Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы. 10
1. Ревматоидный артрит. 10
1.1 Этиология и патогенез ревматоидного артрита . 10
1.2 Гуморальный иммунитет при РА 12
1.3. Клеточный иммунитет при РА 14
1.5. Современные методы терапии РА 16
2. Белки теплового шока 21
2.1. Классификация, биологическая роль 21
2.2. БТШи РА 23
2.3.БТШиЭМП. 28
3. Реактивные формы кислорода и антиоксидантная система при ра 29
4. Биорезонансная терапия. 32
4.1. Энерго-информаиионные подходы в применении электромагнитных излучений 32
в лечебных цепях 32
4.2. Биорезонансная терапия. Принципы, методы, аппаратура. 35
4.3. Эффективность использования БРТ [61 39
5. АКУПУНКТУРНАЯ ТЕРАПИЯ. 42
6. РЕЗЮМЕ. 44
Глава II. 47
Методы исследований. 47
1. Характеристика пациентов. 47
2. Методики исследования синтеза белков лимфоцитами крови пациентов 48
4. Методики измерения ферментативной активности антиоксидантной системы лимфоцитов 50
5. Статистический анализ 52
6. Методики проведения БРТ и акупунктуры 53
Глава III. 54
Результаты и их обсуждение. 54
1. Синтез конститутивных и индуцибельных (БТШ) белков в лимфоцитах крови человека в состоянии здоровья, при РА и других патологиях . 54
1.2. Синтез конститутивных белков и индуцибельных тепловым шоком стресс белков в лимфоцитах здоровых людей 54
1.3. Синтез конститутивных белков и индуцибельных тепловым шоком стресс белков в лимфоцитах крови больных РА 55
1.4. Синтез конститутивных белков и индуцибельных тепловым шоком стресс бечков лимфоцитами человека при других заболеваниях. 56
1.5. Обсуждение полученных результатов. 63
2. Изменение синтеза конститутивных и индуцибельных тепловым шоком (стресс белков или БТШ)
белков в лимфоцитах крови человека при РА и других патологиях в результате проведения БРТ и акупунктурної! терапии 66
2.1. Изменения в синтезе белков лимфоцитами крови больных РА в результате проведения БРТ. 67
2.2. Изменения в клинических проявлениях РА у больных в результате проведения БРТ. 70
2.3. Изменения синтеза белков лимфоцитами человека в результате проведения БРТ при других заболеваниях 73
2.4. Изменения синтеза белков лимфоцитами человека в результате акупунктуриых воздействий при РА и других патологиях. 73
2.5. Обсуждение полученных результатов 76
3. Изменение активности антиоксидантной системы лимфоцитов при РА в результате проведения БРТ.
77
3.1. Результаты исследований АОСлимфоцитов при РА в процессе БРТ. 78
3.2. Обсуждение полученных результатов 80
Заключение 86
Выводы.
Список литературы. 92
- Ревматоидный артрит.
- Этиология и патогенез ревматоидного артрита
- Методики исследования синтеза белков лимфоцитами крови пациентов
- Синтез конститутивных и индуцибельных (БТШ) белков в лимфоцитах крови человека в состоянии здоровья, при РА и других патологиях
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим прогрессирующим системным заболеванием неизвестной этиологии, связанным с аутоиммунными нарушениями. Несмотря на успехи современной медицины, проблема лечения РА во многом остается пока нерешенной. По литературным данным этим недугом страдают от 1 до 2 % населения мира [56, 219], что ярко демонстрирует актуальность исследований этиопатогене-за РА и поиска эффективных методов его терапии.
Для РА характерна аутоиммунная агрессия против собственных тканей (суставов), которая, как ни странно, сочетается с гипореактивностью Т-клеток [201]. И белки теплового шока или стресс белки (БТШ), как считают, могут выполнять ключевую роль в нарушении иммунной толерантности и функциональной недостаточности лимфоцитов одновременно [228]. С одной стороны, при экспериментальном моделировании артритов на животных показано, что введение грызунам БТШ 65 кД из Mycobacterium tuberculosis в сочетании с полным адьювантом Фрейнда инициирует артрит, напоминающий РА человека [225]. С другой стороны, на этих же моделях доказано, что предварительная стимуляция иммунитета к собственному БТШ 60, используя бактериальный БТШ 60 или его консервативные пептиды, повышает резистентность к последующей индукции артрита [223].
Исследования аутореактивности к собственным БТШ у больных РА действительно обнаружили наличие аутореактивных Т-клонов, пролиферирующих в ответ на стимуляцию БТШ 60 кД, а также антител против собственных стресс белков. Однако они не являются уникальными для данного заболевания и обнаруживаются при большинстве других воспалительных заболеваний (инсулинзависимый диабет, болезнь Крона, ювенильный РА, реактивный артрит, болезнь Бехчета, красная волчанка, множественный склероз). Кроме того, анти-БТШ Т-клоны нередко встречаются у здоровых лиц, особенно, пожилого возраста [227].
