Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1 Современные представления о патогенезе нейроинфекционных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии 14
1.2 Образование, циркуляция и основные функции цереброспинальной жидкости 24
1.3. Состав ЦСЖ в норме и при нейроинфекционных заболеваниях 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 33
2.1. Краткая характеристика обследованных больных 33
2.2. Фракционирование ЦСЖ методом гель-фильтрации на разных марках сефадексов 35
2.3. Исследование белкового состава ЦСЖ методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле 36
2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография низкомолекулярной фракции ЦСЖ 39
2.5 Масс - спектрометрия ЭРИАД для исследования и идентификации компонентов низкомолекулярной фракции ЦСЖ 40
2.6 Экспериментальные исследования биологической активности фракций ЦСЖ in vitro 41
2.6.1. Исследование бактерицидного действия фракций ЦСЖ 42
2.6.2. Исследование биологической активности фракций ЦСЖ в культуре клеток крови 43
2.6.3 Исследование воздействия фракций ЦСЖ на процессы перекисного окисления лимфоцитов крови 45
2.6.4. Исследование воздействия фракций ЦСЖ на интерферонообразования лейкоцитами крови 46
2.7. Экспериментальное исследование биологической активности фракций ЦСЖ in vivo па модели пневмококкового менингоэнцефалита у кроликов . 48
2.8. Статистическая обработка данных 50
ГЛАВА 3. Молекулярно-массовое распределение компонентов ЦСЖ при исследовании методом гель-фильтрации на сефадексе 51
3.1 Молекулярно-массовое распределение компонентов ЦСЖ при бактериальных менингитах у детей 51
3.2. Молекулярно-массовое распределение компонентов цереброспинальной жидкости при вирусных менингитах и энцефалитах 61
3.3. Распределение компонентов цереброспинальной жидкости при инфекционных заболеваниях периферической нервной системы 67
3.4. Обсуждение. Диагностическое значение оценки молекулярно-массового распределения компонентов ЦСЖ при острых нейроинфекциях у детей 69
ГЛАВА 4. Качественный и количественный состав высокомолекулярной (белковой) и низкомолекулярной (пептидной) фракций ЦСЖ при нейроинфекционных заболеваниях нервной системы у детей 74
4.1 Белковый спектр ЦСЖ в норме и при инфекционных заболеваниях нервной системы у детей 74
4.1.1. Белковый спектр ЦСЖ контрольной группы 74
4.1.2. Белковый спектр ЦСЖ при острых инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей 77
4.1.3. Обсуждение результатов исследования белкового состава ЦСЖ при инфекционных заболеваниях нервной системы у детей 90
4.2 Состав низкомолекулярной фракции ЦСЖ при вирусных и бактериальных нейроинфекциях у детей 93
4.2.1. Хроматографическое исследование состава низкомолекулярной фракции ЦСЖ 93
4.2.2. Идентификация компонентов низкомолекулзфной фракции ликвора методом масс-спектрометрии ЭРИ АД 102
4.2.3. Обсуждение данных исследования состава низкомолекулярной фракции ЦСЖ 105
ГЛАВА 5. Диагностическое и прогностическое значение исследований белково-пептидного состава ЦСЖ при инфекционных заболеваниях нервной системы у детей 108
ГЛАВА 6. Экспериментальное изучение биологической активности фракций ЦСЖ при нейроинфекционном процессе 122
6.1 Бактерицидные свойства фракций ЦСЖ при бактериальном нейроинфекционном процессе различной этиологии 122
6.2 Иммуномодулирующая активность in vitro фракций ЦСЖ больных бактериальными менингитами 134
6.3 Воздействие фракций ликвора на перекисное окисление липидов лимфоцитов крови при бактериальных менингитах 146
6.4 Воздействие фракций ЦСЖ на шггерферонообразование лейкоцитами крови 155
6.5 Исследование эффекта трансфузии донорского ликвора и его фракций in vivo на модели пневмококкового менингоэнцефалита у кроликов 163
6.6.Обобщение данных экспериментального исследования биологического эффекта компонентов цереброспинальной жидкости 169
Заключение. Этиопатогенетическое значение белково-пептидного состава цереброспинальной жидкости при нейроинфекциях у детей 174
Выводы 182
Практические рекомендации 185
Список литературы 187
- Образование, циркуляция и основные функции цереброспинальной жидкости
- Экспериментальное исследование биологической активности фракций ЦСЖ in vivo па модели пневмококкового менингоэнцефалита у кроликов
- Обсуждение. Диагностическое значение оценки молекулярно-массового распределения компонентов ЦСЖ при острых нейроинфекциях у детей
- Обсуждение результатов исследования белкового состава ЦСЖ при инфекционных заболеваниях нервной системы у детей
Введение к работе
Актуальность темы. Изучение молекулярных основ патогенеза нейро-инфекционных заболеваний обусловлено тяжестью течения вирусных и бактериальных менингитов и энцефалитов у детей, высокой летальностью (до 36 %) и формированием инвалидизирующих последствий у каждого третьего пациента [47, 125, 147, 168, 170, 221, 325, 346]. Течение и исход заболеваний зависят от взаимодействия вирулентных и патогенных свойств возбудителя и компенсаторных реакций макроорганизма [75, 85, 139]. Тяжесть нейроинфекций обусловлена выраженностью воспалительного процесса в оболочках и ткани мозга, сопровождающегося увеличением проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), проникновением возбудителя в ликворные пространства и ин-тратекальным развертыванием инфекционного процесса [162, 214, 278]. Известно, что в начальной стадии нейроинфекций вследствие увеличения проницаемости ГЭБ в ликворе повышается содержание острофазных белков, цитокинов, ферментов и их ингибиторов, иммуноглобулинов и других компонентов [9, 133, 156, 188, 209, 351, 321, 329]. Основой скрининговой ликворной диагностики является анализ содержания общего белка, плеоцитоза, реже содержания лактата, хлоридов и глюкозы, однако эти исследования не позволяют уточнить молекулярные основы патогенеза, степень поражения мозга и прогнозировать течение заболевания [99, 104, 114, 331, 348, 371].
