Введение к работе
Актуальность проблемы. Базальноклеточный рак (БКР) кожи или базалиома является одной из наиболее часто встречающихся опухолей кожи [Курдина М.И. с соавт.,1992; Шумай Н.И., 1993; Boring СС et al., 1991; Weinstock MA, 1994]. Традиционно БКР занимает третье место по частоте среди всех опухолевых заболеваний (после рака желудка и легких), а среди злокачественных эпителиальных новообразований кожи составляет от 75 до 90% [Dahl Е et al.,1992; Preston DS, Stem RS, 1992]. Чаще БКР характеризуется относительно доброкачественным течением, в разной степени выраженным местнодеструирующим ростом и редким метастазированием [Апатенко А.П.,1973; Miller S.J.,1991; Goldberg L.N.,1996]. В то же время данная опухоль имеет способность рецидивировать, при этом частота ее рецидивирования варьирует от 1 до 39% в зависимости от используемых методов лечения первичного очага поражения [Кусов В.В.,1990; Silverman М.К. et al.,1991]. В то же время рядом авторов отмечена тенденция роста заболеваемости БКР [Karagas M.R.,1994; Maia М. et al.,1995; MillerD.L.,1994]. Актуальность проблемы обусловлена также недостаточной изученностью вопросов этиологии и патогенеза данного новообразования и необходимостью повышения эффективности лечения(Писклакова Т.П., Ильин И.И.,1990; Motley R.J. et al.,1995; Roenigk R.K. et al.,1986 ]. Для изучения особенностей гисто- и патогенеза БКР, оценки воздействия противоопухолевых агентов и исследования других медико-биологических аспектов необходимо моделирование БКР вне человеческого организма.
С разработкой методов культивирования клеток вне организма появилась возможность использовать клеточные культуры для исследования проблем канцерогенеза, морфогенеза, дифференцировки и пролиферации клеток, изучения действия тех или иных средств на физиологические и кинетические параметры клеток, скрининга лекарственных препаратов и для некоторых других проблем клеточной биологии [Скрипкин Ю.К. с соавт.,1994;- Васильев А.В. 1993; Boudief М. Et al.,1990]. Получение культуры первичных кератиноцитов позволило решать многие проблемы патогенеза кожных заболеваний, пренатальной диагностики ряда генодерматозов, задачи
практической дерматологии и тканевой инженерии [Мордовцев В.Н. с соавт., 1988]. В настоящее время методы культивирования эпидермальных кератиноцитов хорошо разработаны [Терских ВВ., Васильев А.В.,1995; Rheinwald J.G., Green Н.,1975,1977].Кроме того, получено большое количество перевиваемых клеточных линий из эпителиальных опухолей человека [Fabricant R.N. et al., 1977; Rheinwald J.G., Beckett M.A.,1981]. Базалиома в этом смысле является исключением. Число работ по изучению БКР в культуре весьма ограниченно, что связано с трудностями, возникающими при переносе биопсийного материала в условия культуры [Asada М. et al.,1992; Brysk MM. et al.,1992]. Многие попытки выращивать клетки БКР в культуре оканчивались неудачей или получаемые культуры не могли быть с уверенностью идентифицированы как «базалоидные» из исходной опухоли [Bradbeer М. et al.,1988; Hernandez A.D. et ai.,1985]. В отдельных работах описаны некоторые морфологические , кинетические и гистохимические параметры клеток БКР in vitro. Была также сделана попытка использования культуры клеток БКР в качестве тест-системы для исследования действия интерферона-альфа и интерферона-гамма на рост опухолевых клеток [Brysk М.М. et al.,1992].
Между тем, культура клеток исследуемой опухоли может служить хорошей моделью для оценки антипролиферативного эффекта тех или иных противоопухолевых агентов [Boucler М.,1990] Тестирование лекарственных средств на клеточных культурах является более чувствительным, быстрым и дешевым методом, чем использование с этой целью лабораторных животных [Мымрина И.А. с соавт, 1992]. Кроме того, накапливающиеся результаты клинических и экспериментальных исследований показывают, что опухоли даже идентичной морфологии часто в разной степени чувствительны к действию цитостатических препаратов. Поэтому чрезвычайно важным является развитие методов для подбора «направленной» химиотерапии, специфичной для данной опухоли и данного пациента.
Цель настоящей работы: разработать новые подходы к совершенствованию дифференциальной диагностики и лечения БКР кожи на основе использования культуры клеток.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи исследования:
-
Разработать метод получения и культивирования клеток БКР in vitro.
-
Изучить ультраструктуру клеток БКР в культуре.
-
Оценить возможность использования культуры клеток для дифференциальной диагностики различных форм БКР на ультраструктурном уровне.
-
Разработать модель тестирования противоопухолевых препаратов в культуре клеток БКР.