В настоящее время иммунные реакции против БТШ рассматриваются скорее как регу-ляторные или защитные, чем патогенные [113, 122, 224]. Исследования иммуногенности отдельных пептидов БТШ 60, 70 кД показали, что БТШ несут консервативные участки, которые при предоставлении иммунным клеткам в совокупности с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) исполняют роль костимулирующих сигналов для тех или иных Т-клеточных популяций [122, 173, 188]. Предполагают, что нарушение данного механизма может приводить к поломке иммунного узнавания "свой-чужой", а также являться причиной гипореактивности Т-клеток.
Тем не менее, стресс белки выполняют более общую биологическую функцию в клетках: индуцируясь в ответ на неблагоприятные изменения окружающей среды (стрессовые воздействия), синтез БТШ обеспечивает один из механизмов адекватной неспецифической клеточной защиты, стабилизируя ДНК-белковые комплексы и препятствуя агрегации внутриклеточных белков [50]. И нарушение этого звена защитных механизмов не может не отражаться на функциональной активности клеток организма, в том числе и лимфоцитов. При РА в крови больных имеется целый ряд стрессовых факторов для иммунных клеток (инфекция, аутоиммунные комплексы, свободные радикалы кислорода и др.) [205], которые могут определять способность лимфоцитов синтезировать БТШ как одну из критических для выполнения ими иммунных функций. В связи с этим мы рассматриваем изучение роли синтеза стресс белков лимфоцитами крови при РА актуальным для исследования этиопатогенеза данного заболевания.
Антиоксидантная система также принимает непосредственное участие в обеспечении механизмов неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия внешней и внутренней среды, поскольку ее компоненты, препятствуя генерации высоких концентраций реактивных форм кислорода (РФК) при повышенных физиологических нагрузках, поддерживают жизненно важный окислительно-восстановительный гомеостаз в клетках и организме в целом. Срыв антиоксидантной защиты приводит к резкой активации образования РФК, к развитию «окислительного стресса», который может стать причиной устойчивого патологического состояния.
Окислительный стресс рассматривается одним из важных повреждающих факторов при РА: постоянная генерация РФК в суставах больных активированными нейтрофилами и макрофагами, а также за счет циклично повторяющихся процессов гипоксии-реперфузии при работе суставов, приводит к повреждению синовиальных клеток, разрушению хряща и эрозии костной ткани [94]. Более того, показано, что низкий антиоксидантный статус клеток и тканей организма является рисковым фактором для данного заболевания [29,99].
Существует гипотеза, что система антиоксидантной клеточной защиты (глутатион, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, супероксиддисмутаза, каталаза и др.) и система индукции синтеза БТШ (70 кД, 32 кД - гемоксигеназа и др.) находятся в тесной взаимосвязи и являются частью общей системы биологической защиты клеток [114]. Известно, что РФК оказывают регулирующее действие на транскрипционные факторы, управляющие экспрессией генов, ответственных за ограничение воспалительной реакции [207]. Факторы транскрипции генов стресс белков (heat shock transcription factors, HSTF) также активизируются при
генерации РФК, что приводит к повышенному синтезу БТШ, состав которых в целом соответствует таковому при их индукции тепловым шоком.
Важная роль АОС в ограничении оксидативньгх процессов, поддерживающих хроническое иммунное воспаление при РА, и взаимосвязь последних с системой индукции синтеза стресс белков определяет актуальность проблемы исследования АОС и стресс белков во взаимодействии, как два звена единой неспецифической клеточной защиты от повреждающих факторов РА при развитии заболевания.
Важным инструментом при исследовании роли АОС и стресс белков при РА могут быть воздействия на организм больного РА сверхслабыми электромагнитными сигналами с биогенными частотными характеристиками и акупунктуры. Согласно многим исследованиям [6,17, 83], использование БРТ и акупунктуры приводит к ряду физиологических изменений у пациентов (обезболивание, нормализация или повышение секреции некоторых нейропепти-дов и гормонов, улучшение микроциркуляции, нормализация функций ЦНС и сердечнососудистой системы, повышение иммунологической реактивности организма и резистентности к инфекционным агентам и др.), которые в целом позволяют охарактеризовать их действие как стресс-лимитирующее [31]. И АОС и БТШ могут быть эффекторами при данных воздействиях.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось исследование значения способности лимфоцитов крови (периферических мононуклеаров) синтезировать БТШ и активности внутриклеточной АОС в развитии патологических процессов при РА как одних из механизмов неспецифической биологической защиты при стрессовых воздействиях.
Для достижения поставленной цели мы сформулировали следующие задачи:
Провести оценку способности лимфоцитов синтезировать конститутивные и инду-цибельные стрессовым воздействием (БТШ) белки у больных РА в зависимости от тяжести патологических процессов заболевания.
Провести оценку состояния АОС в лимфоцитах крови больных РА.
