Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Современные представления о молекулярных механизмах, учавствующих в регуляции апоптоза клеток 11
1.1. Феноменология апоптотической гибели клеток 12
1.1.1. Молекулярные механизмы реализации апоптоза 12
1.1.2. > Редокс-регуляция програмированной клеточной гибели 21
1.2. Пути активации и мишени воздействия транскрипционных факторов 24
1.2.1. Роль транскрипционного фактора NF-kB в
жизнедеятельности клетки 24
1.2.1.1. Классический, альтернативный и другие пути активации транскрипционного фактора NF-kB 24.
1.2.1.2. Исходы активации NF-kB 28
1.2.2. Транскрипционный фактор р53 31
1.2.2.1. Модели р53 активации 31
1.2.2.2. Нижележащие мишени р53 активации 34
1.3. Роль белков семейства Вс1-2 в реализации апоптотической программы клетки 38
1.3.1. Антиапоптотические белки-регуляторы
программированной клеточной гибели 39
1.3.2. Проапоптотические белки семейства Вс1-2,
участвующие в регуляции апоптотической гибели клеток 41
1.3.3. Молекулярные основы взаимодействия между подклассами протеинов семейства Вс1-2 45
Заключение 49
Глава 2. Материал и методы исследования 52
2.1. Материал исследования 52
2.1.1 Экспериментальный блок исследования 53
2.1.2. Клинический блок исследования 54
2.2. Методы исследования 55
2.2.1. Выделение и культивирование мононуклеарных лейкоцитов венозной крови
2.2.2. Оценка реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови с использованием метода проточной лазерной цитофлуориметрии 56
2.2.3. Определение апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов с использованием TUNEL-метода
2.2.4. Оценка митохондриального трансмембранного потенциала мононуклеарных лейкоцитов крови 59
2.2.5. Оценка продукции активных форм кислорода мононуклеарными лейкоцитами крови 60
2.2.6. Оценка количества TNF R1 -позитивных мононуклеарных лейкоцитов крови 62
2.2.7. Оценка продукции TNF-a мононуклерными лейкоцитами крови 62
2.2.8. Оценка экспрессии РНК генов белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах крови 63
2.2.9. Оценка уровня факторов транскрипции и белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах крови 70
2.2.10. Статистический анализ результатов 71
Глава 3. Результаты собственных исследований 72
3.1.Особенности реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе in vitro 72
3.1.1. Особенности продукции активных форм кислорода мононуклеарными лейкоцитами крови в условиях" окислительного стресса in vitro ' 72
' 3.1.2. Изменения количества апопточески измененных клеток в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса in vitro 74
3.1.3. Изменения количества клеток со сниженным митохондриальным трансмембранным потенциалом в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови в услвиях окислительного стресса in vitro 75
3.2. Особенности программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при острых воспалительных заболеваниях 76
3.2.1. Особенности продукции активных форм кислорода мононуклеарными лейкоцитами крови у больных острыми воспалительными заболеваниями 76
3.2.2. Изменения количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов крови у больных острыми воспалительными заболеваниями 77
3.2.3. Изменения количества клеток со сниженным митохондриальным трансмембранным потенциалом в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови у больных острыми воспалительными заболеваниями 78
3.2.4. Состояние TNFa-индуцированного апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови у больных острыми воспалительными заболеваниями 79
3.3. Молекулярные механизмы реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 81
3.3.1. Уровень факторов транскрипции Р53 и NF-kB в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 82
3.3.2. Содержание белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2 в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 83
3.3.3. Уровень экспрессии мРНК генов белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2 в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении 85
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 88
Выводы 115
Список литературы 116
- Феноменология апоптотической гибели клеток
- Пути активации и мишени воздействия транскрипционных факторов
- Выделение и культивирование мононуклеарных лейкоцитов венозной крови
- Особенности продукции активных форм кислорода мононуклеарными лейкоцитами крови у больных острыми воспалительными заболеваниями
Введение к работе
Актуальность исследования. Нарушения реализации
программированной гибели клеток являются важным патогенетическим
фактором развития социально значимых заболеваний человека
(злокачественные новообразования, сердечно-сосудистые и
нейродегенеративные заболевания, острые и хронические воспалительные процессы, сахарный диабет и др.), что обусловливает интенсивность исследований, посвященных установлению молекулярных механизмов ее дизрегуляции. В норме апоптотическая гибель необходима для поддержания тканевого гомеостаза за счет устранения избыточных и/или функционально неполноценных клеток. Реализация суицидальной программы зависит от баланса про- и антиапоптотических систем в клетке и регулируется комплексом генетических, молекулярных и биохимических факторов, большинство из которых полностью не верифицировано [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002; Фильченков А.А., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006].
