Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Современные представления и онкогенез первичных лимфом кожи 11
1.2 Классификация первичных лимфом кожи 14
1.3 Клиническая картина Т-клеточных лимфом кожи и схожих с ними заболеваний 18
1.4. Патоморфологическая диагностика Т-клеточных лимфом кожи и
схожих с ними заболеваний 23
1.5 Иммуногистохимическая диагностика лимфом кожи 25
1.6 Молекулярно-генетический метод определения клональности 27
Глава 2 Материалы и методы исследования 33
2.1 Материалы исследования 33
2.2 Методы исследования 37
2.2.1 Гистологический метод исследования биоптатов кожи из очагов поражения 37
2.2.2 Иммуногистохимический метод исследования 37
2.2.3. Молекулярно-генетический метод 42
2.2.4 Определение чувствительности метода PCR-FA-TCRy 49
2.2.5. Методы статистического анализа полученных данных 49
Глава 3 Использование клинических, гистологических и иммуногистохимических методов исследования в диагностике лимфом кожи и их клинических разновидностей 52
Глава 4 77
4.1 Анализ применения дополнительных методов исследования. 77
4.2 Сравнение диагностических критериев гистологического и молекулярно-генетического методов исследования 80
4.3 Результаты определения чувствительности молекулярно-генетического исследования на основе использования метода ПЦР фрагментного анализа с праймером BIOMED-2 BMH4-CT98-3936 81
Заключение 94
Результаты исследования и их обсуждение 96
Выводы 102
Практические рекомендации 104
Список литературы 105
- Клиническая картина Т-клеточных лимфом кожи и схожих с ними заболеваний
- Иммуногистохимический метод исследования
- Использование клинических, гистологических и иммуногистохимических методов исследования в диагностике лимфом кожи и их клинических разновидностей
- Сравнение диагностических критериев гистологического и молекулярно-генетического методов исследования
Введение к работе
Актуальность проблемы
Актуальность проблемы лимфом кожи (ЛК) обусловлена не только
нарастанием частоты Т- и В-клеточных лимфом кожи (Т- и ВКЛК), но и сложностью их ранней дифференциальной диагностики с другими кожными заболеваниями [Молочков А.В. и соавт., 2012; Burg G et al, 2005].
Последнее десятилетие оказалось важным для понимания природы ЛК и принятия новой классификации ВОЗ/EORTC (2005) [Willemze R et al, 2005] на основе клинико-морфологических, иммунофенотипических и молекулярно-генетических особенностей. Причем, использование последних двух методов существенно повысило точность выявления Т- и ВКЛК и трансформации крупнобляшечного парапсориаза в ЛК [Simon M. et al.,1997; Theriault C. et al., 2000; Klemke C.D. еt al., 2002; Nihal M. et al., 2003].
Выявление моноклонального типа пролифераций лимфоидных клеток
позволяет заподозрить развитие ЛК на ранних сроках болезни и, в этой ситуации, при отсутствии гистологически подтвержденного диагноза, рассматривать пациентов, как «группу риска» [Овсянникова Г.В., 2009; Assaf C. et al, 2005; Sekulovic L.K. et al, 2007].
Использование с целью дифференциальной диагностики метода
полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью конформационного
полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP), обеспечивает
эффективность диагностики в 63% случаев [Овсянникова Г.В., 2009]. Однако,
данные результатов исследования с его использованием оказались менее
информативными на ранних стадиях ЛК [Assaf C. et al, 2000; Simon M. et al., 1998], по сравнению с разработанным и используемым в настоящее время ПЦР-методом фрагментного анализа.
В связи с этим, разработка нового метода на основе реарранжировок генов гамма цепи TCR и IgH с помощью фрагментного анализа (автоматизированной высокоразрешающей полимеразной цепной реакции анализа фрагментов ДНК) приобретает особую актуальность в диагностике ранних стадий ЛК.
Цель исследования
Повышение точности диагностики ЛК на ранних сроках развития на основании использования метода фрагментного анализа с помощью полимеразной цепной реакции со стандартизированным праймером BIOMED -2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.