-
Провести сравнительное изучение действия проспидина, циклофосфана и гаммаферона на пролиферацию клеток в культурах БКР, перевиваемой линии эпидермоидной карциномы А-431 и эпидермальных кератиноцитах, выделенных из кожи здоровых доноров.
-
Оценить возможность использования культуры клеток БКР для индивидуального подбора противоопухолевых препаратов.
Научная новизна исследования:
Впервые разработан метод получения культуры клеток БКР из биопсийного материала больных и использованы методы культивирования клеток БКР в средах с разным содержанием ионов кальция.
Описаны особенности поведения клеток БКР in vitro в различных условиях культивирования. Проведено сравнение с культурой эпидермальных кератиноцитов, выделенных из кожи здоровых доноров и культивируемых в аналогичных условиях, по морфологическим параметрам и скорости роста.
Изучены ультраструктурные особенности клеток в культурах БКР с разным типом клеточной дифференцировки. Показана возможность использования электронно-микроскопического исследования культуры клеток для дифференциальной диагностики опухолей и оценки эффективности различных методов лечения.
Впервые проведена сравнительная оценка воздействия противоопухолевых препаратов (проспидина и циклофосфана) и иммуномодулятора ( гаммаферона) на пролиферацию клеток в культурах БКР, эпидермоидной карциномы А-431 и эпидермальных кератиноцитах выделенных из кожи здоровых доноров.
Впервые показано, что проспидин и циклофосфан значительно сильнее ингибируют пролиферацию опухолевых клеток в культурах БКР и
эпидермоидной карциномы, чем эпидермальных кератиноцитов человека, выделенных из кожи здоровых доноров. Обнаружено усиление ингибирования пролиферации опухолевых клеток в культуре при совместном применении цитостатиков и гаммаферона.
Показана корреляция между антипролиферативным действием проспидина в культуре клеток и его противоопухолевым клиническим эффектом. Обоснована возможность использования культур клеток БКР, полученных из биопсийного материала от конкретных больных, для предварительного отбора эффективных препаратов.
Практическое значение:
Разработанная клеточная система позволяет проводить предварительную оценку перспективных противоопухолевых препаратов с целью их дальнейшего внедрения в клиническую практику.
Полученные результаты по совместному действию проспидина и гаммаферона на пролиферацию опухолевых клеток позволяют рекомендовать их комплексное использование в клинической практике для лечения различных форм БКР.
Культивирование клеток от конкретных больных дает возможность индивидуального подбора и прогнозирования клинической эффективности противоопухолевых препаратов, сокращению сроков лечения за счет подбора курсовых доз, уменьшению числа рецидивов, позволит избежать развития осложнений от применения больших курсовых доз цитостатиков и возникновения устойчивости к ним.
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработан метод получения культур клеток БКР из биопсийного материала больных и культивирования в средах с различным содержанием ионов кальция. При культивировании в среде с низким содержанием кальция (0,1мМ) клетки БКР не образуют многослойную структуру и обладают более высоким пролиферативным потенциалом, что делает такую культуру удобной для проведения различного рода исследований.
-
В условиях in vitro клетки БКР сохраняют основные морфологические и пролиферативные параметры , свойственные клеткам БКР в организме.
Однако, клетки первичной культуры БКР отличаются по морфологии и скорости роста от культуры клеток эпидермальных кератиноцитов, выделенных из кожи здоровых доноров и культивируемых в аналогичных условиях.
-
В условиях культуры клетки БКР сохраняют тканеспецифические и цитоспецифические признаки, присущие клеткам опухоли в состоянии in vivo.
-
Созданная клеточная модель БКР позволяет в условиях in vitro проводить оценку действия противоопухолевых препаратов по степени угнетения ими пролиферации клеток данной опухоли. Использование эпидермальных клеток разной степени трансформации дает возможность в полной мере оценить антипролиферативный эффект препаратов и осуществить предварительный отбор перспективных лекарственных средств с целью их дальнейшего внедрения в клиническую практику для лечения различных форм БКР.
-
Предложено использование культур клеток БКР , выделенных из биопсийного материала конкретных больных , для индивидуального подбора противоопухолевых препаратов, прогнозирования их клинической эффективности и корректировки курсовых доз цитостатиков.
Апробация работы:
Материалы диссертации доложены на VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996г.), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ (Москва, 1996г.), на XVII научно-практической конференции дерматологов и венерологов Хабаровского края (Хабаровск, 1996г.), на Республиканском научном симпозиуме «Пролиферативные заболевания кожи» (Москва, 1996г.), на заседании Московского городского научного общества дерматологов и венерологов (Москва,1997г.)
Структура диссертации:
Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована
56 рисунками, 18 таблицами. Библиографический указатель включает 62 отечественных и 133 иностранных источников.