По современным представлениям, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) принадлежат важные функции по поддержанию работы мозга в норме и при патологии - трофической, дренирующей, механической и иммунной защиты, нейрогуморальяой регуляции [106, 107, 123, 235]. Доказательством важной роли ЦСЖ в генезе многих заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) являются экспериментальные исследования по «переносу» с ликвором состояний сна и бодрствования, боли и анальгезии, двигательных функций и их нарушений, а также клинические работы, подтверждающие эффективность ликворо-терапии, включающей очистку ликвора от токсичных субстанций,
дренирование ликворных пространств, интрацистернальное и интраназальное введение донорского ликвора [12, 141, 174, 195, 368;]. Предполагается, что восстановление нарушенных функций мозга осуществляется благодаря регулирующему действию компонентов ликвора. Выполнение многообразных функций ЦСЖ в значительной мере обеспечивается полифункциональными белковыми и пептидными молекулами. Особое значение в регуляции деятельности мозга принадлежит нейропептидам, способным оказывать многостороннее влияние на функции многих органов и систем организма, в том числе осуществлять нейроиммунное взаимодействие [8, 42, 43, 82, 88, 173]. Образование пептидов происходит внутриклеточно путем ограниченного протеолиза (процессинга) высокомолекулярных белковых предшественников либо внекле-точно при протеолитическом распаде белков, в том числе сыворотки крови и ЦСЖ. Хотя сведения о нейропептидах в биологии многочисленны, их значение в развертывании воспалительного процесса и процессах саногенеза остается нераскрытым. Несмотря на информативность исследования белкового состава ЦСЖ, большинство существующих методов не нашло широкого применения в клинике из-за трудоемкости и ограниченной доступности оборудования и тест-систем, что диктует целесообразность усовершенствования методических приемов. Сведения о пептидном составе ликвора при нейроинфекционных заболеваниях фрагментарны и носят описательный характер, неясна их роль в патогенезе инфекционных заболеваний нервной системы, в связи с чем проведение данного исследования является актуальным.
Цель исследования - определить значение белков и пептидов ЦСЖ в клинической лабораторной диагностике и генезе нейроинфекционного процесса путем анализа патобиохимических изменений состава ЦСЖ и экспериментального изучения биологической активности фракций для усовершенствования диагностики, прогноза течения и исходов острых инфекционных заболеваний центральной и периферической нервной системы у детей.
Задачи исследования:
1. Изучить молекулярно-массовое распределение компонентов ЦСЖ и уточнить качественные и количественные характеристики белкового и пептидного спектров ЦСЖ при различных нозологических формах инфекционных заболеваний нервной системы у детей.
2. Разработать экспресс-метод фракционирования ЦСЖ путем гель-
фильтрации на сефадексе и определить содержание белкового и пептидного
пулов при различных инфекционных заболеваниях центральной и перифериче
ской нервной системы у детей.
Определить диагностическую и прогностическую значимость пептидного и белкового спектров ЦСЖ и их составляющих в генезе нейроинфекцион-ного процесса, выявить маркеры повреждения мозга и варианты интратекального ответа на вирусную и бактериальную инфекцию.
Разработать алгоритм патобиохимической оценки ЦСЖ при вирусных и бактериальных нейроинфекциях у детей.
Изучить экспериментальным путем иммуномодулирующее действие компонентов ЦСЖ при нейроинфекциях у детей.
Определить бактерицидную активность фракций ликвора на клинических штаммах менингококка, пневмококка и гемофильной палочки.
Уточнить патогенез инфекционных заболеваний нервной системы и механизмы пато- и саногенетического воздействия ЦСЖ в клинике и эксперименте для усовершенствования терапии острых нєйроинфекций у детей.
Научная новизна. С использованием высокоразрешающих методов биохимического анализа получены новые данные о молекулярно-массовом распределении компонентов ЦСЖ, охарактеризован спектр низкомолекулярных компонентов, качественный и количественный белковый состав при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей.
Разработан экспресс-метод фракционирования ЦСЖ при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей путем
гель-фильтрации на сефадексе G-50 для определения белкового и пептидного пулов с подсчетом их абсолютного содержания и соотношения.