Изучить влияние БРТ на способность лимфоцитов крови больных РА синтезировать БТШ.
Изучить влияние БРТ на активность АОС в лимфоцитах крови больных РА.
Провести сравнительный анализ изменений состояния больных РА в зависимости от антиоксидантного статуса их лимфоцитов крови.
Исследовать вероятную взаимосвязь активности АОС и индукцией БТШ в лимфо-
цитах крови при РА как два звена одной неспецифической системы биологической защиты.
Научная новизна.
Впервые проведены исследования состояния синтеза стресс белков в периферических лимфоцитах (мононуклеарах) при РА. Обнаружено, что индукция синтеза стресс белков при данном заболевании имеет низкий уровень, зависимый от тяжести и продолжительности патологии. Аналогичное исследование на лимфоцитах крови больных другими заболеваниями (инсулинзависимый диабет, бронхиальная астма, язвенная болезнь желудка, остеохондроз и др.) показало, что неспособность лимфоцитов крови адекватно реагировать на стрессовое воздействие in vitro, а именно индуцировать повышенный синтез стресс белков, не является уникальной для ревматоидного артрита и других заболеваний аутоиммунного происхождения и свойственна патологическим состояниям, сопровождающимся общей иммунодепрес-сией.
Стимуляция синтеза стресс белков в лимфоцитах крови больных РА, например малыми дозами электромагнитных воздействий с биогенными характеристиками (биорезонансная терапия) приводит к ограничению воспалительных процессов и улучшению общего состояния больных.
Полученные данные свидетельствуют о фундаментальной важности БТШ в обеспечении лимфоцитов нормальной функциональной активностью, являясь одним из механизмов неспецифической резистентности клеток в условиях хронического воспаления.
Впервые при РА проведены исследования антиоксидантной системы лимфоцитов крови во взаимосвязи с их способностью индуцировать синтез стресс белков. Показано, что повышение концентрации небелковых носителей тиоловых групп (глутатиона) и стимуляция синтеза стресс белков являются частью единого процесса увеличения неспецифической сопротивляемости иммунных клеток при биорезонансной терапии ревматоидного артрита.
Впервые выявлено, что одними из эффекторов лечебной эффективности биорезонансной терапии при РА являются стресс белки и антиоксидантная система лимфоцитов крови больных.
Теоретическое значение работы.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что стимуляция естественных адаптивно-компенсаторных механизмов, например, способности клеток организма синтезировать БТШ, при РА, а также других патологиях, сопровождающихся хроническим иммунным воспалением, можно и необходимо использовать в качестве одного из стратегических направлений при выборе подходов и методов лечения РА и других воспалительных за-
болеваний хронического характера.
Индукция синтеза БТШ в иммунных клетках при иммунодепрессивных состояниях больных РА и другими патологиями обладает высоким терапевтическим потенциалом, поскольку при этом нормализуется исходно угнетенный синтез обычных, конститутивных белков и увеличивается резистентность клеток к стрессирующим факторам воспалительной реакции.
БРТ является важным инструментом для индукции стресс белков в иммунных клетках. Данный метод терапии при РА и других патологиях могут заменить иммуномодули-рующие препараты, лечебным компонентом которых являются БТШ бактериального происхождения, поскольку, увеличивая синтез собственных БТШ в иммунных клетках, также приводят к выраженным противовоспалительным эффектам в достаточно короткий срок и лишены каких-либо нежелательных побочных реакций для пациентов. Кроме того, БРТ можно использовать для повышения антиоксидантного потенциала иммунных клеток при РА.
Практическое значение работы.
Данные о возможности стимуляции синтеза собственных стресс белков и активности антиоксидантной системы в лимфоцитах крови больных РА методом биорезонансной терапии легли в основу методических рекомендаций по использованию биорезонансной терапии Минздрава Российской Федерации № 2000/74 от 2000 г.
Положения, выносимые на защиту.
Сниженная способность лимфоцитов крови синтезировать стресс белки и низкий антиоксидативный внутриклеточный потенциал данных клеток при РА являются одними из причин развития патологических процессов, в частности, хронизации воспалительной реакции организма, характерной для этого заболевания.
Стимуляция синтеза собственных стресс белков и нормализация активности компонентов антиоксидантной системы (система регуляции глутатиона) в иммунных клетках при РА обладают очевидным терапевтическим эффектом, ограничивая воспалительные процессы в организме.
Стресс-белки и антиоксидантная система являются важными звеньями единой системы неспецифической защиты иммунных клеток при иммунодепрессивных состояниях.
4. Важным инструментом для активизации синтеза стресс-белков и АОС при РА
является биорезонансная терапия.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 24 печатных работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах (Доклады Академии наук, 1999; Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1999; Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2002), 12 статей в сборниках трудов различных научных конференций и 9 тезисов.
