенности заболевания (Т) - более чем в 10 раз, при наличии отдаленных метастазов (М) - более чем в 4 раза (табл. 4.4). Обнаружено повышение tPA при увеличении местной распространенности опухолевого процесса (показатель Т), при наличии отдаленных метастазов (М) (табл. 4.5). Выявлено достоверное повышение PAI-1 в первичной опухоли больных раком толстой кишки при увеличении местной распространенности процесса (Т) - более чем в 3 раза, при наличии регионарных метастазов (N) -примерно в 2 раза и отдаленных метастазов (М) - более чем в 3 раза (табл. 4.6). Таким образом, при увеличении стадии заболевания показатели uPA и PAI-1 достоверно повышались, однако диагностическая ценность маркеров при начальных проявлениях рака толстой кишки была недостаточной (не выявлено достоверных различий содержания маркеров в опухоли и неизмененной слизистой оболочке толстой кишки). Степень дифференцировки опухоли была достоверно связана с содержанием активатора плазминогена uPA в ткани опухоли больных раком толстой кишки (табл. 4.7). При низкой степени дифференцировки опухоли содержание uPA и PAI-1 в опухоли было наибольшим, однако достоверные различия обнаружены только для uPA. Гистологический вариант строения опухоли не был достоверно связан с содержанием компонентов системы активации плазминогена в ткани опухоли больных раком толстой кишки.
Содержание uPA и PAI-1 было наибольшим в опухолях с преобладанием железистого варианта строения (табл. 4.8). Примечание: все различия недостоверны р 0,05. Все показатели системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки были достоверно связаны с одним наиболее важным клинико-морфологическим фактором заболевания - глубиной инвазии опухоли в кишечную стенку (р 0,001) (табл. 4.9). Обнаружено, что при наличии инвазии опухоли в кровеносные и лимфатические сосуды содержание uPA и PAI-1 также достоверно повышается (табл. 4.10). Наличие слизеобразования, участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опухоли не изменяло достоверно показатели содержания компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки. Обнаружено, что при наличии инвазии опухоли в кровеносные и лимфатические сосуды содержание иРА и PAI-1 также достоверно повышается (табл. 4.10). Наличие слизеобразования, участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опухоли не изменяло достоверно показатели содержания компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки. При неблагоприятных (высоких) уровнях экспрессии ММР-9 содержание иРА в ткани опухоли было достоверно выше, чем при благоприятных (табл. 4.11). При неблагоприятных (низких) уровнях экспрессии коллагена IV типа содержание компонентов системы активации плазминогена также было достоверно выше (табл. 4.12).
