Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Развитие представлений о диагностике ГМ 11
1.2 Бляшечный парапсориаз и его отношение к ГМ 26
1.3 Критерии диагностики ГМ 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1 Общая характеристика больных 36
2.2 Проведение диагностической биопсии кожи 40
2.3.1 Гистологическое исследование 43
2.3.2 Непрямой иммуногистохимический метод исследования 45
2.4 Статистический анализ 54
Глава 3. Результаты собственных исследований 55
Заключение 81
Выводы 87
Практические рекомендации 88
Список условных сокращений 89
Список литературы 91
- Развитие представлений о диагностике ГМ
- Общая характеристика больных
- Гистологическое исследование
- Статистический анализ
Введение к работе
Актуальность исследования. Лимфомы кожи (ЛК) представляют собой гетерогенную группу злокачественных заболеваний лимфоидной ткани, отличающихся по клиническим проявлениям, течению, прогнозу и подходам к лечению [Кубанова А.А. и соавт., 2008; Song S.X., Kim Y.H., Willemze R. et al., 2007; Willemze R., 2011; Sarantopoulos G.P., Palla B., 2013]. Особенностью данной группы заболеваний является первичное развитие клональной пролиферации лимфоцитов в эпидермисе, дерме и гиподерме с возможностью вторичного распространения на другие органы и ткани [Белоусова И.Э. и соавт., 2007; Kim Y.H., Willemze R. et al., 2007].
Вследствие клинической и морфологической разнородности и
относительно редкой встречаемости диагностика ЛК бывает невозможна без применения дополнительных методов исследования [Самцов А.В. и соавт., 2006; Willemze R., 2012; Poppe L.M., 2013; Benton E.C. et al., 2013; Cerroni L., 1994; Pimpinelli N. et al., 2005; Stevens S.R., Ke M.S., 2003; Тарасенко Г.Н. и соавт., 2006].
Для диагностики лимфопролиферативных заболеваний кожи
недостаточно только клинического обследования пациентов [Оркин В.Ф. и
соавт., 2006]. Гистологическая диагностика является ценным вспомогательным
методом, но её возможности также ограничены [Massone C., Kodama K., 2005;
Santucci M., Biggeri A., 2000]. Способы определения реаранжировки гена Т-
клеточного рецептора клеток инфильтрата с помощью ПЦР или блоттинга по
Саузерну не являются универсальными из-за невысокой чувствительности и
специфичности в начальных стадиях ЛК. [Kandolf Sekulovi L. et al., 2007; Ponti
R. et al., 2008; Bachelez H. et al., 1995; Xu C., Tang Y., 2010; Goeldel A.L., 2010].
В настоящее время получил широкое распространение и все чаще используется
иммуногистохимический метод диагностики, позволяющий проводить
идентификацию клеточного состава пораженной кожи [Бабиченко И.И. и соавт., 2008; Ламоткин И.А. и соавт., 2005; Berger et al., 2002; Der-Petrossian M. et al., 2011].
Грибовидный микоз (ГМ) является самой распространенной формой Т-клеточных ЛК. Заболевание встречается во всех возрастных группах с преобладанием у людей старше 50 лет, соотношение мужчин и женщин составляет от 1,5:1 до 2:1 [Keehn C.A., Hwang S.T., 2008; Wilson et al., 2012; Thomas B.R., 2012; Assaf C., 2007; Yamashita T., 2012; Bittencourt A.L. et al., 2013]. За последние годы отмечается рост случаев заболевания, как ЛК, так и ГМ, в частности. По данным Weinstock и соавторов с 70-е по 90-е годы ХХ века заболеваемость ГМ в США увеличилась в 2,5 раза [Weinstock M.A. et al., 1988; Criscione V.D., 2007].
Трудности диагностики ГМ отражены в исследовании Е.М. Лезвинской и соавторов, в котором показано, что диагноз ГМ устанавливается при первичном посещении врача лишь у одного из четырех пациентов [Лезвинская Е.М. и соавт., 2000]. В работе Н.В. Кунгурова и соавторов также выявлено, что средний срок до установления диагноза, даже у пациентов с классической
формой ГМ, составляет около 5 лет, и может значительно удлиняться при других вариантах его течения [Кунгуров Н.В. и соавт., 2010].
Наиболее часто дифференциальную диагностику пятнистой стадии ГМ проводят с бляшечным парапсориазом (БП), имеющим сходные клинические и патоморфологические изменения [Lazar A.P. et al., 1989; Kikuchi A. et al., 1993; Arai R. et al., 2012]. До настоящего времени не выявлено четких клинических и гистологических дифференциально-диагностических критериев, позволяющих разделить эти заболевания, что определяет необходимость их дальнейшего изучения.
Таким образом, задача совершенствования диагностики
лимфопролиферативных заболеваний кожи представляется актуальной для современной научной и практической дерматологии и патологической анатомии.
Степень разработанности темы
Вопросам изучения дифференциальной диагностики и патогенеза грибовидного микоза посвящены исследования и публикации многих отечественных ученых – И.М. Разнатовского, А.Н. Родионова, Д.В. Казакова, Е.М. Лезвинской, Е.В. Братцевой, и зарубежных коллег – R. Willemze; L.M. Poppe, E.C. Benton, L. Cerroni, N. Pimpinelli.
Оценка гистологической картины кожи больных грибовидным микозом
A.B. Ackerman, L. Cerroni, G. Burg и других исследователей позволила
выполнить дифференциальную диагностику грибовидного микоза с
доброкачественными хроническими дерматозами, имеющими сходные
клинические проявления. Работы по определению реаранжировки гена Т-
клеточного рецептора с использованием ПЦР позволили выявлять
моноклональные лимфоциты, которые определяются у 90-100% больных
бляшечной и опухолевой стадией грибовидного микоза.
Иммуногистохимическое исследование опухолевых клеток дало возможность проводить детекцию их фенотипа у больных грибовидным микозом, что также способствовало более точной диагностике заболевания.
Вместе с тем, находящиеся в распоряжении дерматолога методы
исследования не всегда достаточны для дифференциальной диагностики
пациентов с ранними стадиями грибовидного микоза и бляшечного
парапсориаза, что определяет актуальность дальнейшего поиска
дифференциально-диагностических маркеров этих заболеваний.
Целью исследования является комплексная клинико-морфологическая характеристика больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом для совершенствования их дифференциальной диагностики.
Задачи исследования:
-
Изучить особенности клинических признаков у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.
-
Провести анализ гистологических характеристик кожи у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.
-
Исследовать количество пролиферирующих Т-лимфоцитов у больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.
-
Проанализировать уровень экспрессии маркеров дендритных клеток Langerin/CD207 и CD83 в коже больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.
-
Оценить диагностическую значимость эпидермо-дермального отношения пролиферативной активности клеток (Ki-67+) в коже больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом.
Научная новизна
Наиболее информативными клиническими признаками, на основании которых можно дифференцировать больных пятнистой стадией грибовидного микоза от пациентов с бляшечным парапсориазом, являются слабо шелушащиеся пятна, размерами больше 6 см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, и явления пойкилодермии (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи). Менее значимыми клиническими признаками являются: распространенность высыпаний и феномен одновременного прогрессирования и регрессирования отдельных элементов.
Обнаружено, что относительная площадь экспрессии CD3+Ki-67+-клеток у больных пятнистой стадией грибовидного микоза (0,32% [0,27-0,41]) в 10,7 раз превышает данный показатель у пациентов с бляшечным парапсориазом (0,03% [0,01-0,04]).
Выявлено, что у больных пятнистой стадией грибовидного микоза значительно преобладают незрелые дендритные клетки с маркером Langerin/CD207 и зрелые с маркером CD83.
Коэффициент эпидермо-дермального отношения Ki-67+-клеток у больных пятнистой стадией грибовидного микоза (3,84) в 1,4 раза, а у больных бляшечной и опухолевой стадиями заболевания (2,42) в 2,2 раза ниже, чем у пациентов с бляшечным парапсориазом (5,43) (p<0,05).
Теоретическая и практическая значимость
Установлены закономерности распределения лимфоцитов и маркеров дендритных клеток в эпидермисе и дерме больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом. Выявлено, что в дерме больных грибовидным микозом наблюдается увеличение количества Langerin+-, CD83+-дендритных и CD3+-Ki-67+-клеток. Определено, что при прогрессировании грибовидного микоза идет повышение содержания дендритных клеток (CD207- и CD83-) в пораженной коже.
Научно обоснована необходимость детекции дендритных клеток с
использованием иммуногистохимического метода исследования для
совершенствования диагностики пятнистой стадии грибовидного микоза. При
выявлении относительной площади экспрессии Langerin-позитивных
дендритных клеток 0,9%, определяется высокая диагностическая
информативность данного маркера при установлении диагноза грибовидного микоза (SE 0,87, SP 0,90), и может успешно использоваться в дифференциальной диагностике с бляшечным парапсориазом. Определено, что при значении относительной площади экспрессии CD83-позитивных дендритных клеток 0,5% определяются средние показатели чувствительности
(SE 0,71) и специфичности (SP 0,82) при установлении диагноза грибовидного микоза.
Установлен высокий показатель специфичности (SP 0,89) и умеренный чувствительности (SE 0,63) метода двойной маркировки при определении пролиферирующих Т-лимфоцитов (CD3+Ki-67+-клеток) в диагностике пятнистой стадии грибовидного микоза.
Применение высокоспецифичных гистологических маркеров –
эпидермальных лимфоцитов (SE 0,75, SP 0,86), лимфоцитов с
церебриформными ядрами (SE 0,67, SP 0,85) позволят дифференцировать начальные стадии грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования явилось
последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в
дизайне сравнительного открытого клинического исследования.
Использовались клинические, инструментальные, лабораторные,
статистические методы исследования.
Положения, выносимые на защиту
-
Ведущими клиническими признаками в дифференциальной диагностике пятнистой стадии грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза являются слабо шелушащиеся пятна (размерами больше 6 см), расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, и явления пойкилодермии (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи).
-
Наибольшую специфичность для дифференциальной диагностики пятнистой стадии грибовидного микоза с бляшечным парапсориазом имеют следующие гистологические признаки: эпидермальные лимфоциты крупнее дермальных, лимфоциты в эпидермисе и дерме с церебриформными ядрами.
-
Относительная площадь экспрессии маркеров: CD3-Ki-67, Langerin/CD207, CD83 – имеет высокую диагностическую значимость при дифференциальной диагностике больных начальной стадией грибовидного микоза и бляшечного парапсориаза.
-
Количества пролиферирующих Т-лимфоцитов, CD207- и CD83-дендритных клеток в коже нарастает при прогрессировании грибовидного микоза.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обусловлена
репрезентативностью и достаточностью выборки пациентов, включенных в исследование, объемом проанализированного материала, адекватностью методов исследования. Методологические подходы, использованные в исследовании, корректны и своевременны. Лабораторные исследования осуществлялись на сертифицированном и проверенном оборудовании.
Результаты и материалы исследования были доложены и обсуждены на
Научно-практической конференции с международным участием
«Терапевтическая школа С.П. Боткина и ее вклад в развитие отечественной клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2012 г.), XXX юбилейной Научно-
практической конференции с международным участием «Рахмановским чтениям 30 лет: достижения и перспективы в дерматологии» (Москва, 2013 г.), 22 Конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Турция, Стамбул, 2013 г.), VII Научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2013 г.), Международной научно-практической конференции по военной медицине (Санкт-Петербург, 2013 г.), XXXI Научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские чтения» (Москва, 2014 г.)
По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России.
Полученные результаты и рекомендации успешно используются в
лечебно-диагностической и учебной работе кафедры и клиники кожных и
венерических болезней ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им.
С.М. Кирова» МО РФ, кафедры и клиники кожных и венерических болезней
ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский
университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России, кафедры и клиники
кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО «Северо-Западный
государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России.
Личное участие автора в получении результатов
Настоящее диссертационное исследование лично проводилось автором в
его полном объеме с формированием базы данных и осуществлением
статистической обработки клинико-морфологического материала и
последующим обобщением полученных результатов.
Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, а также в организации и проведении лабораторного и инструментального исследований. Автором проведены гистологические и иммуногистохимические исследования биопсийного материала всех пациентов, включенных в исследование.
Автором сформулированы цель, задачи и основные идеи планирования исследования, разработана методика исследования, выполнены сбор, статистическая обработка материала.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (включающих обзор литературы, характеристику методов исследования, результаты собственных наблюдений и их обсуждение), заключения, выводов, практических рекомендаций и трех приложений. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 218 литературных источников, из которых 37 отечественных и 181 иностранных авторов.
Развитие представлений о диагностике ГМ
Совершенствование диагностики ГМ является актуальной научной задачей в настоящее время. Это определяется неспецифичностью клинической картины заболевания как на начальной стадии, поскольку клинические проявления близки со многими доброкачественными дерматозами [8, 10, 159], так и в прогрессирующих случаях, когда болезнь имеет неклассическое течение [207].
В условиях кожно-венерологического отделения военного госпиталя на 600 коек, главных, центральных госпиталях и Военно-медицинской академии осуществляется лечение больных БП и ГМ. Современных тенденции к сокращению времени нахождения на стационарном лечении больных определяют необходимость наиболее быстрого установления диагноза этих заболеваний для решения вопроса о дальнейшем месте и способах лечения таких пациентов.
Учитывая отсутствие патогномоничных признаков ГМ, высокую значимость приобретают инструментальные методы исследования. Обзор имеющихся литературных данных показал, что находящиеся в распоряжении дерматолога методы диагностики не всегда позволяют установить диагноз лимфопролиферативных заболеваний [65, 159, 191, 207].
Таким образом, сохраняется актуальность поиска новых и совершенствования имеющихся диагностических процедур.
Считается, что первое описание ГМ было дано в 1806 году Д.Алибером под названием «грибовидная фрамбезия», а позже переименовано на «грибовидный микоз», что и закрепилось до нашего времени [40]. За более чем два века накоплен богатый материал, отражающий клинические проявления ГМ.
В настоящее время ГМ подразделяют на классическую форму, описанную Алибером и дополненную Базеном стадиями заболевания [48], и множество его разновидностей. Симптомы, характерные для пятнистой стадии классической (Алибера-Базена) формы ГМ, детально описаны и включают зудящие пятна вариабельной формы и размеров, чаще множественные, больше 5 см в диаметре, расположенные на закрытых от солнца участках тела с явлениями пойкилодермии и напоминающие «пергаментную бумагу». Для второй (бляшечной) стадии характерно появление уплотненных шелушащихся красно-коричневых бляшек. Третья (опухолевая) стадия характеризуется узлами, имеющими склонность к изъязвлению [18, 41, 92, 105, 153,193].
В диагностическом плане наиболее трудной является пятнистая стадия ГМ [41, 153, 193]. Необходимо учитывать особенность течения заболевания, а именно периодическое нередко одновременное возникновение прогрессирования одних и регресса других высыпаний, что является важным диагностическим признаком.
Следующим историческим этапом изучения и совершенствования диагностики ГМ является внедрение гистологического исследования во второй половине XIX века. Именно с этого времени ГМ стал рассматриваться как онкологическое лимфопролиферативное заболевание, чему способствовали работы Heinrich Kobner, Xavier Gillot и Louis Antoine Ranvier, которые одними из первых описали гистологические особенности лимфом кожи [93]. В XX веке гистологическое исследование ГМ стало одним из важнейших методов диагностики этого заболевания [204]. На основании гистологической картины появилась возможность дифференцировать ГМ с доброкачественными хроническими дерматозами, имеющими сходные клинические проявления [32, 66]. В 70-х – 90-х годах XX века одним из основных направлений изучения ГМ стала диагностика его начальной наименее информативной пятнистой стадии. В соответствии с этим предпринимались попытки выделить дифференциально-диагностические критерии и разработать алгоритм диагностики [179, 171, 151, 183]. Полученные результаты позволили лучше описать и точнее ориентироваться в гистологических особенностях стадий ГМ, но не всегда помогали обнаружить начальные признаки болезни [205].
Современные гистологические критерии различных стадий ГМ перечислены в таблице 1.1 [4, 151, 159, 179, 184].
Использование молекулярно-генетических методов для диагностики грибовидного микоза активно развивается [86].
Группа исследователей в 2003 г. изучала ДНК с применением микрочипов и выявлила около 27 генов (включая онкогены и гены апоптоза), отличающиеся у пациентов с ранними и поздними стадиями ГМ от здоровых людей [194]. Сходное исследование было проведено другой группой ученых, которые также выделелили три кластера генов, изменения в которых характерны для ГМ. Причем, два из них встречаются при ранних стадиях ГМ, а один – при поздних [180].
Обнаружено, что такие онкогены, как p16 и p53, не изменены в ранних стадиях ГМ, но их экспрессия меняется при прогрессировании заболевания [150]. Нарушения экспрессии генов JUNB и JUND у пациентов с ГМ были обнаружены в нескольких исследованиях [139, 140, 141, 149]. Мутации гена FAS также связывают с ГМ [77].
Хромосомные абберации при крупноклеточной трансформации ГМ включают перестройку хромосом 1,2,7,9,17 и 19. Амплификация идет в следующих локусах хромосом: 1p36, 7,9q34, 17q24-qter, 19, делеция - в участках: 2q36-qter, 9p21 и 17p. Выявлена прогрессия заболевания, связанная с потерей гетерозиготности в специальном локусе 10 хромосомы [139]. Обнаружена делеция генов супрессоров опухоли BCL7A, SMACA, DIABLO, RHOF посредством сравнительной геномной гибридизации [64].
Общая характеристика больных
Исследование групп больных грибовидным микозом и бляшечным парапсориазом проводилось в клинике кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии.
Обследован 21 больной ГМ: мужчин - 18 (86%), женщин - 3 (14%), 21 больной БП: мужчин - 18 (86%), женщин - 3 (14%) (Таблица 2.1) (Рисунок 2.1). В качестве контроля изучали группу 16 здоровых доноров, не имеющих ГМ и БП: мужчин - 12 (67%), женщин - 4 (33%). Возраст больных ГМ составлял (Mm): от 52 до 88 (65,3±2,08%) лет, возраст больных БП - от 44 до 76 (61,3±2,1%) лет, возраст доноров - от 38 до 65 (53,3±2,5%) лет (Рисунок 2.2). Пациенты с ГМ были подразделены на две группы: с пятнистой стадией (9 человек) и с бляшечной и опухолевой стадиями (12 человек). Все больные находились на стационарном или амбулаторном лечении в клинике кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова в период с 2000 по 2013 гг.
Все пациенты были клинически обследованы. Обследование включало осмотр дерматолога и гематолога, УЗИ органов брюшной полости и малого таза, клинический и биохимический анализы крови, рентгенографию органов грудной клетки, компьютерную томографию органов грудной клетки, брюшной полости и малого таза (у больных бляшечной и опухолевой стадией ГМ), трепанобиопсию костного мозга (у больных бляшечной и опухолевой стадией ГМ). Ни в одном случае не было выявлено внекожных очагов лимфопролиферативного процесса.
Все пациенты с ГМ получали лечение в соответствии с клиническими рекомендациями Российского общества дерматовенерологов и косметологов (2010). Выбор метода терапии был обусловлен тяжестью кожного процесса, эффективностью предыдущих методов лечения, наличием сопутствующей патологии. Больным ГМ проводилась системная терапия, включающая: проспидин: 100 мг/сут в/м или в/в, на курс 3-6 г. При отсутствии эффекта от лечения назначали метотрексат от 25 до 75 мг в неделю. Наружная терапия включала топические глюкокортикостероиды I класса. Больные БП после проведенного гистологического исследования находились под наблюдением.
Объектами исследования были пораженные участки кожи 21 больного ГМ и 21 больного БП, участки кожи 16 здоровых лиц (полученные после пластических операций), взятые методом панч-биопсии. Для проведения панч-биопсии применяли одноразовый стерильный трубчатый нож диаметром 6 мм («Bloodline», Италия) (Рисунок 2.3, 2.4). Использовали инфильтрационную анестезию 2% раствором лидокаина.
Кусочки для гистологической обработки вырезали так, чтобы в микроскопическом срезе сохранялись топографические соотношения, характерные для исследуемого материала. Блоки для проводки вырезали после фиксации.
Биоптат кожи помещали в емкость с фиксатором, объем фиксирующей жидкости превышал в 10–20 раз объем фиксируемого объекта. Если объект был разрезан на фрагменты толщиной более 5–6 мм, его оставляли в фиксаторе на 2–3 часа для уплотнения, после чего ткань рассекали на пластины толщиной 2–3 мм и помещали в свежий раствор фиксатора. Общее время фиксации при комнатной температуре (около 20С) составляло от 18 до 24 часов. В повседневной работе в качестве фиксирующей жидкости использовали 10% раствор формалина или цинк-формалин, который обеспечивает сохранение антигенных детерминант для проведения иммуногистохимических исследований.
Обезвоживание и пропитывание парафином биоптатов кожи проводили вручную по восходящим спиртам (70%, 80%, 90% и 100%) в аппарате гистологической проводки тканей «Leica Peloris» («Leica Microsystems», Германия), заливали в парафин.
Срезы приготовляли толщиной 3–4 мкм. Использовался микротом ротационный Accu-CutSRM200. С каждого парафинового блока делали 3–4 препарата для гистологических окрасок, на каждом препарате размещали 1–2 среза. Одну часть препаратов окрашивали гематоксилином-эозином, с другой частью материала проводили иммуногистохимическое исследование.
Препараты, окрашенные гематоксилином-эозином, подвергались микроскопическому исследованию. Использовался световой микроскоп «Olympus BX-51» (Япония), оборудованный цифровой камерой «Olympus XС-10» и программным обеспечением «Cell А» (Рисунок 2.5). Исследование эпидермиса и дермы проводилось на увеличении хЮО, х200 и х400. В гистологических препаратах определяли патоморфологические изменения в эпидермисе и дерме.
Гистологическое исследование
Начальным этапом непрямого иммуногистохимического исследования была подготовка срезов. Для этого их наклеивали на стекла, обработанные полилизином, распарафинивали, блокировали эндогенную пероксидазу раствором перекиси водорода в метаноле и выполняли демаскировку антигенов путем нагревания в трис-ЭДТА или цитратном буфере в течение 30 мин при температуре 95С на водяной бане (рисунок 2.6).
Для иммуногистохимической детекции субпопуляций лимфоцитов, дендритных клеток и пролиферативной активности клеток использовали первичные мышиные и кроличьи моноклональные античеловеческие антитела (Таблица 2.2). Время инкубации с первичными антителами составляло 18-20 часов при t= +40C.
Для детекции клеток использовали полимерную систему визуализации Envision (Dako, Дания), где в качестве хромогена применяли диаминобензидин (ДАБ) (Dako, Швеция), и двойную систему визуализации Multivision Polymer (Thermo Fisher Scientific, США). Инкубацию проводили с системой визуализации – 30 мин. при температуре +20С. для проявления результата реакции ДАБ наносили на срезы на 5 мин.
Двойная система детекции «Multivision Polymer Detection System: Multivision anti-rabbit/HRP + anti-mouse/AP polymers» – набор для иммуногистохимического выявления (окрашивания) двух антигенов в одном срезе (гистологическом препарате). Она состоит из смеси антивидовых антикроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена и антивидовых антимышиных антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой и двух разных хромогенов (дополнительные реагенты). Пероксидаза хрена при расщеплении своего хромогена дает красное окрашивание, щелочная фосфатаза – синее. Данная система позволяет проанализировать взаимное расположение двух разных антигенов в одном препарате, при условии, что хозяева первичных специфических антител к этим антигенам разные – кролик и мышь.
Выполнялось определение количества окрашенных цветовой меткой (позитивных) клеток при 200–кратном увеличении светового микроскопа в трех полях зрения (размерами 720530 мкм), выбранных с учетом наибольшего количества меченых клеток, используя компьютерную программу анализа изображения «UTHSCSA ImageTool 3.0» (Рисунок 2.7) и программное обеспечение «Морфология 5.2» (ВидеоТесТ, Россия) (Рисунок 2.8, рисунок 2.9, рисунок 2.10). Полученные данные заносили в базу данных в виде среднего числа позитивных клеток на изучаемой площади среза (0,38 мм2), посчитанных для каждого биоптата.