Материалы диссертации были представлены на открытых научных конференциях молодых ученых г. Пущино 1996 и 1997 годов, на 6-ом Международном конгрессе по клеточной биологии в Сан-Франциско (США, 1996), на Международном конгрессе "Стресс и адаптация от молекул до человека" в Будапеште (Венгрия, 1997), на Международном симпозиуме "Структура белка, стабильность и фолдинг. Фундаментальные и медицинские аспекты" в Москве (1998), на П-ом съезде биофизиков России в Москве (1999), на международной научной конференции «Итоги и перспективы развития традиционной медицины в России» (Москва, 2002 ), на ежегодных международных конференциях "Теоретические и клинические аспекты биорезонансной и мультирезонансной терапии" в Москве (1996-2002 г.г.), и др.
Ревматоидный артрит.
Ревматоидный артрит (РА) определяют как хроническое воспалительное соединительнотканное заболевание с преимущественным поражением суставов по типу эрозивного артрита [54]. Это заболевание поражает от 1 до 2 % населения во всем мире, в большинстве своем женщин среднего возраста. Оно характеризуется хроническим воспалением синовиу-ма, в особенности небольших суставов, которое часто приводит к деструкции суставного хряща и прилегающей костной ткани [55].
Для хронического воспалительного синовита характерны повышенное количество клеток на поверхности синовиума, инфильтрация лимфоцитов в периваскулярной области вместе с агрегатами лимфоцитов и плазматических клеток в синовиуме, выступающее образование новых сосудов в синовиуме, а также рыхлый матрикс соединительной ткани, внутрь которого иммигрированы воспалительные клетки (рис.1) [209].
Заболевание затрагивает многие суставы и приводит к их эрозии и характерным деформациям (рис.2). При РА также наблюдаются и внесуставные поражения в виде характерных ревматоидных узелков, поражений сосудов, скелетных мышц и сердца, тканей легких, почек, нервной системы, лимфаденопатии. Все перечисленные проявления заболевания обусловливают повышенную смертность больных РА от инфекций, гематопоэтических злокачественных изменений, заболеваний сердечно-сосудистой системы, почек, а также осложнений, связанных с применением лекарств [174].
Этиология и патогенез РА до сих пор не выяснены. О возможной этиологической роли инфекционных агентов ведутся дискуссии в течение многих лет. В обширных литературных обзорах приводятся описания различных микроорганизмов как возможных этиологических факторов этой болезни [1,132,197], указывается на возможную роль бактерий (стрептококков, их L-форм, стафилококков, дифтероидов, клостридий, Yersinia enterocolitica), микоплазм, рикетсий. Однако к настоящему времени не получено убедительных данных в пользу инфекционной природы РА. В последнее время обращается внимание на роль вирусной инфекции, в особенности на медленные вирусы (slow viruses): хла-мидии, аденовирусы, энтеровирусы, а также вирус Эпштейна-Барр [196,208].
В настоящее время серьезно рассматривается фактор генетической предрасположенности к РА по антигенам HLA [5,166,236]. Обнаружено, что РА пациенты экспрессируют определенные HLA-DRB1 аллели (HLA-DRB 1 0401, 0404, 0405, 0408, 0101, 1402, 1001) с очень высокой частотой, приближающейся к 90 % [95]. Данные аллели были определены как ассоциированные с данным заболеванием. Тем не менее, нередкие случаи их отсутствия у больных РА предполагают, что HLA молекулы являются факультативным, но не абсолютным условием для развития заболевания [38,219].
Glynn L.E. [124] предположил, что какой бы ни был начальный инфекционный агент при РА, главным фактором в развитии заболевания является постоянный иммунный ответ организма. По его мнению, антигенами, на которые развивается продолжительный иммунный ответ, могут служить не сами этиологические агенты, вызвавшие РА, а медиаторы воспалительной реакции (измененный IgG, образовавшийся против инфекционного агента, фибрин, иммунные комплексы, деградированные продукты поврежденных клеток, цитоки-ны). Развившиеся клеточные и гуморальные аутоиммунные реакции на вышеуказанные медиаторы, в свою очередь, обусловливают продолжение иммунного воспаления.
По мнению большинства исследователей, иммунопатологические механизмы при РА связаны с аутоиммунными процессами, в частности с образованием иммунных комплексов (ИК) [13, 54]. В норме ИК фагоцитируются и выводятся из циркуляции. Патогенные ИК обычно больших размеров и растворимые, плохо фагоцитируются и поэтому находятся в циркуляции [170]. Отложение ИК в тканях вызывает увеличение проницаемости капилляров, а также выделение гистамина и серотонина; ИК имеют центральное значение в развитии васкулитов и других внесуставньгх проявлений РА.