Задачи исследования
-
Определить значение применения молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам гамма цепи Т-клеточного рецептора с помощью Фрагментного анализа с праймером BIOMED-2 Concerted Action BMH-4-CT98-3936 в биоптатах пораженной кожи пациентов в ранней дифференциальной диагностике Т-клеточных лимфом кожи.
-
Определить чувствительность молекулярно-генетического метода исследования с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа.
-
Оценить эффективность молекулярно-генетического метода исследования определения Т-клеточной клональности с помощью фрагментного анализа с праймером BIOMED-2 Concerted Action BMH-4-CT98-3936 в биоптатах пораженной кожи у пациентов с Т-клеточной лимфомой кожи на ранних сроках заболевания.
-
Оценить эффективность молекулярно-генетического метода исследования определения В-клеточной клональности по генам тяжелой цепи иммуноглобулина с праймером BIOMED-2 Concerted Action BMH-4-CT98-3936 с помощью фрагментного анализа у пациентов с В-клеточной лимфомой кожи в биоптатах пораженной кожи.
-
Определить структуру лимфомы кожи в регионе Москва и Московская область с использованием иммуногистохимических и молекулярно-генетических методов исследования.
Научная новизна
-
На основе изучения клинико-морфологических и молекулярно-генетических признаков больных региона Москва и Московская область был исследован спектр лимфопролиферативных заболеваний кожи, включающий Т- и В-клеточные лимфомы кожи, парапсориаз, а также доброкачественные псевдолимфомы кожи.
-
Доказано преимущество выявления Т-клеточной клональности лимфоидных клеток в биоптатах пораженной кожи по гамма цепи Т-клеточного рецептора с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа с праймером BIOMED -2 Concerted Action BMH4-CT98-3936, по сравнению с методом одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP) в дифференциальной диагностике Т-клеточных лимфом кожи.
-
Доказана эффективность молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток в биоптатах пораженной кожи с помощью полимеразной цепной реакции
методом фрагментного анализа на ранних стадиях Т-клеточных лимфом кожи, что позволяет сформировать «группу риска» пациентов по развитию лимфомы кожи.
Научно-практическая значимость
-
Обосновано использование молекулярно-генетического метода исследования для выделения «группы риска» по развитию Т-клеточной лимфомы кожи у пациентов с крупнобляшечным парапсориазом, имеющих моноклональную реарранжировку лимфоидных клеток генов T-клеточного рецептора в биоптате пораженной кожи.
-
В работе использовался современный и стандартизируемый метод определения клональности лимфоидных клеток – фрагментный анализ в с праймером BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.
-
Выявлены оптимальные условия проведения метода фрагментного анализа, ограничения в его использовании, сформулированы критерии интерпретации результатов и практические рекомендации для врачей.
-
Применение молекулярно-генетического метода на основе фрагментного анализа исследования позволит сформировать «группу риска» пациентов по развитию лимфомы кожи.
Положения, выносимые на защиту
-
Использование молекулярно-генетического метода определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам гамма цепи Т-клеточного рецептора с помощью полимеразной цепной реакции методом фрагментного анализа с праймером BIOMED -2 Concerted Action BMH4-CT98-3936 повышает точность диагностики ТКЛК.
-
Молекулярно-генетический ПЦР-метод фрагментного анализа имеет высокую чувствительность, при которой можно достоверно определить Т-клеточную клональность лимфоидных клеток.
-
Применение молекулярно-генетического ПЦР-метода фрагментного анализа на начальный стадиях ТКЛК в комплексе с праймером BIOMED -2 Concerted Action BMH4-CT98-3936 повышает эффективность ранней и дифференциальной диагностики.
-
Применение молекулярно-генетического ПЦР-метода фрагментного анализа в комплексе с праймером BIOMED -2 Concerted Action BMH4-CT98-3936 повышает точность диагностики ВКЛК.
-
Определена структура лимфом кожи у больных региона Москвы и Московской области с учетом классификации WHО/EORTC (2005 г.).
Внедрение в практику результатов исследования
Результаты исследования внедрены в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимироского и московском областном
клиническом кожно-венерологическом диспансере. Результаты используются в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии ФППОВ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.
Апробация диссертации
Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на:
- заседании Московского городского общества дерматовенерологов
(Москва 2011 г).