В последние годы особое внимание уделяется роли окислительного стресса в развитии апоптоза. Универсальность явления программированной гибели позволяет предположить участие активных форм кислорода (АФК) в регуляции другого типового механизма регуляции клеточного гомеостаза -апоптоза [Cai Н., Harrison D.G., 2000; Зенков Н.К. и соавт., 2001; Ляхович В.В. и соавт., 2005].
АФК обладают высокой реакционной способностью, позволяющей им взаимодействовать с липидами, белками, нуклеиновыми кислотами и углеводами. В высоких концентрациях АФК индуцируют процессы перекисного окисления липидов в биологических мембранах, повреждение мембраносвязанных белков и ДНК клетки, инактивацию ферментов [Alder V.et al.,1999; Дубинина Е.Е., 2001; Zhu H.et al., 2001]. Однако в настоящее время концепция, предполагающая исключительно повреждающее влияние АФК на функционирование клетки, пересматривается. Широкую известность приобрел термин «окислительная регуляция», отражающий активную роль окислительно-восстановительной модификации протеинов в регуляции функции клетки [Kim
B.Y. et al., 2001; Haddad J., 2002]. Измененные в результате воздействия АФК молекулы являются «сигналами», несущими биологическую информацию, необходимую для регуляции различных клеточных функций, в частности, апоптоза [Sorescu D., 2001; Safa О., 2001; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007].
АФК влияют на различные пути инициации апоптотической программы (митохондриальный, рецепторный, ядерный) непосредственно или через внутриклеточные редокс-зависимые сигнал-передающие системы [Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. При воздействии стрессового стимула в> клетке может происходить одновременная- активация- нескольких молекулярных путей, взаимодействующих между собой [Wajant Н., 2002; Schultz D.R. Harrington W.G., 2003]. Интеграция различных вариантов запуска апоптоза может происходить на уровне транскрипционных факторов. Одним из редокс-чувствительных транскрипционных факторов является NF-kB [Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Данный фактор транскрипции вовлечен в регуляцию воспалительного ответа (синтез IL-2, -8), опухолевую прогрессию, в частности, за счет влияния на реализацию апоптотической программы [Stark L.A., Dun lop M.G., 2005; Perkins N.D., Gilmore T.D., 2006]. К транскрипционным-мишеням NF-kB относят гены, кодирующие белки Bcl-XL, IAP, Al, ответственные за угнетение процесса апоптоза [Kucharczak J. et al., 2003].
АФК могут изменять соотношение между про- и антиапоптотическими протеинами семейства Вс1-2, являющимися ключевыми регуляторами программированной гибели клеток. Известно, что синтез ряда белков данного семейства находится под контролем редокс-чувствительных транскрипционных факторов, в частности, р53 активирует экспрессию Bid, Puma и Noxa; NF-kB -Bcl-XL [Oda E. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002; Kucharczak J. et al., 2003].
Таким образом, АФК, являясь вторичными мессенджерами, могут изменять функционирование клетки вплоть до запуска в ней суицидальной программы. Учитывая ключевую роль дизрегуляции апоптоза в патогенезе ряда распространенных заболеваний человека, изучение роли окислительного стресса в механизмах изменения реализации программированной гибели клеток
позволит создать новые патогенетически-обоснованные технологии терапии социально значимых заболеваний.
Цель исследования: установить молекулярные механизмы модификации редокс-чувствительных белков-регуляторов апоптоза при окислительном стрессе.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
Определить содержание проапоптотических (Вах, Bad) и антиапоптотических (Bcl-2, Bcl-XL) белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе in vitro.
Установить роль факторов транскрипции (NF-kB, р53) в нарушении регулирующего влияния про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2 в мононуклеарных лейкоцитах крови при окислительном стрессе in vitro.
Оценить влияние дисбаланса окислительного метаболизма на экспрессию м-РНК белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах крови.
Установить молекулярные механизмы дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови, реализуемые на уровне транскрипционных факторов, при остром воспалительном процессе.
Научная новизна. Впервые установлено, что активация редокс-чувствительных факторов транскрипции NF-kB и р53 вовлечена в дизрегуляцию апоптоза при окислительном стрессе. Получены приоритетные данные о дисбалансе содержания про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2 в условиях повышенной продукции АФК. Показано, что нарушение системы про-и антисуицидальных протеинов семейства Вс1-2 опосредовано влиянием факторов транскрипции NF-kB и р53 на экспрессию соответствующих генов-мишеней. Установлены однотипные механизмы дигрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 1 мМ перекисью водорода, и остром воспалении.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в результате проведенного исследования фактические данные описывают молекулярные механизмы дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе и при остром воспалении. Установлена роль факторов транскрипции р53 и NF-kB в регуляции экспрессии генов белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2. Основные положения исследования могут служить основой для дальнейшего изучения редокс-чувствительных механизмов регуляции клеточных функций, поиска молекулярных мишеней, подверженных воздействию активных форм кислорода. Результаты проведенного исследования позволят разработать новые технологии коррекции нарушений программы клеточной гибели при заболеваниях, сопровождающихся дисбалансом окислительного метаболизма.
Положения, выносимые на защиту:
При окислительном стрессе в клетках имеет место дисбаланс белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2: повышение содержания проапоптотического белка Вах, отсутствие изменения содержания антисуицидальных белков Вс1-2 и Bcl-XL.
Воздействие активных форм кислорода на редокс-чувствительные элементы сигнал-передающих путей приводит к изменению экспрессии генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза семейства Вс1-2.
Активация факторов транскрипции р53 и NF-kB при окислительном стрессе in vitro приводит к изменению профиля экспрессии генов, находящихся под контролем данных транскрипционных факторов.
Дисбаланс окислительного метаболизма при острых воспалительных заболеваниях сопровождается дизрегуляцией апоптоза за счет активации редокс-чувствительных факторов транскрипции, влияющих на экспрессию генов белков-регуляторов апоптоза семейства Вс1-2.
Апробация и внедрение результатов работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на VIII Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты
компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007).
Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ в рамках проекта «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ -«Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150), а также выполнены в рамках ФЦНТП (проект «Разработка способов коррекции нарушений регуляции апоптоза клеток при патологических процессах в условиях окислительного стресса», государственный контракт № 02.442.11.7276 от 20.02.2006 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 1 - в центральном рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы, включающего 252 источника, из них - 55 отечественных и 197 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 31 рисунком.
Феноменология апоптотической гибели клеток
Апоптотическая гибель клеток является механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеточных популяций. Регуляция летальной программы представляет собой хорошо отлаженную систему взаимодействия про- и антиапоптогенных факторов. Изменения апоптотического процесса в сторону интенсификации или, напротив, угнетения происходят за счет запуска соответствующих внутриклеточных сигнальных путей: система протеинкиназ, кальций- и NO-зависимые механизмы.
Сигнальные каскады, участвующие в регуляции апоптоза, такие как фосфорилирование белков, активация факторов транскрипции и их связывание со специфическими сайтами ДНК, контролируются внутриклеточным редокс-гомеостазом. Баланс соотношения «прооксиданты-антиоксиданты» в клетках тесно связан с их метаболической активностью. При- этом универсальными индукторами изменений окислительно-восстановительного статуса в ответ на стрессовые воздействия являются АФК [Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006].
Регуляторное влияние АФК реализуется, за счет прямого воздействия на эффекторные молекулы либо за счет активации редокс-чувствительных факторов транскрипции (NF-kB, АР-1, р53, Nrf2 и др.). Последние влияют на экспрессию генов, что приводит к активации/ингибированию многих ферментативных процессов, изменению соотношения регуляторных белков (семейства Вс1-2, протеинкиназ) [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007].
Интенсивная наработка АФК при различных патологических процессах и состояниях может оказывать влияние на процессы реализации апоптоза (как в сторону активации, так и в сторону ингибирования), выступая, в качестве дополнительного патогенетического механизма развития сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, воспалительных и нейродегенеративных процессов [Дубинина Е.Е., 2001]. Управление программированной гибелью клеток с помощью воздействия на сигнал-передающие пути с целью терапии социально значимых болезней привлекает интерес исследователей к данной проблеме.
Апоптоз является физиологическим механизмом устранения избыточных и/или функционально неполноценных клеток. Программированная гибель клеток необходима как для нормального развития многоклеточного организма в эмбриональном периоде, так и для поддержания тканевого гомеостаза в сформировавшемся организме [Фильченков А.А., 2003]. Нарушения реализации программированной гибели клеток могут привести к развитию ряда патологических процессов.
Процесс апоптоза может быть структурно разделен на три независимые фазы: инициация, эффекторная фаза и деградация [Thornberry N.A., Lazebnik Y., 1998; Kroemer G., Reed J., 2000]. Фаза инициации может быть опосредована различными воздействиями: удалением факторов роста, гипоксией, гипероксией, субнекротическим поражением химическими реагентами и физическими агентами, перекрестным , связыванием соответствующих рецепторов, нарушением сигналов клеточного цикла и др. В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвергируются в один общий путь апоптоза. Фаза деградации завершает процесс программированной клеточной гибели [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002].
Существует несколько путей инициации программы гибели клеток: рецепторный, митохондриальный и ядерный.
Рецепторный путь запуска апоптоза является тем механизмом, который обусловливает элиминацию клеток с рецепторами определенной специфичности (рис. 1). Лучше всего изучена последовательность событий, приводящих к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства TNF со специфическими рецепторами. Ярким представителем даной группы протеинов является система Fas/Fas-L.
Установлено, что Fas-лиганд опосредует гибель клеток путем перекрестного связывания с CD95(Fas)-peuenTopoM в апоптоз-чувствительных Fas-положительных клетках [Brunner T.R. et al., 1995; Dhein J.H. et al., 1995; Lunch D.H. et al., 1995]. Гомотример Fas-L связывается с внеклеточным участком трех молекул Fas, после чего происходит кластеризация внутриклеточных областей рецептора из-за физической ассоциации «доменов смерти». В клетке кластер «доменов смерти» Fas образует комплекс с аналогичным «доменом смерти» адаптерного белка FADD (Fas-ассоциированный «домен смерти»), основная функция которого сводится к передаче возникающих конформационных изменений. «Домен смерти» FADD взаимодействует с аналогичными тандемно повторяющимися доменами каспазы-8. FADD, индуцируя олигомеризацию каспазы-8, вызывает ее саморасщепление с образованием активной протеиназы и активацию эффекторных протеиназ. Активная каспаза-8 запускает каскадную реакцию расщепления различных протеиназ и ряда структурных и функциональных белков клетки, что приводит к реализации программы апоптоза [Аббасова С.Г. и соавт., 1999; Белецкий И.П. и соавт., 2002].
Существуют и другие пути активации каспазы-8, в частности с участием TNFR1 и DR3. Однако они конкурируют с транскрипционным фактором NF-kB и-JNK MAP киназой за общий для.этих путей адаптерный белок TRADD. Под контролем NF-kB находится синтез белковых регуляторов, которые блокируют TNF- и АроЗЬ-индуцированную активацию каспазы-8 [Ashkenazi A., Dixit V.M., 1998].
Митохондриальный путь запуска программированной клеточной гибели включает изменения в электронном транспорте [Cadenas Е. et al., 2000], снижение митохондриального трансмембранного потенциала (Д\/) [Green D.R., Evan G.I., 2002], изменения клеточного редокс-баланса [Madeo F et al., 1999], выход индукторов смерти (цитохром с [Liu X. et al., 1996], Smac/DIABLO [Du С. et al., 2000; Wu G. et al., 2000], AIF [Joza N. et al., 2001], эндонуклеаза G [Li L.Y. et al., 2001]) и взаимодействие про- и антиапоптотических белков семейства-Bcl-2 [Antonsson В. et ah, 2000; Cory S. et al., 2002] (рис. 2). Различные сигналы, сходящиеся на митохондриях для усиления или ингибирования данных событий и воздействия на нижележащие мишени, обусловливают несколько основных вариантов реализации программы клеточной гибели: 1) нарушение электронного транспорта, окислительного фосфорилирования и продукции АТФ; 2) выход протеинов, запускающих активацию каспаз; 3) изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса.
Пути активации и мишени воздействия транскрипционных факторов
АФК участвуют во внутриклеточной кооперации, воздействуя на редокс-чувствительные элементы сигнал-передающих путей, в частности на МАР-киназы и факторы транскрипции. Ответственные за стрессовые воздействия-МАР-киназы (JNK, р38, Erk5) активируются под влиянием АФК и передают сигнал в виде последовательного фосфорилирования ферментов. Показано участие JNK в регуляции апоптоза за счет индукции транскрипционного фактора р53 проапоптотических белков Вах и Bad, а также за счет ингибирования антиапоптотических протеинов семейства Bcl-[Johnson G.L., Lapadat R., 2002].
Комплексный адаптивный ответ клетки на изменение уровня АФК обеспечивается индукцией факторов транскрипции (NF-kB, АР-1, р53, Nrf2 и-др.). Показано, что редокс-чувствительный транскрипционный фактор NF-kB стимулирует выживание клеток . опухолей за счет активации; антиапоптотических генов, кодирующих белки Bcl-xL, х-ІАР, сІАР и А20 [Kucharczak J. et al., 2003].
Под воздействием АФК изменяется р53-индуцированный апоптоз. Согласно экспериментальным данным, при индукции р53 33% клеток, экспрессирующих р53, подвергались апоптозу. В то же время в присутствии антиоксиданта NAC (N-ацетил цистеин) число апоптотических клеток уменьшалось [Gudkov A.V., Komarova Е.А., 2003; Oren М., 2003].
Следует отметить, что любое напряжение организма усиливает процессы генерации АФК. При этом про- и антиоксидантное равновесие является важнейшим механизмом регулирования- окислительного гомеостаза. Лишь при тяжелом и значительном напряжении защитных систем количество АФК возрастает настолько, что обусловливает развитие окислительного стресса, становясь причиной дизрегуляции апоптоза.
С момента открытия ядерного фактора NF-kB было установлено его участие во многих жизненно важных процессах в клетке (пролиферация, продукция цитокинов, модуляция иммунного ответа). Так, NF-kB стимулирует функцию иммунных клеток и выполняет провоспалительную роль, индуцируя экспрессию цитокинов, хемокинов и их рецепторов [Pahl H.L., 1999; Bonizzi G., Karin ML, 2004; Hay den M.S., Ghosh S., 2004]. Активированный NF-kB ингибирует программированную клеточную гибель путем стимуляции транскрипции антиапоптотических генов [Kucharczak J. et al., 2003]. Вместе с тем показано его участие в противоопухолевой защите организма- через инактивацию антисуицидальных генов [Perkins N.D., 2004].
Термином транскрипционный фактор NF-kB очень часто обозначается классический p50/RelA(p65) гетеродимер. Однако тот же термин может относиться и к другим димерам, сформированным из частиц NF-kB: р52 (рЮО), c-Rel и Rel-B [Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. Характерной чертой субъединиц NF-kB является сформированный из 300 аминокислотных остатков (АМК) N-терминальный домен, называемый Rel-гомологичным доменом (RHD), который содержит АМК, ответственные за связывание с ДНК либо с ингибитором IkB, димеризацию и ядерную локализацию. Композиция NF-kB-может варьировать в зависимости от типа клеток, природы индуцирующего воздействия и времени, прошедшего после начального стимулирующего сигнала [Perkins N.D., 1997; Saccani S. et al., 2003; Hayden M.S., Ghosh S., 2004].
Учитывая, что субъединицы NF-kB экспрессируются во всех типах клеток и существуют сотни активационных сигналов, число различных состояний, вызывающих активацию NF-kB, огромно. Следовательно, функция NF-kB комплексов может изменяться в зависимости от специфики индуцирующего сигнала [Perkins N.D., Gilmore T.D., 2006] (рис. 4).
Быструю активацию и ядерную транслокацию цитоплазматического NF-кВ, следующую за деградацией его ингибитора ІкВ в результате фосфорилирования ІкВ активированным IkB киназным (IKK) комплексом, часто называют классическим или «каноническим» путем активации [Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Viatour P. et al., 2005]. В этом пути IKK комплекс состоит из двух каталитических киназных субъединиц и многочисленных копий регуляторной субъединицы IKK, которая ответственна за интеграцию сигналов от вышерасположенных киназ и рецептор-ассоциированных протеинов [Viatour P. et al, 2005].
Выход димеров NF-kB из комплекса с ингибитором позволяет им транслоцироваться к ядру. Данный процесс может быть определен как измененное равновесие, при котором NF-kB/IkB комплекс разбивается между цитоплазмой и ядром. При этом деградация IkB, изменяет локализацию NF-kB из первоначальной цитоплазматической в нуклеарную [Nelson D.E. et ah, 2004].
В большинстве типов клеток активация канонического пути приводит к ядерной локализации p50/RelA комплекса в течение нескольких минут. Активация классического пути может вовлечь некоторые посттрансляционные модификации NF-kB субъединиц, в частности фосфорилирование, ацетилирование и пролиновую изомеризацию RelA. Установлено, что RelA(p65) субъединица NF-kB может быть прямо фосфорилирована IKK по Ser-536. IKK - зависимая активация NF-kB может также происходить под действием генотоксического стресса [Campbell K.J., Perkins N.D., 2004].
Канонический путь NF-kB ответа может быть терминирован несколькими способами. Одним из наиболее изученных является путь, включающий индукцию генетической транскрипции IkB активированными NF-kB. Вновь синтезированная IkB может войти в ядро, связаться с NF-kB и вернуть его в цитоплазму [Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Viatour P. et ah, 2005].
Выделение и культивирование мононуклеарных лейкоцитов венозной крови
Мононуклеарные клетки выделяли - из цельной венозной гепаринизированной крови методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. исоавт., 1980].
Венозную гепаринизированную кровь (25 Ед/мл) в соотношении 1:1 наслаивали на градиент плотности Ficoll-Paque (р=1,077 г/см3) («GE Healthcare», Швеция) и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Кольцо, образованное из смеси мононуклеарных лейкоцитов, собирали пипеткой с раздела фаз. Клетки трижды отмывали средой RPMI-1640, ресуспендируя и центрифугируя каждый раз в течение 10 мин при 1500 об/мин.
Для определения жизнеспособности 0,1 мл суспензии клеток смешивали с равным объемом 0,5% трипанового синего («Serva», США), заполняли счетную камеру Горяева. Жизнеспособность мононуклеарных лейкоцитов оценивали по содержанию «мертвых» клеток, окрашенных в синий цвет. Доля погибших клеток, содержащих краситель, не превышала 5 %.
Выделенные на градиенте плотности мононуклеары ресуспендировали в полной питательной среде (90% RPMI-1640, 10% инактивированной (при 56С в течение 30 мин) эмбриональной телячьей сыворотке ("Биолот", Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L- глутамина, 100мкг/мл гентамицина, 2 мМ/мл HEPES («Flow», Великобритания)). Дляї стандартизации количества- клеток суспензию мононуклеарных лейкоцитов разбавляли полной питательной средой до получения 2-Ю6 клеток в 1 мл среды. Клетки культивировали в стерильных пенициллиновых флаконах и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах втечение 18 ч при температуре 37 и 5% СОг.
Для оценки реализации апоптоза мононуклеаров использовали ФИТЦ-меченный аннексии V, обладающий сродством к мембранно-связанному фосфатиди леер ину [Van Engeland М., 1998] .
Исследование осуществляли с помощью набора реагентов «ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция). В чистую полистериновую пробирку помещали 200 мкл суспензии мононуклеарных лейкоцитов (2,0-106 клеток в 1 мл) и промывали клеточную суспензию охлажденным на льду фосфатно-солевым буфером (400 мкл) («Helikon», США), центрифугируя 5 мин при 1500 об/мин. Удаляли супернатант и ресуспендировали оставшиеся клетки в 100 мкл Са2+-связывающего буфера. Затем добавляли 1 мкл «ANNEXIN V FITC» и тщательно перемешивали на центрифуге вортекс, в течение 10 мин инкубировали на льду в темноте. Далее добавляли 400 мкл охлажденного буфера и перемешивали.
Образцы клеточных суспензий анализировали на: проточном цитометре Epics ХЬ («Beckman Coulter», Франция) с аргоновым лазером на- основе определения нескольких параметров: малого углового светорассеяния.- (FSC); характеризующего размер клетки, бокового светорассеяния; (SSC), характеризующего цитоплазматические, а также мембранные особенности клетки, и показатель зеленой флуоресценции (флуоресцеин изотиоцианат, — ФИТЦ - 530 нм). Проводили; гейтинг исследуемой популяции, клеток в координатах FSC (ось: абсцисс); и SSC (ось.ординат). Затем-данную популяцию? клеток анализировали на. наличие флуоресценции в координатах на основе:Dot Plot; Использовали автоматическое программное обеспечение и методы сбораи; анализаданных с высоким разрешением (1024 канала):.
Полученные результаты выражали в процентах (отношение числа клеток, связавших аннексии V на поверхности мембраны, к общему числу мононуклеарных лейкоцитов).
Особенности продукции активных форм кислорода мононуклеарными лейкоцитами крови у больных острыми воспалительными заболеваниями
Оценка количества мононуклеарных лейкоцитов крови, полученных у здоровых доноров, со сниженным трансмембранным потенциалом, проведенная методом лазерной проточной цитофлуориметрии, показала, что в интактной культуре значения данного показателя составляли 1,35(1,11-1,65)%.
Процентное содержание клеток со сниженным значением митохондриального транс мембранного потенциала после их инкубирования с перекисью водорода в концентрациях 10, 50, 100 и 500 мкМ составило, соответственно, 1,63(1,19-1,94)%; 1,73(1,33-2,61)%; 1,60(0,91-3,22)% и 1,62(1,05-2,46)% (р 0,05). Относительное количество мононуклеарных лейкоцитов с пермеабилизованной наружной митохондриальной мембраной после воздействия 1 мМ Н202 возрастало до 9,21(6,17-12,55)%, что статистически отличалось от аналогичного показателя в интактной культуре (р 0,05) (табл. 2).