В образовании ИК могут принимать участие разные факторы - антитела против коллагена, антинуклеарные факторы, ревматоидные факторы (РФ) и др. Однако наиболее характерны иммунные комплексы, в формировании которых участвуют РФ [13, 214]: при РА ревматоидные факторы выявляются в высоких титрах примерно в 60-90% случаев (серопо-зитивная форма). РФ характеризуются как аутоантитела, направленные против Fc-участка аутологичного IgG, претерпевшего конформационные изменения в организме больного (высокий уровень олигосахаридов типа Gal(0) Сц2 доменов цепей IgG) [165]. К РФ относятся антитела, принадлежащие к IgM и IgG, реже - к IgA и IgD [80, 235]. Биологическая роль и патогенетическое значение РФ при РА полностью не раскрыты. Предполагается, что IgG РФ в начале реагируют с аутологичными IgG, в результате чего образуются IgG-IgG комплексы. В дальнейшем их связывают IgM-РФ с образованием больших комплементсвязы-вающих комплексов. Эти комплексы фагоцитируются нейтрофилами синовиальной жидкости и покровными клетками синовиальной оболочки с последующим высвобождением лизо-сомных энзимов, что, в свою очередь, приводит к повреждению тканей при РА [104].
Особая разновидность ИК (IgM-РФ и IgG-РФ) преципитирует аутологичный IgG на холоду, образуя криоглобулины. IgM-IgG криоглобулины определяются у 70 % больных РА с внесуставными проявлениями (васкулит, полинейропатия, подкожные узелки) и являются характерной чертой иммунокомплексных состояний у больных РА.
При РА обнаруживаются свободно циркулирующие в сыворотке крови и синовиальной жидкости ИК (ЦИК), фагоцитированные нейтрофилами синовиальной жидкости (феномен рагоцитоза), фиксированные в суставных тканях (синовиальной оболочке и суставном хряще), в подкожных ревматических узлах, стенках кровеносных сосудов, коже [41,213].
У больных РА также обнаруживаются антинуклеарные факторы (АНФ), представляющие собой гетерогенную группу антител, направленных против различных компонентов ядра: ДНК, РНК, дезоксинуклеотидпротеида, рибонуклеидпротеида, гистонов [88]. Для РА характерны АНФ с афинностью к ядрам гранулоцитов и обнаруживаются у больных как в сыворотке крови, так и в синовиальной жидкости. Предполагают, что АНФ при РА формируются как результат повреждения вследствие повышенной лизосомальной активности при фагоцитировании иммунных комплексов в полости сустава. Не исключают также наличие перекрещивающегося синдрома РА и системной красной волчанки, для которой АНФ наиболее характерны [41].
Свидетелями аутоиммунных процессов при РА являются антитела, имеющие направленность к отдельным элементам соединительной ткани, которая при этой болезни наиболее поражается, в частности к коллагену [157].
Выражением усиленного гуморального ответа при РА является повышение уровня сывороточных иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA), включающих в себя широкий спектр антител разной специфичности. Отмечена прямая зависимость их уровня от активности и тяжести патологического процесса [80].
Этиология и патогенез ревматоидного артрита
Гиперпродукция антител, главным образом РФ, циркуляция ИК, их депонирование в пораженных тканях, продукция цитокинов связаны с дисбалансом между популяциями Т- и В-лимфоцитов, ослаблением их регуляторных функций.
Роль В-клеток при РА обозначена их способностью синтезировать специфические глобулины, отличающиеся аминокислотной последовательностью от иммуноглобулинов эмбриональной линии [233]. Эти специфические иммуноглобулины образуют иммунные комплексы, как обсуждается выше, которые могут способствовать активности заболевания посредством активации комплемента и стимуляции синтеза цитокинов. Также у больных РА было обнаружено увеличенное количество CD5+В-лимфоцитов [181]. CD5+В-лимфоциты являются преобладающей клеточной популяцией при лимфопролиферативных заболеваниях и относятся к основным продуцентам некоторых важных типов органоспецифических ауто-антител, особенно характерных для системных ревматических заболеваний, в том числе ау-тоантител, реагирующих с ДНК, фосфолипидами и эритроцитами, ревматоидных факторов и антиидиотипических антител [61].
Генетическая взаимосвязь РА с молекулами HLA-DR, физиологической функцией которых является представление пептидов CD4+ Т-клеткам, ясно предполагает определенную роль Т-клеток в патогенезе заболевания [202]. Однако единое трактование их значения при РА отсутствует. Одни исследователи рассматривают роль Т-клеток как пассивную или не связанную с РА, поскольку Т-лимфоциты, прошедшие инфильтрацию в тканях пораженных РА суставов являются заметно гипоактивными (характеризуются низким уровнем вырабатываемых ими цитокинов интерферона-у и IL-2, угнетенным ответом на антигенные стимуляции, слабыми хелперными функциями) и для них как популяционный признак отсутствует какой-либо специфический антиген, другие исследователи делают заключение, что именно их гипоактивность ответственна за устойчивое сохранение РА [123, 201]. Несмотря на это, основная идея о патологическом Т-клеточном ответе при РА получила значительную поддержку из работ нескольких исследовательских групп, которые удаляли Т-клетки с помощью дренажа грудного потока, лимфофореза или общего лимфоидного облучения. Каждая из этих процедур облегчает состояние больных РА, в частности, ТЫ, которая индуцирует значительное сокращение количества CD4+ клеток в крови, оказывает положительный эффект на синовит в течение продолжительного времени [123].