- заседании Первого Московского форума «Дерматовенерология и
косметология: синтез науки и практики» (Москва 2011г).
- VI Международном форуме дерматовенерологов и косметологов (Москва,
2013г.)
- совместном заседании отделения дерматовенерологии и
дерматоонкологии ГУ МОНИКИ им.М.Ф. Владимирского, кафедры
дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ ГУ МОНИКИ им. М.Ф.
Владимирского, кафедры кожных и венерических болезней Первого МГМУ
им. И.М. Сеченова (Москва, 18.11.2013г).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 7 - в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий…», рекомендуемых ВАК Российской Федерации.
Личный вклад автора
Настоящее диссертационное исследование проводилось автором в его полном объеме с формированием базы данных, осуществлением статистической обработки и последующим обобщением полученных результатов. Автором лично проведено молекулярно-генетическое исследование всех пациентов, включенных в работу, а также изучены и проанализированы данные, полученные в настоящем исследовании.
Объем и структура работы
Клиническая картина Т-клеточных лимфом кожи и схожих с ними заболеваний
Доля больных с ТКЛК составляет около 65% от общего числа пациентов с лимфомами кожи (6), (51). Грибовидный микоз (ГМ) - самый часто встречающийся подтип ТКЛК, составляющий примерно 50% от всех опухолей кожи (153), (179). В соответствие с классификацией ВОЗ/EORTC (2005), выделяют 3 клинических стадии ГМ: пятнистую, бляшечную и опухолевую. Учитывая клиническую неоднородность лимфопролиферативных процессов в коже, то наибольшую сложность для их диагностики представляет начальная стадия ГМ, сочетающую в себе клинические признаки схожих с ним заболеваний (75), (77), (190). Пятнистая стадия ГМ клинически представлена многообразными высыпаниями: единичными или множественными эритематозными, слегка шелушащимися пятнами, экземоподобными очагами, а также элементами парапсориаза - чётко очерченными, желто-розового оттенка, имеющие форму круга, овала или пальца, диаметром от 1 до 5 см, а на ягодицах и бёдрах - до 15 см, длительно персистирующими и резистентными к лечению или спонтанно регрессирующими. Зуд, как один из первых клинических признаков, может предшествовать высыпаниям и в течении длительного периода времени быть единственным клиническим проявлением заболевания (180). Международное общество по изучению лимфом кожи (ISCL) в дифференциальной диагностике ранней стадии ГМ выделили следующие клинические критерии (43), (138): Прогрессирующие или персистирующие пятна и бляшки Поражение закрытых участков от ультрафиолетового излучения Разнообразие размера и очертаний очагов поражения Наличие пойкилодермии Однако, на основании данных критериев дифференциальный диагноз ранней стадии ГМ проводить очень сложно и с крупнобляшечным парапсориазом (КБП), в виду их сильного клинического сходства и отсутствия четких клинических признаков на ранних этапах диагностики (43) (54).
В настоящее время многими авторами высказываются предположения о пограничном положении КБП между хроническим дерматитом и ГМ, рассматривая его как проявление ранней стадии ГМ (52), (150), (163), (168), (180).
По мнению, Sanchez J. (149) КБП является ранней стадией ГМ, но в то же время ГМ может в атипичных случаях проявляться элементами высыпаний, практически неотличимыми от мелкобляшечного парапсориаза (МПП). Что касается МПП, то единой точки зрения его отношения к ГМ нет. L. Cerroni (60) относит МПП к ранним проявлениям грибовидного микоза. Частота его озлокачествления не столь определена: одни авторы отрицают саму возможность трансформации его в ТКЛК (40), (48), (149) другие отмечают ее в 46% случаев от 8 до 25 лет наблюдения (27), (60), (168), (178).