Показано значение определения белков и пептидов ЦСЖ в клинической лабораторной диагностике нейроинфекционных заболеваний у детей для дифференциации вирусной и бактериальной природы заболевания, прогнозирования характера его течения и исхода, уточнении ведущих патогенетических механизмов.
Установлены качественные и количественные особенности белкового и пептидного спектра ликвора при менингитах и энцефалитах, определены маркеры повреждения мозга и варианты интратекального ответа на вирусную и бактериальную инфекции.
Выявлено в эксперименте in vitro и in vivo регулирующее влияние высоко- и низкомолекулярных фракций ЦСЖ на системные реакции крови и бактерицидное действие на основные возбудители бактериального менингита.
Разработан алгоритм патобиохимической оценки ЦСЖ и уточнены ин-тратекальные механизмы пато- и саногенетического воздействия ликвора, позволяющие усовершенствовать терапию нейроинфекционных заболеваний у детей,
Практическая значимость работы. Разработанный экспресс-метод фракционирования ЦСЖ гель-фильтрацией на сефадексе G-50 доступен для применения в клинике, позволяет определять белково-пептидный состав ликвора, коррелирующий с характером и выраженностью нейроинфекционного процесса. Исследование особенностей качественного и количественного состава высоко- и низкомолекулярных компонентов ЦСЖ при различных нозологических формах инфекционных заболеваний нервной системы способствует не только ранней объективной оценке тяжести интратекального воспаления, прогнозированию течения и исходов заболевания, но и определению тактики дифференцированной терапии с применением дезинтоксикационных, дегидратационных и антибактериальных средств, что позволяет снизить ле-
тальность и частоту инвалидизирующих нарушений при нейроинфекдиях у детей.
Результаты работы использованы при разработке методических рекомендаций: «Ликворотерапия в комплексном лечении сверхострых и тяжелых форм нейроинфекдий у детей»; «Диагностическое значение исследований клеточных реакций и белков ликвора при гнойных менингитах у детей»; «Прогнозирование течения и исходов острых бактериальных менингитов у детей», пособий: «Ранние и поздние дифтерийные полинейропатии у детей»; «Гемо-фильные менингиты у детей: эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика». По результатам исследования получен патент на изобретение: «Способ прогнозирования течения и исходов бактериальных менингитов у детей» [№ 2141668 (1999 г.)].
Основные научные положения, выносимые на защиту: 1. Особенности белково-пептидного состава ЦСЖ, спектра высоко- и низкомолекулярных компонентов зависят от этиологии нейроинфекционного заболевания и тяжести повреждения нервной системы у детей, с чем связаны различные варианты интратекального ответа.
Экспресс-метод фракционирования ЦСЖ на основе метода гель-фильтрации на сефадексе G-50 позволяет определять белковый и пептидный пул ликвора, характер изменения которых коррелирует с нозологической формой и особенностями течения инфекционных заболеваний центральной и периферической нервной системы у детей.
Исследование качественного и количественного белково-пептидного состава ЦСЖ при нейроинфекциях у детей позволяет дифференцировать вирусную и бактериальную природу заболевания, уточнять ведущие патогенетические механизмы, прогнозировать течение и исход заболеваний.
4. ЦСЖ оказывает иммуномодулирующее действие на системные реакции
крови и бактерицидное — на актуальные возбудители бактериальных менинги
тов, наиболее выраженное в отношении менингококка.
5. В патогенезе инфекционных заболеваний нервной системы большое значение имеют белковые и пептидные компоненты ЦСЖ, которые оказывают как повреждающее действие за счет избыточного поступления в ЦСЖ высокомолекулярных компонентов (белки зоны медленных лосттрансферринов и макроглобулинов) и гидрофобных пептидов, способствующих нарастанию общемозговой, менингеальной и очаговой симптоматики, так и реабилитационное, благодаря наличию белков, обладающих антиоксидантной, ингибиторной и транспортной функцией, регуляторних нейропептидов, восстанавливающих функциональную активность иммунокомпетентных клеток и ассоциативные связи.
Апробация работы и внедрение в практику. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 31 Всесоюзной, Всероссийской и Межрегиональной научно-практической конференции: г. Звенигород - Всесоюзная конференция «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний» (1990); г. Новосибирск - конференция «Менингококковые инфекции и гнойные менингиты» (1990); г. Суздаль — Съезд врачей-инфекционистов (1992); г. Санкт-Петербург - Международный симпозиум «Эндогенные интоксикации» (1994); г. Москва - Конгресс педиатров России «Современные технологии в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний у детей» (1995); г. Нижний Новгород - VH Всероссийский съезд неврологов (1995); г. Москва- Ш Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (1996); г. Саратов - 11 Всероссийская конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс» (1998); г. Санкт-Петербург- II Международная конференция «Идеи Пас-тера в борьбе с инфекциями» (1998); г. Санкт-Петербург - Конференция «Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика» (1999); г. Санкт-Петербург — Конференция «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней» (1999); г. Москва - Дни национальной лабораторной медицины ( 1999 ); г. Москва - VI конгресс педиатров России «Неотложные состояния у детей» (2000); г. Москва - Конференция «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (2000); г. Санкт-Петербург - 10 совмест-
ная конференция «Нейроиммунология» и научно-практическая конференция неврологов (2001), г. Санкт-Петербург - Всероссийская конференция « Дни иммунологии» ( 2001); г. Санкт-Петербург - Межрегиональная научно-практическая конференция «Современные проблемы детской инфектологии» (1997); г. Санкт-Петербург - 10-я Юбилейная Республиканская научно-практическая конференция «Проблема гастроэнтерологических и целевых капельных инфекций», посвященная 70-летию НИИДИ (1997); г. Санкт-Петербург — Всероссийская научно-практическая конференция «Детские инфекции на рубеже XXI века: настоящее и будущее» (1999); г, Санкт-Петербург - Юбилейная научно-практическая конференция, посвященная 140-летию кафедры душевных и нервных болезней ВМА, «Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний» (2000); г. Санкт-Петербург - итоговые научно-практические конференции «Актуальные вопросы детской инфектологии» (ежегодно с 1990 по 2002 г.), на заседаниях биохимического общества (СПб., 999), общества инфекционистов (СПб, 2000, 2002 г.); общества педиатров СПб (2001), ассоциации детских и взрослых неврологов (СПб.,1999, 2000,2001, 2002 г.).
Результаты исследования апробированы и используются при обследовании больных в лаборатории функциональных и лучевых методов диагностики, на отделении нейроинфекций и реанимации НИИ детских инфекций г. Санкт-Петербурга; в биохимических лабораториях городской больницы г.Череповца Вологодской области; инфекционной больницы № 21 г. Волгограда; детской инфекционной больницы г. Краснодара; Российского нейрохирургического института им. А.Л. Поленова; областной клинической больницы Оренбургской области. Материалы диссертации используются при обучении ординаторов, аспирантов и врачей на рабочих местах в НИИ детских инфекций, при проведении лекционных и практических занятий ФПК и ПП СПбГПМА.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 работы, в том числе 9 - в центральных журналах, в главе монографии «Бактериальные
менингиты у детей», 3 — в методических рекомендациях, 2 - в пособиях для врачей, утвержденных Минздравом России. Получен патент на изобретение.
Связь с планами НИР. Работа выполнена в соответствии с государственной научно-исследовательской тематикой (№ государственной регистрации 01.9.80003542), плановыми темами НИР НИИ детских инфекций (1989-1999 гг.)
Структура диссертации. Диссертация изложена на 225 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя использованной литературы (384 источника). Текст иллюстрирован 41 таблицей и 22 рисунками.
Образование, циркуляция и основные функции цереброспинальной жидкости
Вопросы образования, циркуляции и резорбции ЦСЖ в норме и патологии изучены достаточно полно [19,104,185,188]. Установлено, что большая часть ЦСЖ продуцируется сосудистыми сплетениями желудочков мозга, однако от до 60% ликвора может образовываться эпендималышми клетками желудочков, мозговой паренхимой, кровеносными сосудами мягкой мозговой и арах-ноидальной оболочек. Величина продукции зависит от рефлекторных влияний, скорости резорбции и давления в ликворной системе. Количество ликвора составляет около 10% от массы головного мозга. В сутки секретируется до 500 мл в зависимости от возраста ребенка. Скорость образования составляет 0,2-0,8 мл/мин. Механизм образования ЦСЖ сложен и включает фильтрацию, активный и пассивный транспорт. Вероятно, вода и некоторые ионы попадают в лик-вор благодаря диффузии, другие вещества переносятся с помощью специальных транспортных белков, встроенных в мембраны пограничных клеток.
Благодаря непрерывности образования ликвора, согласованности движения ресничек эпителия, небольшим перепадам гидростатического давления в ликворных пространствах, пульсации черепно-мозговых артерий и изменениям венозного давления происходит циркуляция ЦСЖ. Из боковых желудочков ли-квор поступает в Ш желудочек, затем через сильвиев водопровод в IV, откуда переходит в базальную цистерну и сгошалыюе субарахноидальное пространство. Из базальной цистерны по ликвороносным каналам и ячеям субарахнои-дального пространства поступает в кору головного мозга. В процессе циркуляции ликвор омывает практически все структуры головного и спинного мозга, находясь в непосредственной близости от мозговой ткани, в том числе серого вещества, обладающего высокой метаболической активностью. Резорбция ликвора, по мнению большинства исследователей, происходит в просвет синусов твердой мозговой оболочки, особенно в верхний сагиттальный синус. Полагают, что в резорбции принимают участие все пограничные с ликвором клеточные мембраны - эпителий оболочек цереброспинальной системы, паренхима мозга, периневральные и периваскулярные пространства.
В последнее время существенно расширились представления о функциях ЦСЖ [1, 106, 107, 172, 185, 189]. Считают, что, помимо функции механической и иммунологической защиты, трофики и дренирования мозга, важнейшими являются ее регулирующие функции, направленные на поддержание адекватной деятельности мозга не только в норме, но и при патологии. Основанием для этих утверждений послужили биохимические, экспериментальные и клинические данные.
В эксперименте выявлена возможность «переноса» с ликвором тех или иных состояний сна и бодрствования, страха и агрессии, двигательных нарушений, способности к обучению, обнаружено воздействие компонентов ликво-ра в норме и при заболеваниях ЦНС на некоторые метаболические процессы и функциональную активность клеток [22, 122, 174, 198, 207, 242, 291, 372]. В клинике доказана эффективность ликворотерапии, включающей, эндолюмбаль-ное и интраназалыюе введение ликвора доноров при лечении тяжелых заболеваний ЦНС и проведение ликворосорбций, направленных на удалении из ЦСЖ патологических метаболитов [12, 22, 72, 141, 150, 195, 368]. Выдвинуты различные предположения о механизмах положительного клинического эффекта ликворотерапии, в значительной степени, опирающиеся на присутствие в ЦСЖ биологически активных веществ и предполагающих не столько заместительную, сколько регулирующую функцию ЦСЖ.
В составе ЦСЖ обнаружены различные классы биологически активных веществ, включая гормоны, нейропептиды, цитокины, ферменты и их ингибиторы, простагландины, нейромедиаторы и др. [49, 92, 94, 105, 179, 180, 181, 188, 197, 375]. Непосредственная близость к нервной ткани, особенно в цир-кумвентрикулярной области, широкое представительство в ликворе разных классов биологически активных веществ, клинико-экспериментальные исследования, позволили выдвинуть концепцию об интегративной, нейрогумораль-ной функции ЦСЖ, направленной на сохранение внутричерепного гомеостаза и регуляцию деятельности мозга и всего организма в целом [106].
Таким образом, современные сведения об образовании, циркуляции и функциях ЦСЖ предполагают ее значимость в патогенезе заболеваний ЦНС, однако участие компонентов ликвора в течении и исходах нейроинфекционных заболеваний определено не полностью.
Состав ЦСЖ формируется из трех основных источников - сыворотки крови, мозговой паренхимы, продуктов метаболизма и распада клеток ликвора [188, 235]. Поступление компонентов в ликвор регулируется структурами гема-тоэнцефалического барьера, обеспечивающего селективное проникновение в ликвор различных молекул [188, 310, 329 331]. Анатомически ГЭБ - это хорио-идные сплетения, арахноидальная оболочка, церебральный микроваскулярный эндотелий [14, 19, 104, 185]. Плотные контакты эндотелиальных клеток, ба-зальной мембраны, астроцитарных и микроглиальных отростков не пропускают в ликвор клетки и макромолекулы, обеспечивая гомеостаз в микросреде ЦНС. Поступление веществ в ликвор происходит посредством простой диффузии, активного и пассивного транспорта. Установлено, что переход белков из крови в ликвор осуществляется в соответствии с величиной молекулы и ее гидродинамическим радиусом.
Данные литературы свидетельствуют о том, что для диагностики нейроинфекционных заболеваний значимым, наряду с определением клеточного состава, является определение общего содержания белка и белковых составляющих [95, 103, 114, 129, 154-157, 165, 188, 197, 199, 238, 239, 302, 317, 336, 344, 351, 353]. Для исследования белков и пептидов в ликворе используют разнообразные биохимические и иммунологические методы, включая электро-форетическое фракционирование, изоэлектрофокусирование, различные приемы иммунохимической техники, высокоэффективную жидкостную хроматографию [103-105, 188, 211, 220, 224, 225, 236, 249, 281, 337, 341, 358]. Однако болыштство использованных методов имеет ограниченную доступность для применения в клинике, поэтому основным лабораторным диагностическим критерием продолжает оставаться определение общего белка и цитоза.
Экспериментальное исследование биологической активности фракций ЦСЖ in vivo па модели пневмококкового менингоэнцефалита у кроликов
Биологическая активность фракций ликвора исследована на модели пневмококкового менингоэнцефалита (ПМЭ) у 100 кроликов при включении в терапию цельного ликвора и его высоко- и низкомолекулярной фракций. Для отработки контрольных исходных показателей предварительно на 27 животных обоего пола массой 1,5-2,0 кг воспроизводился пневмококковый менингоэнце-фалит путём интрацистернального введения взвеси пневмококка 1 серотипа (105 КОЕ/мл). Введение взвеси пневмококка и извлечение биологических жидкостей проводили при обезболивании 0,5 % раствором тиопентала натрия с 20 % оксибутиратом натрия.
Исследованы биохимические, иммунологические, бактериологические, вирусологические и морфологические показатели у кроликов до заражения и в период развития пневмококкового менингоэнцефалита при различных схемах терапии (совместно с сотрудниками отделения нейроинфекций, бактериологической, вирусологической, иммунологической и патоморфологической лабораторий НИИ детских инфекций).
Клетки ликвора подсчитывали в камере Фукс-Розенталя и в окрашенных по Романе веко му-Гимза мазках клеточного осадка после 5-минутного центрифугирования в силиконированной пробирке объёмом 0,5 мл при 1000 об/мин. Функциональную активность В-лимфоцитов определяли в реакции блаеттранс-формации (РБТЛ), спонтанной или стимулированной многоспецифической бараньей антисывороткой против иммуноглобулинов кролика (производства ИЭМ им. Гамалея). Подсчитывали число бластов в культуре цельной крови через 72 часа после введения митогена с определением стимуляции. Киллерную функцию лимфоцитов крови определяли в тесте антителозависимой цитоток-сичности лимфоцитов (АТЦЛ) в модификации Г.Ф.Железниковой [63].