Большинство исследователей, изучавших репертуар рецепторных молекул Т-клеток в синовиальных тканях и синовиальной жидкости, показали, что данный репертуар удивительно разнообразный, но при этом наблюдается экспансия специфических клоноти-пов Т-клеток [127, 217]. При этом распространенность лишь некоторых из увеличенных клонотипов ограничены суставом, тогда как несколько из клоногенных популяций также присутствуют в периферической крови [121, 127]. Такие клональные популяции обнаруживаются среди субпопуляций CD4+, CD8+ и CD4" CD8" Т-клеток и могут достигать достаточно заметного клонального размера в циркуляции. Клональная экспансия внутри CD8+ и CD4 CD 8 клеток часто присутствует и у здоровых лиц, в особенности в пожилом возрасте [185]. Напротив, олигоклональность CD4+ Т-клеток, наблюдаемая при РА, является нечастым событием в нормальной популяции и, вероятно, является характерной чертой данного заболевания.
Фенотипические исследования установили, что CD4+ клонотипы экспрессировали необычный фенотип, у которого отсутствовала экспрессия молекулы CD28 [204]. CD28 рассматривается как самая важная костимуляторная молекула у Т-клеток [162]. Контакт с антигеном недостаточен чтобы индуцировать пролиферацию и производство IL-2 в Т-клетках, если отсутствуют костимуляторные сигналы. Взаимодействие CD28 молекулы на поверхности Т-клеток с лигандом на поверхности антиген-презентирующих клеток включает Т-клеточную активацию и позволяет Т-клеткам вступать в клеточный цикл. В отсутствии костимулирующего сигнала Т-клетка становится анергизованной и подвергается апоптозу [107]. CD4+ CD28" Т-клетки могут функционировать без этой важной молекулы в костиму ляции. Замечен интересный факт, что они могут продуцировать IFN-y и IL-2 в отсутствии какой-либо стимуляции. Тем не менее, они требуют альтернативный костимулирующий сигнал для экспрессии IL-2R а цепи и для протекции от индукции анергии [178].
Доминирование одного клонотипа в циркуляции, как считают, является результатом продолжительной антигенной стимуляции. Несмотря на то, что до сих пор не определен конкретный для РА антиген, данные исследований антигенной природы РА предполагают, что большинство, если не все из вероятных антигенов, являются аутоантигенами. Например, было обнаружено, что один из клонов CD8+ Т-клеток из пациента с РА узнает собственный пептид, производный от DQ2 молекулы [101]. Albani S. с соавт. [92] показали, что пациенты с РА имеют Т-клетки, которые пролиферируют в ответ на пептид, полученный из бактериального белка теплового шока dnaJ.
Эти наблюдения показывают, что in vivo экспансированные клоны Т-клеток узнают собственные антигены, которые не являются тканеспецифическими, но широко распространены в организме [232]. Одними из кандидатов на эту роль рассматриваются стресс белки.
Методики исследования синтеза белков лимфоцитами крови пациентов
В исследовании приняли участие 59 пациентов (в подавляющем большинстве женщины). Исследуемая группа состояла из пациентов с ревматоидным артритом (30 человек); контрольная группа: практически здоровые люди (10), с инсулинзависимым диабетом (4), постоянными головными болями (мигрень) (3), остеохондрозом различных отделов позвоночника (10), атопической бронхиальной астмой (3), язвенной болезнью желудка (6) (табл. 2).
Пациенты с ревматоидным артритом в большинстве были серопозитивными, имели системные проявления РА в виде полинейропатии, лимфоденопатии, кожных ревматических узелков и др. До обращения к нам все пациенты проходили лекарственный курс терапии (кортикостероиды, базисные препараты и др.) в стационарах. Клинический, биохимический и иммунологический анализ крови пациентов проводился общепринятыми методами в соответствующих лабораториях Института ревматологии (г. Москва).
2. Методики исследования синтеза белков лимфоцитами крови пациентов. Приготовление фракции мононуклеаров. Фракцию мононуклеаров получали из периферической крови согласно Воушп А. [цит. по 46]. Образцы крови брали из кубитальной вены в пластиковую пробирку с добавлением гепарина 25 Ед/мл до, в середине и после курса терапии. Кровь разбавляли фосфатным буфером Дюльбекко (ФБД), наслаивали на раствор фиколла с верографином плотностью 1,077 в соотношении кровь:фиколл=2:1 и центрифугировали в бакет-роторе при 400 g 30 мин. Слой лимфоцитов на границе фиколла и плазмы отбирали и дважды отмывали в ФБД с помощью центрифугирования при тех же условиях. Суспензия содержала не более 3 % мертвых лимфоцитов, выявленных с помощью окраски трипановым синим. Отмытые клетки ре-суспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma), содержащей S-метионин с активностью 10 мкКи/мл. Концентрация клеток в среде составляла 3 х 10 в 6 степени / мл. Клетки инкубировали в течении 3 часов в атмосфере 95% воздух и 5% СОг в режиме легкого встряхивания, что позволяло поддерживать клетки в суспензии. После инкубации клетки осаждали и хранили в замороженном виде до электрофореза.