Также начальную стадию ГМ необходимо дифференцировать с экземой и нейродермитом с учетом их клинического сходства (116), (136). В связи со сходством клинической картины пятнистой стадии классической формы ГМ с указанными дерматозами, клиническая диагностика в этом периоде развития заболевания весьма затруднительна, нередко происходит смена нескольких диагнозов (15), (190). Иногда между первыми проявлениями заболевания и верификацией диагноза проходило около 4-6 лет (44), (143), (165). Несвоевременная верификация диагноза на ранних стадиях определяет неправильную тактику ведения больных с назначением неадекватной общей и местной терапии, что способствует быстрому прогрессированию заболевания. Переход от пятнистой стадии к бляшечной происходит обычно медленно, в течение нескольких лет. Клинически бляшечная стадия ГМ представлена эритематозными зудящими бляшками, развивающиеся на месте пятен или de novo, по мере нарастания инфильтрации дермы (153). Для бляшек характерно отрубевидное или мелкопластинчатое шелушение. В некоторых случаях отмечается выраженная инфильтрация, лихенефикация и шелушение эпидермиса кожи по типу псориазиформного варианта ГМ. Наряду с бляшками на этой стадии продолжают появляться пятна, характерные для I стадии. Элементы, сливаясь между собой, формируют крупные очаги, которые могут подвергаться регрессу с центральной зоны. В некоторых случаях, регресс бляшек может сопровождаться явлениями гиперпигментации, атрофии или телеангиоэктазии. В этот период заболевания может развиться эритродермия, гиперкератозы ладоней и подошв, дистрофия ногтей (48), (153). Периферические лимфатические узлы в этот период обычно незначительно увеличены, подвижные, плотно-эластической консистенции. Многочисленными наблюдениями показаны клинические случаи ГМ, имитирующие различные хронические доброкачественные дерматозы, такие как атопический дерматит (116), псориаз (7), (75), (136), с которыми необходимо дифференцировать эту стадию ТКЛК. Обособленно выделяют группу Т-клеточных псевдолимфом кожи (ТПЛК), клинически и гистологически напоминающие ТКЛК (23), (37), (109). Клиническая картина ТПЛК достаточно разнообразна и может проявляться пятнами, бляшками и состояниями эритродермии, характерными для ТКЛК (67), (188). По данным Потекаева Н.С. и соавт. (24), из 27 наблюдаемых пациентов у 18 кожный процесс развивался по типу эритродермии, в остальных случаях клиническая картина была представлена инфильтрированными пятнами и бляшками, а также опухолевидными инфильтратами, что полностью совпадало с картиной ТКЛК. В этом случае проводить клиническую дифференциальную диагностику без дополнительных методов исследования не представлялось возможным. Однако, в некоторых случаях для предположения диагноза ТПЛК достаточно клинико-анаменестических данных и динамического наблюдения, особенно если врачу удается установить провоцирующий фактор, а на фоне его отмены зафиксировать регресс симптомов заболевания (23). В со-мнительных случаях, для исключения неоплазии, дифференциальный диагноз возможен только при комплексном обследовании пациента с применением дополнительных методов исследования (24), (41), (46), (137).
Иммуногистохимический метод исследования
ИГХ исследование использовалось для идентификации нозологических форм ЛК. 1. Нанесенные на предметные стекла со специальным адгезивным покрытием парафиновые срезы нагревают в течение 30с. до температуры, несколько превышающей температуру плавления парафина, выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 24 часов, затем погружают в ксилол для растворения парафина, после чего проводят по батарее 100%, 95% и 80% спиртов. После депарафинизации срезы переносят в дистиллированную воду, затем – в ТРИС- или фосфатный буфер (pH – 7,4-7,6). 2. Для подавления эндогенной пероксидазной активности клеток срезы в течение 20 минут обрабатывают 3% раствором перекиси водорода в метаноле, после чего стекла отмывают в ТРИС- или фосфатном буфере. Далее проводят демелирование антигенов при нагревании в водяной бане (температура 98С) (рН - 6,0 или рН - 9,0) 2 раза при использовании F1 или обработке протеолитическими ферментами в течение 30 мин при температуре 37 С, после чего стекла также промывают в ТРИС-буфере. 3. Затем на срезы наносятся первичные антитела, с которыми они инкубируются 30 мин. при 37 С, после чего их тщательно промывают в нескольких порциях буфера. Для визуализации использовали высокочувствительную полимерную систему BioGenex. ИГХ исследование проводилось с использованием линейно ограниченных и дифференцировочных антигенов. Данные представлены в Таблице 2.3. 4. Далее срезы докрашивают гематоксилином Майера и дифференцируют в щелочном растворе до получения голубого окрашивания. 5. По стандартной методике стекла обезвоживают и заключают в бальзам для последующего исследования. 6. Результаты ИГХ исследования оценивают и ставят окончательный диагноз. Таблица 2.3 Панель используемых в работе моноклональных и поликлональных антител Название антитела, клон, фирма -производитель Характеристика Специфичность CD 1а Белок, молекулярный вес от 43 до 49 кДа, экспрессируется на дендритных клетках и тимоцитах. Клетки Лангерганса CD 2 Т-клеточный поверхностный антиген, Т11/Leu-5, LFA-2, рецептор к LFA-3, мембранный белок, молекула межклеточной адгезии, экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов и клеток киллеров. Т-клетки, NK-клетки CD 3клон F7.2.38(Dako) CD 3 комплекс, состоящий из 6 полипептидов и образующий 3 димера /, /, / c мол. массой20-26 кДа. Все зрелые Т-клетки, независимо отпринадлежности к TCR / или TCR /.Экспрессируется тимоцитами в зависимости отстепени дифференцировки CD 4клон 1F6(Novocastra) Антиген с мол. массой 55 кДа. Субпопуляции тимоцитов, Т-лимфоцитов, хелперы/индукторы, моноциты/макрофаги CD 5клон CD5/54/F6(Dako) Антиген с мол. массой 67 кДа. Ранние тимоциты, зрелые Т-клетки (сильная экспрессия); субпопуляция В-клеток CD 8клон C8/144B(Dako) Трансмембранный гликопротеин, состоящий из-цепи с мол. массой 32-34 кДа и -цепи с мол.массой 30-32 кДа. Большинство тимоцитов, маркер Т-клеток-киллеров, клетки-естественные киллеры CD 20 клон L 26 (Dako) Негликолизированный белок, мол.массой 33, 35и 37 кДа. В-клетки CD 23клон MHM6(Dako) Интегральный гликопротеин II типа, мол. массой 45 кДа. В-клетки, в том числе активированные,моноциты, фолликулярные дендритическиеклетки, клетки Лангерганса CD 30 клон BerH2 (Dako) Ki-1-антиген, член семейства рецепторов факторов некроза опухоли, мол. массой 120 кДа Активированные Т- и В-лимфоциты и моноциты,клетки- естественные киллеры, опухолевыеклетки лимфомы Ходжкина, анапластическойкрупноклеточной лимфомы CD56 (NCAM) Молекулы адгезии Клетки-естественные киллеры, активированныеТ-клетки CD 138Клон MI15(Dako) Гепарансульфатпротеогликан (синдекан-1) с мол. массой 85 кДа. Плазматические клетки, пре-В-клетки (слабая интенсивность), активированные В-клетки Kappa light chainполиклональное(Dako) Легкая каппа-цепь Ig В-клетки фолликулов лимфатического узла, плазматические клетки Lamda light chainполиклональное(Dako) Легкая лямбда-цепь Ig В-клетки фолликулов лимфатического узла, плазматические клетки. Ki-67клон MIB 1(Dako) Антиген пролиферативной активности - ядерный белок с мол. массой 345, 395кДа. Экспрессируется клетками в поздней G1, S, G2, M-фазах клеточного цикла, отсутствует в Go –фазе. BCL-2клон bcl-2/100/D5(Novocastra) Онкопротеин Ингибитор апоптоза HLA-DR (Dako) Маркер апоптоза. Мембранный гликопротеин. Маркер апоптоза GranzymeB/Perforinклон GrB-7(Dako) Нейтральная сериновая протеаза c мол. массой 29 кДа Локализуется в специализированных литических гранулах цитотоксических Т-лимфоцитов и ЕК-клеток TIA-1 (abcam) Т-клеточный внутрицитоплазматический антиген Покоящиеся клетки-естественные киллеры 2.2.3. Молекулярно-генетический метод Взятие образцов, выделение ДНК из биопсийного материала Взятие образцов Биопсийный материал помещается в чистую пробирку с физиологическим раствором. Из биопсийного материала ДНК выделяли методом лизиса в аммиаке и высаливали белки в уксусной кислоте. Фрагмент ткани 2х2х2мм помещали в пробирку с закручивающейся крышкой, добавляли 900 L NH4OH 25% и 100 L 10% SDS. Инкубировали при 55-57С в течение 1-2 суток при постоянном помешивании. Жидкую часть (900 L) переносили в новую пробирку. К жидкой части добавляли 300 L 17М уксусной кислоты, перемешивали 10 минут, центрифугировали 10 минут при 13000g. К супернатанту добавляли 3 объема этанола. Центрифугировали при 13000g 10 минут. Осадок ДНК дважды промывали 70% спиртом, высушивали на воздухе, растворяли в 50 L воды.
При выделении из парафинового блока ткань предварительно депарафинизировали. Для этого 3 среза по 10 микрон помещали в пробирку, ее нагревали 10 мин при 95С в буфере STEx1. Центрифугировали 30 сек при 5000g, оставляли на льду на 10 мин. Удаляли скальпелем парафиновый диск. Кусочки депарафинизированной ткани переносили в чистую пробирку.
Определение Т-клеточной клональности проводили на основе анализа перестроек вариабельного региона TCR. Определение В-клеточной клональности проводили на основе анализа вариабельного региона IgH. Для мультиплексной ПЦР определения клональности по реарранжировкам генов TCR применяли два набора праймеров: 1) смесь праймеров T, последовательности которых опубликованы в протоколе Biomed-2 (74); 2) смесь праймеров Туу, последовательности которых опубликованы в работе Greiner (92).
Для очистки ПЦР-продуктов в каждую пробирку добавляли по 100 мкл смеси для осаждения ДНК (ацетат аммония, этиловый спирт, вода), инкубировали 20 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 13000g. Осадок ДНК дважды отмывался 70% спиртом, высушивался при комнатной температуре, разбавлялся дистиллированной водой 30 мкл. Концентрация очищенных продуктов проверялась в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В зависимости от интенсивности свечения ПЦР-продукты разводились в 10-40 раз. Разведенные продукты смешивались с формамидом (2 мкл продукта, 10 мкл формамида, 0,05 мкл внутреннего стандарта Genescan 500LIS (Applied Biosystems, Германия)). Денатурировались при 95С в течение 2 мин и помещались в лед на 10 мин. 10 мкл денатурированного продукта наносилось в плашку автоматического секвенатора. Для фрагментного анализа использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, Германия) и компьютерное обеспечение GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems, Германия). Критерии интерпретации результатов.
Результат фрагментного анализа был виден как набор пиков в области амплификации T – 80 – 255 п.н., T – 90– 280 п.н., IgH FRI – 310 – 360 п.н., IgH FRII – 250 – 295 п.н., IgH FRIII – 100 – 170 п.н.
Отрицательный (поликлональный) результат определяли при наличии множества пиков ПЦР-продукта. Результат считался положительным (моноклональным) при наличии одного или двух четких доминантных пиков ПЦР-продукта (в случае биаллельной реарранжировки). При этом пики ПЦР-продукта должны были преобладать и превышать поликлональный фон более чем в 3 раза. Если имелось более 3-х четких пиков, то результат оценивался как олигоклональный. При наличии одного или двух четких пиков, которые превышали поликлональный фон в 2-3 раза, результат оценивался как сомнительный моноклональный.
Использование клинических, гистологических и иммуногистохимических методов исследования в диагностике лимфом кожи и их клинических разновидностей
Первый этап дифференциальной диагностики проводился на основе изучения клинических особенностей болезни у 181 пациентов. На основании клинической картины были выделены 5 патогномоничных признаков, такие как пятна, бляшки, узлы, зуд и лимфоаденопатия, позволяющие заподозрить у этих больных лимфопролиферативное заболевание (6).
Все обследованные пациенты были разделены на 3 группы: 1 (ТКЛК 1ст, парапсориаз и экзема) группа характеризовалась наличием только пятен, 2 (ТКЛК 2ст., парапсориаз, атопический дерматит и ТПЛК) группа – папулами и бляшками, 3 (ТКЛК 3ст., ВКЛК и ВПЛК) группа – узлами.
Во 2 группу было включено 94 пациентов, клиническая картина которых требовала дифференциальной диагностики между 2 стадией ТКЛК, парапсориазом, атопическим дерматитом, псориазом и псевдолимфомой кожи(табл.3.2). Таблица 3.2 Клинические признаки заболеваний и р сравниваемых признаков у пациентов 2 группы.
Клиническе признакиДиагноз (1)ТКЛК 2 ст. п=24 (2)1111 п=20 (3)АД п=20 (4)Пс п=20 (5)ТПЛК п=10 p (1)&(2) p (1)&(3) р (1)&(4) р (1)&(5) р (2)&(3) р (2)&(4) р (2)&(5) р (3)&(4) р (3)&(5) р (4)&(5)
Лимфо-аденопатия 24 (100%) 0 0 0 0 0,001 0,001 0,001 0,001 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Как видно из табл. 3.2, при 2 стадии ТКЛК бляшки, лимфоаденопатия и зуд присутствовали в 100%, а пятна - в 77% случаев. При крупно- и мелкобляшечном парапсориазе бляшки отмечались в 100% случаев, пятна и зуд в 40% и 48% случаев соответственно. При атопическом дерматите, псориазе и Т-ПЛК бляшки и зуд были в 100%, а пятна – только в 45% случаев.
Таким образом, различия между представленными группами были статистически большими, чем в 1 группе пациентов (p 0,05) и использование этих клинических признаков позволяло поставить диагноз 2 стадии ТКЛК с большей вероятностью, по сравнению с больными 1 группы (p 0,05).
Таким образом, по результатам клинико-гистологического исследования у 57 пациентов с ТКЛК диагноз установлен на 2 и 3 стадиях в 100% случаев, тогда как на 1 стадии ТКЛК диагноз верифицирован только в 22,81% случаев (р 0,05) Клинический пример № 1
Больная А., 76 лет, поступила в отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ в сентябре 2007 года с жалобами на зудящие эритематозные высыпания на коже лица, шеи, туловища, верхних и нижних конечностей.
Считает себя больной около 25 лет, когда впервые появились высыпания ярко розового цвета, на туловище и верхних конечностях, сопровождающаяся зудом. Лечилась самостоятельно, принимая антигистаминные препараты, после приема которых, отмечала улучшение в виде прекращения зуда и полного регресса высыпаний. Эпизоды обострений наблюдались на протяжении следующих 3 лет, также снимающиеся антигистаминными средствами. Спустя 19 лет после внезапного подъема температуры тела до 39С и появления новых высыпаний на коже, сопровождающееся мучительным зудом была госпитализирована в ГКБ в дерматовенерологическое отделение с диагнозом «Хроническая рецидивирующая крапивница», где проводилось лечение преднизолоном 30 мг внутривенно, антигистаминными и десенсибилизирующими препаратами На фоне лечения высыпания побледнели, самочувствие улучшилось. Однако, спустя 4 года в связи с обострением кожного процесса и появлением новых высыпаний, сопровождающиеся сильным зудом была госпитализирована в отделение дермотовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ для диагностики и лечения.
При осмотре процесс подостровоспалительного распространенного характера. Локализуется на коже лица, шеи, туловища, верхних и нижних конечностей. Представлен пятнами и бляшками, диаметром от 2 до 15 см, округлых и неправильных очертаний, ярко-розового цвета с фиолетовым оттенком, резко отграничены от окружающей здоровой кожи, поверхность шероховатая с мелко пластинчатым шелушением на поверхности. Высыпания имеют плотноватую консистенцию, склонны к слиянию, сопровождаются сильным мучительным зудом (Фото №1).
При гистологическом исследовании эпидермис с гипер-паракератозом, умеренно выраженным акантозом, фокусами спонгиоза. Сосочковый слой фиброзирован. В верхних отделах дермы определяются очаговые мелкоклеточные лимфоидные инфильтраты с примесью гистиоцитов. Присутствуют фокусы не резко выраженного эпидермотропизма. Среди мелки лимфоидных клеток присутствуют клетки и атипией ядер. В дерме-единичные скопления меланофагов. Заключение: морфологическая картина не противоречит ТКЛК, грибовидному микозу, бляшечной стадии (Фото №2).
Сравнение диагностических критериев гистологического и молекулярно-генетического методов исследования
Было определено минимальное количество ДНК, требуемое для успешного проведения ПЦР. Для этого в ПЦР брали различные (6000нг, 2000нг, 1000нг, 500нг, 100нг, 50 нг, 20 нг, 5 нг, 1 нг) количества ДНК клеточной линии Jurkat и поликлональной ДНК, выделенной Т-лимфоцитов периферической крови здорового донора. Минимальное количество ДНК, с которым проходит ПЦР, - 20 нг. В 20нг геномной ДНК содержится примерно 2000 клеточных геномов, таким образом, ПЦР проходит с ДНК, состоящей из 2000 Т-лимфоцитов.
Чувствительность определения метода PCR-FACRy определяли, смешивая в разных пропорциях ДНК клеточной линии Jurkat, которая имеет биаллельную перестройку V 11 -J и V 1-8-J , с ДНК, выделенной из Т-лимфоцитов периферической крови. Моноклональный пик для перестройки V 11-J определяется при наличии 2% и более опухолевых клеток от общего количества Т-лимфоцитов в образце, тогда как для перестройки V 1-8-J при наличии 10-15% и более опухолевых клеток в образце от общего количества Т-лимфоцитов. Таким образом, чувствительность данного метода зависит от характера перестройки в опухолевых клетках. Для большинства перестроек (на перестройки V 1-8-J приходится 80% всех перестроек) чувствительность не превышает 10-15% опухолевых клеток от Т-лимфоцитов. Таким образом, минимальное количество опухолевых Т-лимфоцитов, которое возможно определить методом PCR-FACR, составляет 200-300 опухолевых Т-клеток на 2000 всех Т-лимфоцитов в образце.
Больной В., 65 лет, механизатор, поступил в отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ в марте 2009г с жалобами на зудящие высыпания на коже туловища и конечностей, опухолевидный очаг поражения на левой боковой поверхности туловища.
Болен в течение 5 лет, когда впервые отметил появление зудящих светло-розовых пятен на коже грудной клетки. Начало заболевания связывал с психоэмоциональным стрессом. С диагнозом парапсориаз лечился у дерматолога по месту жительства наружными кортикостероидными препаратами с временным эффектом. После перенесенного стресса высыпания стали более яркими, зуд усилился. В связи с этим был госпитализирован в наше отделение, где при гистологическом исследовании установлен диагноз крупнобляшечного парапсориаза. Проведено десенсибилизирующее лечение, которое привело к значительному улучшению – высыпания побледнели и уплостились. Спустя 2 года больной отметил обострение течения кожного процесса, очередной раз был госпитализирован в кожную клинику, проведенное патоморфологическое исследование подтвердило диагноз крупнобляшечного парапсориаза, моноклональность методом PCR-SSCPCR. не выявлена. Через 3 года появились новые зудящие высыпания на коже туловища и верхних конечностей, при исследовании биоптатов кожи методом PCR-FACR (с пятен и бляшек), в биоптате с бляшки была выявлена клональная перестройка -цепи Т-клеточного рецептора (Рис. №9).
При осмотре кожный процесс носил распространенный, симметричный характер и был представлен множественными бляшками розового цвета овальной формы с четкими границами; на левой боковой поверхности туловища, на фоне одного из очагов имелся плоский узел неправильной формы размером 32,9 см, мягко-эластической консистенции (Фото №11). При повторном гистологическом исследовании через 3 месяца в биоптате из крупной, возвышающейся над уровнем кожи бляшки обнаружена периваскулярная инфильтрация с не резко выраженными признаками эпидермотропизма и обнаружением клеток с церебриформными ядрами, был установлен диагноз: грибовидный микоз, бляшечная стадия (Фото №12).
При иммунофенотипическом исследовании (с использованием антител к СD3, СD4, СD5, СD7, СD20, Рerforin, bF1, СD30, Ki67) - типичная для грибовидного микоза экспрессия в лимфоцитарном ингфильтрате СD3+, СD4+, СD5+, СD7-, bF1 клеток. Проведение лечения проспидия хлоридом (по 0,1г внутримышечно, ежедневно, на курс 30 иньекций), гипосенсибилизирующими и антигистаминными препаратами привело к выраженному клиническому эффекту с прекращению зуда, почти полному разрешению пятен и бляшек, и значительным уплощением опухолевидного очага.