Исследование белкового состава крови и ликвора проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в собственной модификации. Перед фракционированием сыворотку разбавляли в 50 раз, ликвор центрифугировали и наносили от 0,08 до 0,15 мл. надосадочной жидкости на трубочку. Осуществляли подсчёт процентного содержания белковых фракций после ден-ситометрии окрашенных амидо-чёрным 10В электрофореграмм на денситометре ДМ-1, работая в режиме интегрирования.
Исследование эффективности ликворотрансфузии (ЛТ) проведено на 100 кроликах с пневмококковым менингоэнцефалитом, разбитых на 5 групп в соответствии с применяемыми схемами лечения. В первой группе лечение не проводили, во второй (контрольной группе), проводили антибиотикотерапию внутримышечными инъекциями пенициллина в суточной дозе 150000 ед/кг. В остальных трёх группах наряду с антибиотикотерапией применяли ЛТ цельным ликвором донора-реконвалесцента гнойного менингита (3-я группа), его низкомолекулярной фракцией (4-я группа,), и высокомолекулярной фракцией (5-я группа). Фракции ликвора получены гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Иммунологические, биохимические, бактериологические и патоморфоло-гические исследования проводили до ЛТ и спустя 2, 4, 6 и 11 суток после неё.
Исследованы качественный и количественный клеточный и белковый состав крови и ликвора, содержание интерферона и его тип, определена функциональная активность иммунокомпетентных клеток (ИКК) крови в реакции бласт-трансформации лимфоцитов (РБТЛ) и антителозависимой цитотоксичности лимфоцитов (АЗЦЛ) [63]. В крови и ликворе 20 кроликов, предварительно (за 6 нед до заражения ПМЭ) иммунизированных апатогениым штаммом вируса болезни Ньюкасла (ВБН), определяли титр антител к этому вирусу. Патоморфо-логические исследования включали оценку секционного материала оболочек и ткани мозга кроликов с окрашиванием гистологических срезов по Ван-Гизону и Нисслю.
Статистическая обработка данных клинических и экспериментальных исследований проводилась на персональном компьютере IBM «Pentium 1 »5 параметрическими методами описательной статистики на основании критериев Стьюдента с учетом характера изучаемых явлений, используя стандартный пакет прикладных программ Excel 97 фирмы «Microsoft». Различия сравниваемых лабораторных показателей считали достоверными при р 0,05. При проведении корреляционного анализа связь оценивали как сильную при абсолютном значении г 0,7, среднюю - при г — 0,69-0,3, слабую - при г 0,2. Используемый математический аппарат также позволяет определять достоверность коэффициента корреляции .Молекулярно-массовое распределение компонентов ЦСЖ при исследовании методом гель-фильтрации на сефадексе
Распределение компонентов ЦСЖ по молекулярной массе исследовали методом гель-фильтрации на сефадексах G-25 superfine и G-50 fine. Аналитический вариант (см. главу 2) применен для первичной характеристики молеку-лярно-массового распределения компонентов ЦСЖ, экспресс-метод, разработанный с целью широкого использования в клинике, - для определения содержания двух основных пулов ликвора - высокомолекулярного (белкового) и низкомолекулярного (пептидного) и их соотношения при различных нозологических формах острых нейроинфекций у детей. Аналитическим вариантом исследовано 56 образцов ЦСЖ, полученных от 28 больных бактериальным менингитом и 10 образцов ликвора пациентов контрольной группы (ОРВИ). Экспресс-методом гельфильтрации на сефадексе G-50 исследовано 400 образцов ликвора, полученных от 255 больных бактериальными и вирусными нейроин-фекциями, и 20 пациентов с ОРВИ, составивших контрольную группу.
Обсуждение. Диагностическое значение оценки молекулярно-массового распределения компонентов ЦСЖ при острых нейроинфекциях у детей
С целью разработки новых диагностических и прогностических критериев, доступных для использования в нейроинфекционной клинике, нами проведено исследование распределения компонентов ЦСЖ по молекулярной массе у детей с бактериальными и вирусными менингитами, энцефалитами, полиней-ропатиями.
Исследование распределения компонентов в биологических жидкостях по величине молекулярной массы возможно при использовании различных методических подходов. Наиболее доступным, технически несложным и широко используемым в биологии приемом является гель-фильтрация (гель-хроматография) на сефадексах различных марок [53]. Для анализа состава ЦСЖ мы применили модификации метода с использованием сефадексов марки G-25 superfine и G-50 fine, (Швеция). Сефадекс G-25 рекомендован для разделения компонентов с мол. массой менее 5 кД, сефадекс G-50 - для компонентов в диапазоне мол. масс от 5 до 30 кД. Для отработки оптимального режима фракционирования ликвора нами были использованы колонки с различной величины: 2,4 х 38 см и 12 х 1,2 см (глава 2).