Условия теплового шока:
После ресуспендирования в среде RPMI-1640, содержащей 358-метионин с активностью 10 мкКи/мл, клетки подвергали тепловому шоку при 44С в течение 15 минут на водяной бане и далее инкубировали 3 часа при 37С в условиях, указанных выше. Гибель клеток сотавляла не более 3% согласно результатам прокрашивания трипановым синим. Контролем служило культивирование клеток 15 мин. при 37С.
Электрофорез в полиакриламидном геле ШААП лизатов клеток.
Для количественного анализа полипептидного состава белков лизатов клеток использовали электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДСП, Sigma) согласно Laemmly U.K. et al. (1970) [цит. по 68] и двумерный ПААГ-электрофорез согласно [109] для визуальных оценок.
ДСН-ПААГ-электрофорез. Клетки лизировали в стартовом буфере 62,5 мМ Трис-HCl рН 6,$, содержащем 100 мМ дитиотреитола (ДТТ), 10 % глицерина, 2,3% ДСН, 0,05% бромфенолового синего (БФС), активным перемешиванием и кратковременным прогреванием до 90 С в пропорции 5х105 клеток на 20 мкл буфера. Затем 20 мкл клеточного лизата наносили на 5% формирующий ПАА-гель в пластине, содержащий 0,5 М Трис-HCl рН 6,8 и 0,4% ДСН, и проводили электрофоретическое разделение полипептидов белков лизатов клеток в градиенте рабочего ПАА геля (9-12,5%), содержащего 1,5 М Трис-HCl рН 8,8 и 0,4% ДСН, при силе тока 50 мА и напряжении 120 В. Электродным буфером служил 0,025 М Трис + 0,192 М глицин +0,1% ДСН. Электрофорез прекращали по достижению синей полосы БФС нижнего края рабочего геля.
Далее гель отмывали от ДСН инкубацией 1 час в растворе 5% трихлоруксусной кислоты. Для локализации белков гель помещали в раствор 0,75% кумасси R250:10% эта-нол:7% уксусная кислота на ночь при комнатной температуре и далее обесцвечивали с помощью раствора 10% этанол:7% уксусная кислота при нагревании до 30С до максимального обесцвечивания фона окраски. Затем гель сканировали на автоматическом двулучевом денситометре (ИБФ, Пущино) и высушивали на приборе "Гель-1" (Украина). Двумерный ПААГ-электрофорез.
Клетки лизировали в буфере, содержащем 9,8 М мочевины, 2% Тритон-ХЮО, 2% амфолинов (Sigma) рН 3,5-10 и 5-7 в соотношении 1:3, ЮОмМДТТ, в концентрации 1х106 на 50 мкл буфера мягким перемешиванием при комнатной температуре в течение 30 мин. После предварительного изоэлектрофокусирования (15 мин при 200 В, 30 мин. при 300 В и 1 час при 400 В) на щелочной конец трубки 8 см длиной и 3 мм диаметром с 5% ПАА-гелем, содержащим 11 М мочевины, 2% тритон-ХЮО, 2% амфолинов рН 3,5-10 и 5-7 в соотношении 1:3, наносили 50 мкл лизата клеток, наслаивали поверх образца буфер для лизиса (см. выше) в разведении с водой как 3:1 и проводили изоэлектрофокусирование при 400 В в течении 19 часов. Щелочным электродным буфером служил 20 мМ NaOH, кислым - 10 мМ Н3РО4. По окончании времени изоэлектрофокусирования гели выдавливали воздухом из трубок и инкубировали со стартовым буфером для ДСН-ПААГ-электрофореза (см. выше) в течении 1 часа при комнатной температуре. Затем трубки "приваривали" к формирующему гелю пластины для ДСН-ПААГ-электрофореза горячим (40С) раствором 1% агарозы, содержащей 0,06 М Трис-HCl рН 6,8, 2% ДСН, 100 мМ ДТТ, 10% глицерина, 0,002% БФС, и проводили электрофокусирование в ПААГ в присутствии ДСН и последующие процедуры согласно прописи, указанной выше.