Определяли относительную площадь экспрессии, которую рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Индекс пролиферативной активности определяли как отношение количества Ki-67-позитивных клеток к общему количеству ядерных клеток в поле зрения, выраженное в процентах.
Коэффициент эпидермо-дермального отношения определяли как отношение площади, занимаемое выявляемым маркером в эпидермисе к площади в дерме.
Статистический анализ
В нашей работе представлены три группы больных (пациенты с ГМ пятнистой и бляшечно-опухолевой стадиями, БП) и группа сравнения.
В группе больных пятнистой стадией ГМ было 9 человек: мужчин - 8 (89,9%), женщин - 1 (11,1%). Возраст пациентов с ГМ (Mm): от 52 до 69 (62,0±3,2%) лет.
Слабо шелушащиеся пятна, размерами больше 6 см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, наблюдались у 67% пациентов с пятнистой стадией ГМ (SE 0,56, SP 0,65). Пойкилодермия (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи) наблюдалась у 4 (44%) пациентов (SE 0,50, SP 0,68). Феномен одновременного прогрессирования и регрессирования отдельных высыпаний наблюдался у 3 (33%) больных (SE 0,32, SP 0,52). Вовлечение двух и более анатомических областей выявлялось у 8 (89%) пациентов (SE 0,28, SP 0,50) (Рисунок 3.01).
Группа больных ГМ бляшечной и опухолевой стадиями состояла из 12 больных: мужчин - 10 (83,3%), женщин - 2 (16,7%). Возраст больных ГМ составлял (M±m): от 58 до 88 (67,8±2,6%) лет.
Бляшечная стадия ГМ (10 пациентов) проявлялась уплотненными шелушащимися красно-коричневыми бляшками (80%), которые наблюдались совместно с пятнами, характерными для начальной стадии ГМ, реже наблюдались единичные папулы (20%). (Рисунок 3.02).
Группа больных БП состояла из 21 больного: мужчин – 18 (86%), женщин – 3 (14%). Возраст больных БП – от 44 до 76 (61,3±2,1%) лет.
У 67% пациентов с бляшечным парапсориазом поверхность пятен напоминала «папиросную бумагу» (явление псевдоатрофии). Пятна больше 6 см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, наблюдались у 67%. Явление пойкилодермии у 29% пациентов (Рисунок 3.04).
Таким образом, наиболее значимыми клиническими признаками, на основании которых можно дифференцировать больных пятнистой стадией ГМ и пациентов с БП являются: слабо шелушащиеся пятна, размерами больше 6 см, расположенные на участках кожи, не подвергающихся солнечному облучению, (SE 0,56, SP 0,65) и явления пойкилодермии (пятнистая пигментация, телеангиоэктазии, атрофия кожи) (SE 0,50, SP 0,68).
В пятнистой стадии ГМ у 2 пациентов (22%) эпидермис был не изменен, у 3 (33%) случаях обнаружен акантоз, у 2 (22%) - атрофия эпидермиса. В эпидермисе 6 (67%) больных наблюдались лимфоциты, по размеру крупнее дермальных. Лимфоциты, окруженные светлым перинуклеарным ободком, обнаружены у 7 (78%) пациентов. Лимфоциты, расположенные цепочкой (более 3-х лимфоцитов), обнаружены в 4 (44%) случаях. Лимфоциты с церебриформными ядрами выявлены у 6 (67%) пациентов. У большей части больных лимфоцитарный инфильтрат был умеренно выражен, распологался периваскулярно. Фиброз дермы выявлен у 4 (44%) пациентов. В большинстве случаев 7 (78%) спонгиоз отсутствовал, или был слабо выражен 2 (22%). При оценке диагностической значимости гистологических характеристик выявлено, что наибольшая чувствительность и специфичность характерны для следующих показателей: эпидермальные лимфоциты крупнее дермальных (SE 0,75, SP 0,86), лимфоциты с церебриформными ядрами (SE 0,67, SP 0,85) (Рисунок 3.05).
В бляшечной стадии ГМ, кроме изменений, характерных для пятнистой стадии, наблюдалось скопление лимфоцитов в эпидермисе с формированием микроабсцессов Потрие у 6 (60%) пациентов. В верхней части дермы преобладал плотный полосовидный инфильтрат, в котором доминировали малые церебриформные клетки у 10 (100%) больных (Рисунок 3.06).
Относительная площадь экспрессии langerin-позитивных ДК в коже больных пятнистой стадией ГМ (1,18 [0, 98-1,29]%) была в 1,4 раз больше, чем у больных БП – (0,85 [0,79-0,91] %) (p 0,05) и в 5,2 раза больше, чем в коже здоровых лиц (0,22 [0,18-0,29]%) (р 0,05) (рисунок 3.09). У больных бляшечно-опухолевой стадией ГМ экспрессия langerin-позитивных ДК составляет 1,55% (таблица 3.1).
Установлено, что при выявлении относительной площади экспрессии
Langerin-позитивных ДК0,9% определяется высокая диагностическая информативность данного маркера при установлении диагноза ГМ (SE 0,87, SP 0,90).
Анализ распределения ДК в коже показал, что 93% langerin+-клеток у здоровых лиц локализуется в эпидермисе, 7% - в дерме. В биоптатах больных БП распределение langerin+-клеток отличалось более высоким содержанием клеток Лангерганса в дерме – 25%, в эпидермисе они составляли 75%. В коже больных пятнистой стадией ГМ расположение langerin+-клеток было: в дерме 24%, в эпидермисе 76%, а в бляшечно-опухолевую стадию ГМ – в дерме 41%, в эпидермисе 59% (рисунок 3.10 а – в).
При проведении анализа относительной площади экспрессии маркера CD83 в коже установлено, что его содержание у больных с пятнистой стадией ГМ (0,61 [0,51-0,71]%) в 2,4 раза превышает показатели пациентов с БП (0,25 [0,17-0,35]%) и в 3 раза больше, чем в коже здоровых людей (0,2 [0,12-0,29]%) (р 0,05). Показатели экспрессии у пациентов с бляшечно-опухолевой стадией составляет 0,72 [0,64-0,29]% (рисунок 3.11 а – в) (таблица 3.2).
Выявлено, что метод определения относительной площади экспрессии CD83-позитивных ДК при значении 0,5% имеет средние показатели чувствительности (SE 0,71) и специфичности (SP 0,82) при установлении диагноза ГМ. Анализ тканевого распределения маркера CD83 показал, что позитивные клетки у здоровых лиц располагались в эпидермисе в 51%, в дерме в 49%. У больных БП – 40% в эпидермисе и 60% в дерме, у больных пятнистой стадией ГМ – 34% и 66%, у пациентов бляшечно-опухолевой стадией ГМ – 25% и 75% соответственно (рисунок 3.12).
Коэффициент относительной площади экспрессии маркера langerin к CD83 у здоровых лиц составило 1,1, у больных БП – 3,37, пятнистой стадией ГМ – 1,89, бляшечно-опухолевой стадией ГМ – 2,15. Различия соотношений экспрессии этих маркеров в эпидермисе и дерме представлены на рисунке 3.13.
Отмечается значительное увеличение количества зрелых CD83+-клеток у больных пятнистой и бляшечно-опухолевой стадией ГМ по сравнению со здоровыми лицами и пациентами с БП. Вместе с тем, анализируя соотношение клеток Лангерганса и зрелых ДК, мы обнаружили, что у здоровых людей этот показатель практически равен 1.
При БП наблюдается увеличение в коже преимущественно незрелых langerin+-клеток, в то время как численность CD83+-клеток статистически значимо не отличается от показателей у здоровых людей (коэффициент langerin+/ CD83+ составляет 3,37).
У больных пятнистой и бляшечно-опухолевой стадией ГМ наблюдается значительное по сравнению со здоровыми людьми повышение в коже как зрелых (CD83+) ДК (в 2,5-3 раза), так и незрелых (langerin+) ДК (в 1,5 раза) (коэффициент langerin+/ CD83+ составляет 1,18 и 1,55 соответственно).