При фракционировании ЦСЖ на сефадексе G-25 размером 2,4 х 38 см выявлена гетерогенность низкомолекулярной фракции, зависимость молеку-лярно-массового распределения от клинических особенностей течения заболевания. Однако длительность проведения анализа (4-5 часов), потребность в достаточно больших объемах ликвора (0,8-1,5мл) не позволяла широко использовать его в детском инфекционном стационаре.
С целью быстрого анализа молекулярно-массового распределения компонентов ЦСЖ при нейроинфекционном процессе нами разработан экспресс-метод фракционирования ликвора, заключающийся в использовании колонок небольшого размера (12 х 1,2 см), заполненных сефадексом G-50 fine, подсчете абсолютного содержания двух основных фракций — высокомолекулярной (белковой) и низкомолекулярной (пептидной) и их соотношения. При его использовании требовалось не более 0,2-0,4 мл ЦСЖ, что в пересчете на количество белка составляло от 80 до 150 мкг на колонку. Высокая чувствительность метода обусловлена выбором в качестве элюента дистиллированной воды, имеющей минимальное, по сравнению с фосфатными буферами, поглощение при длине волны 200 нм. Предварительно проведенная спектрофотометрия ликвора также показала максимальную оптическую плотность при длине волны 200 нм, характерной для многих веществ, в том числе пептидных связей. Предложенный способ расчета абсолютного содержания ВМФ и НМФ позволил варьировать наносимые объемы в зависимости от имеющегося в распоряжении ликвора и общего содержания белка. Время проведения анализа не превышало 1,5-2 часов. Воспроизводимость оказалась высокой и составила в среднем 5-6 %.
С помощью экспресс-метода проведено фракционирование с последующим расчетом абсолютного содержания белкового и пептидного пулов 460 образцов ликвора детей с инфекционными заболеваниями центральной и периферической нервной системы. Полученные результаты позволили уточнить некоторые аспекты патогенеза этих заболеваний, установить диагностическую и прогностическую значимость исследования белково-пептидного состава ЦСЖ и внедрить метод в клиническую практику.
Наиболее значительные изменения белково-пептидного состава выявлены при БМ у детей, особенно пневмококковом, а также БМ любой этиологии с осложненным течением заболевания. Уже в остром периоде различия состава ЦСЖ в зависимости от тяжести течения были достоверны, что позволило рекомендовать использование этого метода для раннего прогнозирования течения бактериального менингита и возникновения резидуальных последствий. Фракционирование ликвора оказалось также информативным для выяснения ведущего патогенетического механизма БМ - интоксикации или отека головного мозга. При формировании ОГМ наблюдали 5-7 -кратное увеличение содержания ВМФ с превышением уровня ВМФ над НМФ, тогда как при ИТШ степень увеличения фракций ликвора была менее значительной ( не более, чем в 2-4 раза выше «нормы») и превалировало увеличение НМФ. Оценка фракционного состава ЦСЖ позволила на ранних стадиях корректировать проводимую терапию. Выявленные при БМ изменения белково-пептидного состава явились отражением основных аспектов бактериального нейроинфскционного процесса - резкого увеличения проницаемости ГЭБ с поступлением в ликвор дополнительных белков сыворотки крови, активации процессов катаболизма, приводящего к возрастанию уровня продуктов белкового распада, выраженных нарушений ликворо- и гемодинамики, токсинемии
При вирусных энцефалитах и менингитах изменения состава ЦСЖ были менее значительны, но также коррелировали с этиологии заболевания, тяжестью поражения мозговой паренхимы, динамикой процесса и его исходом. В отличие от БМ, воспалительный процесс при энцефалитах отличается преимущественным поражением ткани мозга, включая глию, нейроны и сосуды, и вовлечение оболочек мозга является необязательным. До сих пор отсутствие четких критериев патологии ликвора при ВЭ является существенным препятствием как в диагностике острого воспалительного процесса в мозговой ткани, так и в определении степени поражения мозгового вещества при формировании стойкого патологического состояния, характерного для резидуальных последствий ВЭ.
Исследования фракционного состава ЦСЖ предложенным способом выявили максимальные изменения ВМФ и НМФ в остром периоде тяжелых многоочаговых и диффузных форм герпетического энцефалита у детей, свиде-тельствущие об активном воспалительном процессе с нарушением проницаемости ГЭБ, активацией деструктивных процессов в мозговой паренхиме, тогда как при очаговых формах ГЭ наблюдали преимущественное увеличение содержания НМФ ликвора. Изменения состава ЦСЖ при энцефалитах, вызванных укусом клеща, были незначительны, за исключением тяжелых хронически -прогредиентных форм. Минимальные отклонения от условной нормы обнаружены при серозных менингитах. Сопоставление неврологических данных и исследований ЦСЖ позволяют высказать мнение о значимости определения фракционного состава ЦСЖ при вирусных нейроинфекциях для суждения о тяжести поражения нервной ткани и определенном прогнозе заболевания. Тем более, что при клиническом анализе ЦСЖ только в половине случаев определялась белково- клеточная диссоциация при небольшом ( в пределах ста клеток) цитозе в ликворе, что не позволяет судить о тяжести и даже диагностике нейроинфекции.
Обсуждение результатов исследования белкового состава ЦСЖ при инфекционных заболеваниях нервной системы у детей
Электрофоретическое фракционирование для исследования белкового спектра ЦСЖ было предложено использовать с диагностической целью еще в 60-70-е годы, однако предлагаемые тогда методы (электрофорез на агаре, крахмале, ацетатцеллюлозе и других носителях) не нашли широкого применения из-за недостаточной чувствительности, необходимости предварительного концентрирования больших объемов ликвора [103, 188, 331]. Метод диск-электрофореза обладает более высокой разрешающей способностью и чувствительностью, не требует предварительного концентрирования разбавленных биологических жидкостей, что не только существенно укорачивает процедуру фракционирования, но и позволяет обходиться незначительными объемами ликвора для анализа. Сопоставление белкового спектра ЦСЖ и сыворотки крови, проведенное ранее с помощью этого метода, показало существенное увеличение в ликворе трех белков - преальбумина, фракции в постальбуминовой зоне («3») и в зоне быстрых посттрансферринов («6»), что позволило назвать эти фракции ликвороспецифичными [234].
Изменения белкового состава ЦСЖ при острых нейроинфекциях отражают различную степень нарушения проницаемости ГЭБ, вызванного вирусными или бактериальными возбудителями. Вирусный нейроинфекционный процесс сопровождается незначительным воспалением оболочек мозга и минимальным изменением проницаемости ГЭБ. Белковый состав ЦСЖ изменяется за счет избыточной секреции ликвороспецифичного преальбумина, изменения метаболизма и повреждения нервной ткани, интратекалъного синтеза иммуноглобулинов. Характерным для протеинограмм ликвора в остром периоде заболевания является незначительное увеличение абсолютного содержания преальбумина и острофазных белков постальбуминовой зоны. Дополнительные высокомолекулярные белки сыворотки крови в ЦСЖ практически не проникают. В хронической стадии вирусных энцефалитов характерным для белкового состава ликво-ра является увеличение уровня иммуноглобулинов (фракция «7»).
При бактериальном гнойном менингите проницаемость ГЭБ резко возрастает, что приводит к поступлению в ликвор не свойственных в норме высокомолекулярных белков сыворотки крови (полимеров гаптоглобина типа 2-1 и 2-2, бета-липопротеида), а также увеличению содержания макроглобулярного поливалентного ингибитора протеолитических ферментов альфа-2-МГ, в незначительном количестве присутствующего и в контрольных образцах ликвора. В то же время относительное содержание ликвороспецифичных белков уменьшается, что, вероятно, свидетельствует о нарушении процесса их синтеза, секреции и циркуляции в ликворном пространстве. Можно полагать, что увеличение содержания в ликворе острофазных белков, обладающих антиоксидант-ной и ингибиторной активностью (гаптоглобины, церулоплазмин, алъфа-2-МГ), носит компенсаторный характер, обеспечивая защиту мозга от гиперактивации свободнорадикального окисления и протеолиза, характерных для острого периода нейроинфекционных заболеваний.
Сопоставление белкового спектра ликвора при бактериальных менингитах разной этиологии в динамике выявило общие закономерности, свидетельствующие об общности их патогенеза. Однако более выраженные и длительные изменения белкового спектра ликвора обнаружены при пневмококкковом и гемофильном менингите у детей, что коррелирует с более тяжелым их клиническим течением и высокой частотой формирования неврологических дефицита в стадии реконвалесценции [162,168]. Анализ протеинограмм ЦСЖ в группах детей с БМ разной степени тяжести свидетельствует о достоверности различий их белкового спектра в остром периоде заболевания. Максимальные изменения выявлены у больных с отеком головного мозга.. Характерным для белкового спектра в этих случаях являлось многократное увеличение абсолютного содержания высокомолекулярных протеинов V и VI зон, сочетающееся с максимальным снижением относительного содержания ликвороспецифичных фракций. Столь выраженные диспротеинемические сдвиги свидетельствует о резком нарушении проницаемости ГЭБ, возможной потере его селективности, нарушении процессов ликворо- и гемоциркуляции.
Таким образом, исследование белкового спектра ЦСЖ методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле является информативным для дифференциации вирусной или бактериальной природы заболевания, уточнения этиологии бактериального менингита, выраженности воспалительного повреждения ткани мозга, ведущего патогенетического механизма. Маркерами бактериального менингита являются высокомолекулярные белки: галтоглобины типа 2-1 и 2-2, бета-лшюпротеид, альфа-2-МГ. Метод диск-электрофореза обладает высокой разрешающей способностью, не требует больших объемов ликвора для анализа и может быть рекомендован для использования в нейроинфекционной клинике в качестве дополнительного дифференциально-диагностического критерия.
![Особенности минерального обмена и диагностическая значимость его показателей у детей с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта с избыточной массой тела [Электронный ресурс]](/i/i/4283/182088.png "Особенности минерального обмена и диагностическая значимость его показателей у детей с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта с избыточной массой тела [Электронный ресурс] Соколова Наталья Александровна")