Синтез конститутивных и индуцибельных (БТШ) белков в лимфоцитах крови человека в состоянии здоровья, при РА и других патологиях
Наше исследование синтеза белков in vitro лимфоцитами крови контрольной группы при физиологических условиях (37С) и в ответ на тепловой шок (44С) показало, что выбранные условия времени инкубации клеток и температурный режим теплового шока (ТШ) являются достаточными, чтобы наблюдать индукцию и синтез БТШ на фоне восстанавливающегося после ТШ синтеза конститутивных белков, при этом гибель клеток не превышает 3%, величины, характерной для неспецифической гибели клеток при их выделении из крови. В ответ на ТШ в лимфоцитах условно здоровых лиц наблюдается увеличение синтеза белков с молекулярной массой 120, 95, 70 и 65 кДа, которые с помощью двумерного электрофореза были идентифицированы как БТШ соответствующих молекулярным массам семейств (для 70 кДа - БТШ 72 и 73 кДа). Синтез других белков (конститутивных) при этом снижается на 30 % относительно синтеза при физиологической температуре (рис. 6,7).
В результате проведенного исследования обнаружено, что у больных РА способность лимфоцитов синтезировать БТШ и другие клеточные белки носит выраженный угнетенный характер и зависит от тяжести и продолжительности заболевания (рис. 8). При I степени активности ревматоидного процесса исходно наблюдается сниженный уровень конститутивного белкового синтеза лимфоцитами, который в ответ на ТШ незначительно ингибируется и индуцируются БТШ 95, 70 и 65 кД (рис. 8 А, Б). Для II степени активности РА характерны заметно сниженный синтез белков при физиологической температуре, слабая индукция БТШ 70 и 65 кД и угнетение синтеза конститутивных белков в ответ на ТШ (рис. 8 В). В случае тяжелых форм проявления РА (П-Ш степень активности) синтез белков носит выраженный угнетенный характер как в покоящихся, так и шокированных нагреванием лимфоцитах, при этом индукции синтеза БТШ не наблюдается (рис. 8 Г).
Статистический анализ денситограмм спектра синтезируемых de novo белков в лимфоцитах больных РА показал, что уровень белкового синтеза в лимфоцитах этих больных в исходном состоянии подавлен приблизительно на 60 % относительно группы здоровых лиц (рис. 9, 11), угнетенный характер синтеза распространяется на весь исследованный спектр белков (от 170 до 27 кД) и является статистически достоверным. ТШ еще более угнетает синтез конститутивных белков и достоверно индуцирует БТШ 95, 70 и 65 кДа, индукция синтеза БТШ 120 кД едва заметна (рис. 9). Однако уровень экспрессии их синтеза значительно уступает таковому в группе здоровых лиц (рис. 12).
Использование метода двумерного электрофореза белков с последующим их окрашиванием кумасси R-250 при исследовании полипептидного состава белков лимфоцитов в исходном состоянии и после теплового шока показало, что у больных РА и условно здоро вых лиц качественных различий в представленных в клетках белках отсутствуют. Но последующая авторадиография двумерных гелей подтвердила наличие серьезных нарушений в экспрессии белкового синтеза при РА.
Обнаружено, что полипептидный состав синтезированных de novo лимфоцитарных белков у больных РА действительно зависит от степени активности ревматоидного процесса и продолжительности заболевания, но в целом подтверждается факт чрезвычайно низкого его уровня, который едва регистрируется при экспонировании двумерных гелей с рентгеновской пленкой (рис. 18 А). В большинстве случаев в исходном состоянии можно видеть очень слабый синтез белков 80 кДа (pi 4.8), 60кДа(р1 5.1), актина (43 кДа, р15.3)и38кДа (pi 4.4). Синтез БТШ не наблюдается. В тяжелых случаях РА синтез лимфоцитарных белков при равных условиях проведения исследований практически не обнаруживается.
Способность лимфоцитов синтезировать белки in vitro в ответ на тепловой шок также зависит от тяжести и продолжительности заболевания. В случае средней тяжести РА (II степень активности) синтез конститутивных белков еще более подавляется, и индуцируются БТШ 72 и 73 кДа, редко 65 кДа (рис. 18 Б). В более легких случаях (I степень активности) на фоне индукции перечисленных выше БТШ наблюдается лишь некоторое угнетение синтеза конститутивных белков. Встречаются тяжелые случаи (активность РА III степени), когда в ответ на ТШ синтез клеточных белков в лимфоцитах больных полностью подавляется.
С целью сравнения способности лимфоцитов синтезировать белки при РА с ситуацией при других патологиях, нами проведены аналогичные исследования на больных инсу-линзависимым диабетом, язвенной болезнью желудка, мигренью, общим остеохондрозом позвоночника, атопической бронхиальной астмой.
Инсулинзависимый диабет (insulin dependent diabetes mellitus, IDDM) является аутоиммунным хроническим заболеванием, связанным с дефицитом продукции инсулина в р-клетках, в частности, инсулин, глутаматдекарбоксилаза, антиген гранул и др. Исследования IDDM на животных моделях (ВВ крысы, NOD-мыши) позволили предположить роль БТШ 60/65 кД как вероятного аутоантигена при данной патологии:
