Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Акустические методы исследования 9
1.2. Диагностическое значение фракционирования белков. Известные методы 12
1.3. Современные методы в гематологии 27
1.3.1. Определение гемоглобина 27
1.3.2. Подсчет клеток крови 27
1.3.3. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) 32
Глава II. Материалы и методы 34
2.1. Материалы исследования... 34
2.2. Акустический метод исследования биожидкостей 37
2.2.1. Принцип метода 37
2.2.2. Акустическое определение биохимических показателей 39
2.2.3. Акустическое определение гематологических показателей 45
2.3. Методы сравнения 49
2.4. Контрольные материалы 50
2.5. Статистический анализ данных 50
ГлаваIII. Определение биохимических показателей крови.. 51
3.1. Определение концентрации общего белка 51
3.2. Количественный и качественный анализ полученных белковых спектров 59
Глава IV. Оценка гематологических показателей крови 84
4.1. Оценка показателей красной крови 84
4.2. Скорость оседания эритроцитов 96
4.3. Подсчет лейкоцитов и тромбоцитов 102
Глава V. Дополнительные сведения 106
5.1. Комплексное обследование пациентов (одновременное определение нескольких показателей крови) 106
5.2. Особенности и ограничения акустического метода 110
5.2.1. Особенности метода 110
5.2.2. Ограничения метода 111
Обсуждение 112
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список литературы 123
- Диагностическое значение фракционирования белков. Известные методы
- Акустический метод исследования биожидкостей
- Количественный и качественный анализ полученных белковых спектров
- Особенности и ограничения акустического метода
Введение к работе
Актуальность
В настоящее время в лабораторной практике применяется большое количество методов определения биохимических показателей сыворотки крови: фотометрические, турбодиметрические, электрофоретические и т.д. [21, 24, 32, 41, 60, 61]. Большинство методов предполагает применение реактивов, а это значит, что исследования находятся в зависимости от наличия, стоимости и качества диагностических наборов. Более того, реагенты являются преобразователями первичного сигнала, что привносит дополнительный этап в измерительную процедуру, что неизбежно сопровождается увеличением погрешностей лабораторных исследований [16, 61]. Для определения некоторых биохимических параметров требуется достаточно длительное время проведения анализа [52, 62, 64]. При этом каждая из известных методик исследования биохимических показателей предназначена для определения только одного из компонентов сыворотки крови. Не существует единого метода определения сразу нескольких биохимических показателей в одном образце крови.
Многие физиологические и патологические процессы в организме протекают при, непосредственном участии белков [21, 34, 60]. Белки поддерживают коллоидно-осмотическое давление плазмы крови, осуществляют транспорт многих эндо- и экзогенных веществ (гормонов, липидов, лекарственных средств), являются ферментами, факторами свертывания крови и так далее. И хотя на сегодняшний день возможна идентификация и количественное определение многих индивидуальных белков [24, 35, 107], определение общего белка сыворотки крови по-прежнему актуально в скрининговых исследованиях. Важным тестом является и фракционирование белков, так как при многих состояниях возникает диспротеинемия с сохранением концентрации общего белка в диапазоне нормальных значений [21, 25, 60]. В этой ситуации очевидна необходимость проведения биохимического
5 скрининга для распределения белковых фракций. В некоторых странах эта задача решается при помощи электрофоретического разделения белковых фракций сыворотки крови. Однако в нашей стране этот метод не получил широкого распространения ввиду трудоемкости и дороговизны, и фактически как скрининг не применяется [27]. В связи с этим, перспектива появления нового метода с целью биохимического скрининга диспротеинемий вполне актуальна [29].
При исследовании цельной крови сложилась следующая ситуация. Для анализа клеток крови с высокой точностью в небольшом объеме с 50-х годов прошлого столетия применяется технология автоматического анализа крови в гематологических анализаторах, что позволяет подвергать исследованию сразу большое количество клеток крови одного пациента [17, 31, 39, 41]. Однако до сих пор сохраняются ручные методы подсчета клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) в счетных камерах под микроскопом, что является трудоемким процессом с большим источником ошибок [52, 90]. Более того, не существует методов одновременного определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и показателей красной крови [11, 36, 38, 40]. Широко применяемый в нашей стране метод Панченкова для определения СОЭ не удовлетворяет современным требованиям к лабораторным исследованиям, так как он не автоматизирован и, следовательно, не оснащен системой автоматического документирования результатов [17,41].
В то же время, современные ультразвуковые технологии являются объективными методами исследования некоторых количественных и качественных особенностей такой сложной биологической среды как кровь [30, 42, 45, 48, 96]. При анализе литературы последних лет встретились сообщения о перспективности использования ультразвука для диагностики величины кровопотери у пострадавших при авариях, катастрофах, в анализаторах групп крови, для разрушения тромбов в сосудистой хирургии и т.п. [26, 101,103, 104, 114].
В последние годы отечественными производителями лабораторной
техники был предложен акустический (ультразвуковой) метод и прибор для
лабораторных исследований [20, 29, 30, 45, 46, 48]. Попытка применить
ультразвуковые исследования в практике клинико-диагностических
лабораторий обусловлена, прежде всего, надеждами на появление
безреагентных методов исследования. Способ измерения относительного
содержания белка и липопротеидов в биологических жидкостях в предлагаемом
методе основан на изменении значений скорости и поглощения ультразвука,
зависимости этих параметров от частоты ультразвукового сигнала
(резонаторный метод) [53, 54, 73, 95]. Однако лабораторные аспекты новой технологии практически не разработаны.
Авторами акустического метода и прибора «БИОМ» /ЗАО «БИОМ», Н.Новгород/ были предложены методики [45, 46] для определения:
концентрации общего белка в сыворотке крови;
фракций белков сыворотки крови;
показателей липидного обмена;
концентрации гемоглобина в стабилизированной крови;
количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови;
соэ.
Большинство методик требовало уточнения и доработки, поэтому работа велась в тесном контакте с разработчиками.
Цель настоящей работы - оценка возможностей безреагентного акустического метода в лабораторной практике и анализ выборки для коррекции математических программ прибора «БИОМ».
Для этого решались следующие задачи:
Оценить область применения акустического метода при определении общего белка и белковых фракций.
Разработать методику анализа гематологических параметров цельной стабилизированной крови для одновременного определения в ней
7 концентрации гемоглобина, подсчета лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов и определения скорости оседания эритроцитов. Определить область применения акустического метода при гематологических исследованиях.
Проанализировать аналитические характеристики акустического метода (сходимость, воспроизводимость, диагностическая чувствительность, специфичность и т.д.) при определении биохимических и гематологических показателей.
Дать оценку возможности метода проводить многопараметровый одномоментный анализ крови, в том числе определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).
Оценить особенности и ограничения акустического метода определения биохимических и гематологических показателей по сравнению с традиционными методами их определения.
Научная новизна
Впервые проведена оценка возможностей акустического безреагентного метода для определения в сыворотке пациентов концентрации общего белка и распределения белковых фракций, а в цельной крови - одномоментного определения гематологических показателей: концентрации гемоглобина, количества клеток крови, гематокрита, эритроцитарных индексов и скорости оседания эритроцитов. Определено место акустического метода в лабораторной практике на сегодняшний день. Акустический метод, принципиально отличный от традиционных, позволил без применения реактивов и дорогостоящей аппаратуры достаточно быстро получить некоторые биохимические и гематологические показатели, при этом часть из них - одномоментно.
Практическая значимость исследования
Метод определения общего белка и белковых фракций был запатентован производителями акустического метода [29]. В ходе наших совместных клинических испытаний данного метода были написаны методические указания для определения концентрации общего белка и белковых фракций в сыворотке
8 крови. Благодаря систематическому анализу данных исследования сыворотки и крови пациентов, удалось усовершенствовать математическую модель для определения биохимических показателей крови, а также внести значительный вклад в разработку методики определения гематологических параметров крови, включая скорость оседания эритроцитов. Реализованный в приборе отечественных производителей «БИОМ» акустический метод стал применяться в клинико-диагностических лабораториях для скрининга гипо- и гиперпротеинемий, скрининга анемических состояний, определения СОЭ и т.д., благодаря тому, что принципиально иные сигналы о свойствах крови были сопоставлены с традиционными показателями, привычными и понятными для врачей. Также метод применяется в учебном процессе и научно-исследовательских работах кафедры клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО «РМАПО» и кафедры биофизики с курсом лабораторной диагностики медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ. Материалы проводимой работы были представлены на 15-м Европейском конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Барселона, 2003) [122], 7-м Балтийском конгрессе по лабораторной медицине (Пярну, 2004) [123], Национальных днях лабораторной медицины (Москва, 2004) [58], конференции "Стандарты и протоколы лабораторной диагностики" (Москва, 2005), 16-м Европейском конгрессе по клинической химии и лабораторной медицине (Глазго, 2005) [121]. По теме диссертации опубликовано б печатных работ.
Диагностическое значение фракционирования белков. Известные методы
Под определением «общий белок» понимается большое количество белков, различающихся по структуре и функциям. Концентрация общего белка в сыворотке зависит, как от физиологических факторов (возраст, пол, питание, климат, физическая нагрузка, прием некоторых лекарственных препаратов), так и от патологических (нарушение синтеза белков в печени, гамма-глобулинов в клетках лимфоидной ткани, усиленный катаболизм, значительные потери, например, при заболеваниях почек) [16, 56].
Повышение концентрации общего белка возникает достаточно редко (при дегидратации организма, аутоиммунных заболеваниях, миеломной болезни и т.д.); чаще происходит снижение концентрации общего белка (заболевания печени, почек, кровотечения, ожоги, тиреотоксикоз и т.п.). Еще чаще возникает диспротеинемия, т.е. нарушение соотношения отдельных белков. В таком случае определение концентрации общего белка не выявит патологии, поэтому важным является анализ отдельных фракций, например, путем электрофореза. При этом представление об уровне общего белка позволяет сделать более информативной трактовку протеинограммы - картины разделения белков по фракциям благодаря выражению распределения белковых фракций не только в относительных, но и в абсолютных единицах (г/л) [24, 25].
Для диагностики заболеваний внутренних органов большое значение имеет комплексная оценка изменений всех выявляемых белковых фракций. Наиболее распространен электрофоретический метод разделения белков. При этом чаще получают 5 фракций (табл. 1.2) [60, 64]. На рис. 1.1 отражена типичная картина распределения белковых фракций в норме.
С точки зрения клинициста, имеются три основания для назначения электрофоретического исследования (ЭФ) белков сыворотки крови: первое идентификация специфичного патологического процесса; второе использование ЭФ в качестве скринингового теста, когда патология на электрофореграмме является основанием для более серьезного исследования; третье - возможность более четкой интерпретации изменения белкового спектра при исследовании в динамике [60, 64].
С диагностической точки зрения, зональный электрофорез позволяет оценить содержание восьми основных белков сыворотки крови: альбумина, альфа 1-ингибитора протеиназ (альфаі- антитрипсин), гаптоглобина, альфа2 макроглобулина, трансферрина, СЗ-компонента комплемента, иммуноглобулина класса А и G. Дополнительно появляющиеся полосы могут дать информацию о наличии С-реактивного белка, альфа-фетопротеина, моноклоналъных иммуноглобулинов, когда они присутствуют в концентрации выше 0,5 г/л. Электрофорез может также отражать изменение в молекулярной массе, конформации белков или посттрансляционные модификации протеинов.
Изменения в концентрации и структуре белков сыворотки крови, если они не являются следствием генетических нарушений, отражают разные патологические процессы. Изменения, наблюдаемые на электрофореграммах при отдельных формах заболевания, являются следствием комбинации нарушений в синтезе, потере и деградации отдельных функциональных групп белков. В таких случаях исследование белков сыворотки крови методом электрофореза или определение специфических белков является первым этапом оценки патологического процесса и постановки диагноза. В то же время следует иметь виду, что анализ электрофореграммы только в части случаев позволяет получить органотопическую информацию. Так, например, цирроз печени вызывает изменения в иммунном статусе, отражается в синдроме воспаления, приводит к снижению синтеза белков в печени, провоцирует внутрисосудистый гемолиз. Некоторые формы цирроза могут сопровождаться активацией системы комплемента.
Некоторые патофизиологические синдромы, которые могут быть выявлены при анализе электрофореграммы, изложены ниже [60]. 1) Воспалительный процесс. Реакция организма на острую фазу воспаления проявляется в значительном увеличении в крови содержания белков острой фазы (положительные белки острой фазы) и снижением содержания отрицательных. На электрофореграмме это отражается в увеличении фракций al- и а2-глобулинов (рис. 1.2). Увеличение белка в этих фракциях является, в первую очередь, следствием накопления в сыворотке крови al- антитрипсина и гаптоглобина. При определенных патологических условиях не происходит параллельного повышения белков острой фазы в результате потребления некоторых из них. Это имеет отражение в несоответствии изменений зоны Р" и у- глобулинов. В этих условиях динамическое использование метода электрофореза помогает разобраться в клинической ситуации.
Неадекватное питание или паренхиматозное поражение печени могут сопровождаться снижением содержания в крови некоторых белков. Это снижение наиболее выражено проявляется для группы транспортных протеинов: альбумина, преальбумина, трансферрина, ретинолсвязывающего белка. Наиболее часто синтез этих белков оказывается сниженным в острую фазу воспалительного процесса, на основе чего их иногда называют "отрицательными" реактантами острой фазы. В условиях патологии печени и развития синдрома портальной гипертензии большое количество альбумина даже в условиях его усиленного синтеза оказывается в асцитической жидкости, выявляя на электрофорезе картину гипоальбуминемии. При многих патологических процессах, только на основании данных электрофореза трудно говорить о синтезе альбумина в печени. Во всех ситуациях содержание в крови ретинолсвязывающего белка более адекватно отражает уровень синтеза протеинов в печени [60], однако, его определение требует применения сложной технологии. Кроме того, довольно длительный период циркуляции альбумина в сосудистом русле делает частое определение его содержания в крови малоэффективными.
Акустический метод исследования биожидкостей
Метод акустического интерферометра постоянной длины (прецизионный резонаторный метод), реализованный в приборе отечественных производителей "БИОМ" для лабораторных исследований /ЗАО «фирма БИОМ», Н.Новгород/ основан на том, что столбик исследуемой жидкости, находящейся в цилиндрической полости между двумя пьезопреобразователями, является механическим резонатором, собственные частоты которого линейно связаны со скоростью ультразвука в исследуемой среде. Измерение скорости ультразвука в жидкости, заполняющей ячейку, сводится к определению частоты заданного резонансного пика по максимуму амплитудно-частотной характеристики или по точке перегиба на фазово-частотной характеристике. Одновременно измеряется ширина резонансного пика на уровне 0,707 от максимума амплитуды или крутизна фазово-частотной характеристики в точке перегиба, связанные с величиной поглощения ультразвука. пъезопреобразователи; 3 — цилиндрический корпус с высокопараллельными торцевыми плоскостями; Uex — амплитуда входящего ультразвукового сигнала; 1/вых — амплитуда сигнала на выходе; ер - фаза; по оси абсцисс — частота УЗ (КГц). Микро-ЭВМ прибора получает информацию о резонансной частоте, максимальной амплитуде, ширине резонансного пика, и, следовательно, определяет скорость УЗ в данной среде и величину его поглощения. Математическая модель позволяет представить эту информацию на выходе в привычной для врача форме (концентрации).
Прибор проводит последовательное измерение резонансных частот термостатируемых акустических ячеек с дистиллированной водой и исследуемой средой, выражает связь между этими характеристиками через АКП (акустический параметр) и позволяет выразить изменения в биосреде после различных воздействий, а также определять концентрацию веществ в биосредах после предварительной градуировки анализатора. Прибор подключен к персональному компьютеру (ПК), который в результате обработки полученных данных при помощи оригинальных математических моделей (решения системы линейных уравнений) выдает информацию в привычном для врача и исследователя виде.
Калибратором для данного прибора фактически является дистиллированная вода, которая помещается в акустические ячейки двух измерительных устройств (№1 и №2 соответственно) прибора. В термостатируемых ячейках поддерживается строго заданная температура в диапазоне 15-40С. На устройства для контроля биологических жидкостей подается сигнал частотой изменяющейся на 10 МГц из любой части диапазона 2-40 МГц (например, от 5,0 до 15,0 МГц) с высокочастотного генератора (например, ГЧ - 164), управляемого персональным компьютером. Электрический сигнал преобразовывается на пьезоизлучателе в ультразвуковой, который распространяется в дистиллированной воде, находящейся в акустических ячейках. Пьезоприемники преобразуют ультразвуковой сигнал на выходе в высокочастотный электрический. Электрический сигнал далее поступает на высокочастотный переключатель, который подсоединяет к высокочастотному микровольтметру (например, ВЗ-48) одно и другое устройство поочередно. Продетектированный сигнал с выхода высокочастотного микровольтметра поступает на вольтметр постоянного тока (например, В7 - 53), также управляемый компьютером. В результате обработки данных, получаемых с пьезоприемников устройств для контроля биологических жидкостей, в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков в выбранном диапазоне частот для дистиллированной воды. Затем в обе ячейки прибора помещают сыворотку крови, а в памяти компьютера фиксируются центральные частоты всех резонансных пиков для сыворотки крови. Далее в первую ячейку помещается модифицированная сыворотка, подготовленная согласно инструкции из сыворотки пациента путем добавления определенной концентрации трихлоруксусной кислоты. Аналогично предыдущему этапу в памяти компьютера фиксируются частоты всех резонансных пиков в том же диапазоне (например, от 5,0 до 15,0 МГц) для модифицированной сыворотки. Компьютер вычисляет среднюю разность частотного расстояния между резонансными пиками и номер выбранного резонансного пика по формуле: порядковый номер выбранного резонансного пика; N - число частотных расстояний между резонансными пиками в данном частотном диапазоне; fj - резонансная частота j-ого резонансного пика; fj+i -резонансная частота j+1-ого резонансного пика.
Затем компьютером выбираются значения центральных частот резонансных пиков одного и того же номера для дистиллированной воды НгО, сыворотки крови (S) и модифицированной сыворотки (mS) и вычисляются соответствующие скорости ультразвука по формулам: где Y(H20)l 2 - скорость ультразвука в дистиллированной воде в первой и второй ячейке соответственно; f(H2o)li2 j - центральные частоты резонансных пиков номера j для дистиллированной воды в первой и второй ячейке; Z j (н2о)12 - продольные волновые числа в устройствах №1 и №2 для дистиллированной воды; R-радиус ячейки устройства. где V(S)1 2 - скорость ультразвука в сыворотке крови в устройствах №1 и №2; центральные частоты резонансных пиков номера j для сыворотки крови в устройствах №1 и №2; Zj(S)i,2 - продольные волновые числа в устройствах №1 и №2 для сывороткой крови; R - радиус ячейки устройства. где V(m - скорость ультразвука в модифицированной сыворотке; f mS) j - центральные частоты резонансных пиков номера j для модифицированной сыворотки; Zj(ms) - продольные волновые числа для модифицированной сыворотки; R - радиус ячейки. На основании результатов, полученных по формулам для у(И20)1 2, y(s)1 2j y(mS) вычисляют относительные изменения скорости ультразвука в сыворотке крови в устройствах №1 и №2, относительные изменения скорости ультразвука в модифицированной сыворотке относительно дистиллированной воды по формулам
Количественный и качественный анализ полученных белковых спектров
Для количественной оценки спектров, полученных двумя методами, при сравнении хотелось бы получить высокие значения коэффициентов линейной корреляции Пирсона по всем показателям белкового спектра. Тогда можно было бы говорить об идентичности двух методик. Однако в нашем случае такое вряд ли возможно, так как в основе акустического и электрофоретического методов определения белковых фракций лежат очень различные принципы.
Тем не менее, нами были определены коэффициенты корреляции между этими двумя методами по каждой фракции в общей выборке пациентов, а также отдельно в группах пациентов с нормальным, высоким и низким содержанием общего белка в сыворотке крови, а также был проведен регрессионный анализ (табл.3.4, рис.3.3). Статистически значимая корреляция была отмечена лишь для трех белковых фракций сыворотки из пяти: альбумина (R=0,65-0,83), У -глобулина (R=0,5-0,9) и -глобулина (R=0,47). При этом мы помнили, что коэффициент корреляции Пирсона удовлетворительно характеризует лишь связи, не слишком отклоняющиеся от прямолинейных. Если коэффициент корреляции не слишком отличается от нуля, то это не означает отсутствия связи между показателями вообще, это говорит только об отсутствии линейной связи. Поэтому, хотя корреляционный анализ не дал ответа на вопрос о согласованности измерений, выполненных двумя способами, мы применяли и другие статистические инструменты.
На рис.3.4 показаны гистограммы показателей для бета-фракции, полученные двумя исследуемыми методами. Видно, что распределение значений для акустического метода не подчиняется нормальному закону распределения значений. Соответственно, мы пришли к необходимости применения непараметрических методов статистического анализа данных.
Например, был применен метод Блэнда-Алтмана (табл.3.5, рис.3.5). Некоторые из полученных регрессионных зависимостей для двух сравниваемых методов. По оси абсцисс — показания денситометра для данной фракции при электрофоретическом разделении белков сыворотки крови, по оси ординат — соответствующие значения на акустическом приборе «БИОМ» для тех же проб. Видно, что для /3- фракции нельзя говорить о линейной корреляции показаний двух приборов. Сомнения вызывает и характер распределения значений.
Метод Блэнда-Алтмана позволяет сравнить результаты измерений, выполненных двумя методами, ни один из которых не является абсолютно надежным [18, 22]. Для каждой выполненной одним и другим способами пары измерений мы вычисляли их разность, которая характеризует систематическое расхождение, а также находили среднюю величину и стандартное отклонение разности, которое указывает на степень разброса данных. Этот статистический метод позволяет определить, зависит ли степень расхождения от величины измеряемого показателя (табл.3.5, рис.3.5). Стандартные отклонения оказались значительными по сравнению с самими данными. Таким образом, этот подход также не позволил нам сделать выводов о согласованности данных, полученных двумя методами.
Также для анализа применялось и определение коэффициента ранговой корреляции Спирмена для непараметрических случаев (табл.3.6).
Мы были вынуждены применять описательный метод сравнения результатов двух методов. Для этого рассматривались отдельно группы больных с определенным типом электрофореграмм и сравнивались с контрольной группой. В качестве контрольной группы были взяты образцы сыворотки практически здоровых людей. В нашем случае была использована сыворотка сотрудников лаборатории и студентов, проходивших медосмотр. Все образцы (п=36) имели содержание общего белка в сыворотке крови в диапазоне нормальных значений (60-85 г/л). Были определены средние значения фракций (%) по каждому методу в контрольной группе (рис.3.6), которые затем сравнивались со значениями в группах с определенной патологией. Статистическая проверка показала, что при уровне значимости 5% только для р- фракции методы дают одинаковые значения в контрольной группе, по остальным же показателям статистически достоверными оказались различия между двумя методами. Поэтому было решено группах пациентов с различной патологией сравнивать не два метода между собой, а провести качественный анализ изменений показателей по сравнению с контрольной группой для-каждого метода отдельно.
Средние значения процентного содержания фракций, рассчитанные по выборке с нормальным содержанием общего белка (60-85 г/л) для каждого метода. п=36 чел. По оси абсцисс - 5 фракций сыворотки крови. По оси ординат - доля каждой фракции от общего содержания белка (%). Указано среднее значение и ошибка средней. Видно, что данные по двум методам отличаются (кроме р -фракции). Достоверность отличий проверялась при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни с поправкой Йетса для а-5%.
Эта группа сывороток взята в качестве контрольной для дальнейшего анализа отклонений в группах с различной патологией.
Было проведено сравнение процентного содержания фракций при данной патологии по сравнению с контрольной группой для каждого метода. Результаты отражены в табл.3.7 и на рис.3.8. На первый взгляд получившиеся изменения по сравнению с контрольной группой незначительны, однако, они являются статистически значимыми для большинства фракций. Чтобы изменения при данной патологии были более наглядными, ниже приведены диаграммы (рис.3.9), где фракции выражены в абсолютных значениях (г/л), а не в относительных (%). Это обоснованно, т.к. при нефротическом синдроме происходит значительная потеря белков и резко снижается концентрация общего белка в сыворотке крови. Поэтому выражение результатов в абсолютных значениях имеет при данной патологии большее значение. Нами было рекомендовано ввести в прибор «БИОМ» форму выдачи результатов в абсолютных значениях, тем более, что концентрацию общего белка в сыворотке прибор определяет автоматически при каждом измерении.
Особенности и ограничения акустического метода
Контроль работы акустического прибора при определении биохимических и гематологических показателей крови осуществляется путем измерения акустических свойств дистиллированной воды. При этом, программа не позволяет пропустить этот шаг ежедневно перед началом работы. После акустического метода исследования сыворотку можно использовать для других биохимических тестов. Проведенные измерения некоторых биохимических показателей сыворотки (общий белок, общий холестерин, билирубин, ферменты) в образцах крови и сыворотки пациентов до и после акустического измерения не выявили статистическизначимых отличий (р 0.01). Происходит одновременное определение сразу нескольких параметров сыворотки или крови. Для определения большинства параметров сыворотки и цельной крови не нужны реактивы (кроме белковых фракций), следовательно, исследованию подвергается неизмененная биожидкость. Благодаря подключению к компьютеру, метод снабжен системой автоматического документирования информации (создание базы данных). Влияния интерферирующих факторов крови на акустическое исследование не выявлено. Например, при исследовании образцов сыворотки с гипертриглицеридемией или билирубинемией полученные результаты по общему белку были ниже, чем при фотометрических измерениях, которые традиционно завышены в таких образцах [61]. Для исследования применяется только свежая неизмененная сыворотка (возможно хранение в холодильнике при t=3-5C до 3 дней), либо свежая цельная кровь, стабилизированная К2ЭДТА. Замораживать сыворотку и кровь для акустического метода нельзя. Требуется не менее 500 мкл сыворотки или цельной крови. Не рекомендуется применять акустический метод для наблюдения за пациентами специализированных гематологических отделений ввиду низкой специфичности метода для случаев парапротеинемий. Отсутствует возможность визуальной оценки разделения белковых фракций. Необходимо избегать попадания инородных частиц и пузырьков воздуха в акустические ячейки при исследовании сыворотки. На сегодняшний день не существует аттестованных контрольных материалов для проведения контроля качества лабораторных исследований акустическим методом.
Применение данного акустического метода и прибора «БИОМ», несомненно, имеет свое место среди современных лабораторных исследований. Сравнение с традиционными методами с дальнейшим статистическим анализом данных показали, что метод работает успешно при определении многих показателей. При этом некоторые показатели совпадают с традиционными методами с высокой корреляцией, другие - имеют значительные расхождения. Невозможно утверждать хуже ли данный метод, либо лучше, так как в основе работы прибора лежат принципиально другие механизмы анализа биожидкостей, соответственно, полученную информацию, и трактовать следует иначе. Попытка же привести полученные данные под стандартную форму выдачи результата в виде перечисления показателей крови в привычных единицах измерения, скорее дань традиции и возможность убедиться, что метод работает. В отличие от биохимических методов, где определяется состав крови, акустический метод анализирует структуру макромолекул по их гидрофильным и гидрофобным свойствам.
При определении концентрации общего белка акустическим методом на приборе «БИОМ» были получены достаточно высокие аналитические характеристики. Коэффициент корреляции с биуретовым методом составил 0,98 (р 0.05). Коэффициент вариации и смещение не превышали предельно допустимых значений по ОСТ 91500.13.0001-2003 (приказ №220 МЗ РФ от 26.05.03). (CVio=l,7%; Вю=-3,0 в контрольном материале "Serodos" /Human, Германия/). При этом чувствительность метода позволила определять значения концентрации белка в диапазоне 10-150 г/л (при норме по этому показателю 60-85 г/л), линейность метода сохранялась во всем диапазоне рассмотренных значений. Таким образом, было показано, что прибор «БИОМ» может быть применен для определения концентрации общего белка сыворотки крови наряду с биуретовым и другими методами. Наконец, при использовании этого метода удалось избежать интерферирующего влияния на результат некоторых изменений в патологических сыворотках, создающих большие препятствия для оптических методов исследования, например билирубинемия или хилезная сыворотка. Более того, выяснилось, что потенциально метод может работать и с более низкими концентрациями белка, то есть с большей чувствительностью, а это, в свою очередь, значительно расширяет возможности применения метода в лабораторной практике. Так, в ходе нашей исследовательской работы были проведены первые пробные эксперименты по определению концентрации отдельных классов иммуноглобулинов и, хотя высокой корреляции с нефелометрическим методом получено не было,: это направление исследовательской работы продолжается. Метод . при дальнейшем усовершенствовании сможет работать для определения других индивидуальных белков, например, а2 -макроглобулина, гаптоглобина, альбумина и т.п. Кроме того, определение концентрации белка не менее актуально и в других биожидкостях организма, например, моче, транссудатах, воспалительных экссудатах и т.д.
Концентрация белка в сыворотке определялась на приборе «БИОМ» в течение 1 минуты. При этом на экране компьютера появлялись данные, характеризующие липидный обмен: концентрация общего холестерина, ЛПВП (липопротеиды высокой плотности), ШШП (липопротеиды низкой плотности), ЛПОНП (липопротеиды очень низкой плотности), триглицериды, то есть фактически проводился одномоментный многопараметровый анализ сыворотки,- приближая прибор «БИОМ» к современным биохимическим анализаторам. При этом прибор не требовал применения каких либо реактивов, следовательно, решал одномоментно массу различных проблем, таких как адаптация диагностических наборов к конкретному анализатору, проведение ежедневного контроля качества измерений, соблюдение сроков и условий хранения диагностических наборов и т.п.