Таким образом, выраженность процесса апоптотической гибели мононуклеаров соотносится с уровнем внутриклеточной продукции активных форм кислорода и степенью уменьшения митохондриального трансмембранного потенциала.
Окислительный стресс является важным патогенетическим фактором развития различных заболеваний (воспалительные процессы любого генеза, злокачественные новообразования, сердечно-сосудистая и бронхо-легочная патология, неврологические и психические заболевания; интоксикации различного генеза и др.). При этом механизмы генерации АФК носят типовой универсальный характер [Дубинина Е.Е., 2002]. В качестве примера1 патологического процесса, сопровождающегося дисбалансом окислительного метаболизма, мы выбрали острый воспалительный процесс, определявшийся у больных внебольничной пневмонией и острым аппендицитом.
Оценка интенсивности АФК-продукции мононуклеарными лейкоцитами; полученными у больных внебольничной пневмонией, выявила; что данный показатель был равен 0,50(0,49-0,56) усл.ед., что достоверно превышало-соответствующие значения в интактной культуре клеток, выделенных из крови у здоровых доноров (0,24(0,19-0,33) усл.ед., р 0,05) (табл. 3).
Исследование содержания АФК в мононуклеарных лейкоцитах, выделенных из периферической крови у больных острым аппендицитом, также показало достоверное по сравнению с контролем (р 0,05) увеличение изучаенного показателя до 0,48(0,46-0,49) усл.ед. Остутствие различий по уровню АФК в мононуклеарных лейкоцитах больных внебольничной пневмонией и острым аппендицитом позволило объединить данных пациентов в одну группу больных острым воспалением.
При сравнительной оценке уровня внутриклеточной продукции АФК при инкубации лейкоцитов с 1 мМ Н2Ог и у больных острым воспалительным процессом было установлено, что степень возрастания содержания АФК была более значима при экспериментальном моделировании окислительного стресса (р 0,05) (табл. 3). культуре мононуклеарных лейкоцитов, полученных у больных острым аппендицитом, было зарегистрировано достоверное увеличение числа аннексин-положительных клеток до 10,46(9,83-10,94)% относительно контрольного значения (р 0,05). Оценка апоптотической активности мононуклеаров, полученных у больных острым аппендицитом, проведенная с помощью TUNEL-метода, также показала, что относительное количество окрашенных клеток составляло 11,50(10,00-13,00)% (рис. 21). Отсутствие различий в числе апоптотических клеток при использовании лазерной проточной цитофлуориметрии и TUNEL-анализаі (р 0,05) свидетельствовало об адекватности использования, аннексинового теста для оценки реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов.
При анализе количества аннексин-положительных мононуклеаров, полученных у больных острым воспалением (внебольничная пневмония и острый аппендицит), было выявлено, что процентное содержание данных клеток оказалось статистически значимо ниже аналогичного показателя, зарегистрированного при окислительном стрессе in vitro (р 0,05) (табл. 3
![Механизмы влияния гипотензивной терапии на адаптационные реакции матери и плода при гипертонической болезни у беременных [Электронный ресурс]](/i/i/4391/187110.png "Механизмы влияния гипотензивной терапии на адаптационные реакции матери и плода при гипертонической болезни у беременных [Электронный ресурс] Беляева Наталья Александровна")
![Эндокринно-метаболические механизмы влияния тиреоидной патологии на течение артериальной гипертонии [Электронный ресурс]](/i/i/4385/184935.png "Эндокринно-метаболические механизмы влияния тиреоидной патологии на течение артериальной гипертонии [Электронный ресурс] Петренко Оксана Вениаминовна")
