Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Изменение защитных функций организма при стрессе 12
1.1.1. Тимоциты и Т-лимфоциты в реализации защитных функций организма 16
1.1.2. Натуральные киллерные клетки: функциональная активность и чувствительность к действию стресса 20
1.1.3. Мононуклеарные фагоциты как компонент системы защиты организма 25
1.2. Старение: история развития проблемы и взаимосвязь с активностью защитных функций организма 30
1.3. Регуляторные пептиды и их синтетические аналоги 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Общие условия работы 45
2.2. Экспериментальные животные 45
2.3. Модели экспериментального стресса 46
2.4. Исследуемые пептиды 47
2.5. Определение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс 48
2.5.1. Выделение спленоцитов из селезенки крыс 48
2.5.2. Приготовление клеток-мишеней для НК-клеток селезенки 49
2.5.3. Оценка цитотоксической активности НК-клеток селезенки 49
2.6. Определение влияния исследуемых пептидов на пролиферацию тимоцитов мышей, стимулированных мито геном и препаратом ИЛ-ір 50
2.6.1. Приготовление тимоцитов 50
2.6.2. Приготовление среды для культивирования клеток 50
2.6.3. Постановка реакции бласттрансформации тимоцитов мышей 51
2.7. Определение активности лимфоцит-активирующих факторов в инкубатах перитонеальных макрофагов мышей 52
2.7.1. Получение перитонеальных макрофагов мышей и условия инкубации клеток 52
2.7.2. Определение активности ЛАФ в инкубатах перитонеальных макрофагов 53
2.8. Статистическая обработка результатов 55
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 56
3.1. Цитотоксическая активность натуральных киллерных клеток селезенки крыс после электроболевого раздражения задних конечностей и действия вилона, эпиталона и кортагена 56
3.1.1. Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки нестрессированных крыс под действием коротких пептидов 56
3.1.2. Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых двукратному (по 30 мин каждое) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов 57
3.1.3. Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых однократному (в течение 1 часа) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов 59
3.2. Пролиферативная активность тимоцитов мышей, стимулированных Конканавалином А и интерлейкином-ір, при ротационном и комбинированном стрессе, а также действии вилона, эпиталона и кортагена 63
3.2.1. Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов нестрессированных мышей 66
3.2.2. Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов мышей при ротационном стрессорном воздействии 70
3.2.3. Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов мышей при комбинированном (охлаждение с последующей иммобилизацией) стрессорном воздействии 74
3.3. Продукция лимфоцит-активирующих факторов перитонеальными макрофагами мышей при старении, стрессе и действии вилона, кортагена и эпиталона 78
3.3.1. Влияние коротких пептидов на продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей 79
3.3.2. Влияние коротких пептидов на стресс-индуцированную продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей 84
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 90
Выводы 103
Список использованной литературы 105
- Изменение защитных функций организма при стрессе
- Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых двукратному (по 30 мин каждое) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов
- Пролиферативная активность тимоцитов мышей, стимулированных Конканавалином А и интерлейкином-ір, при ротационном и комбинированном стрессе, а также действии вилона, эпиталона и кортагена
- Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов нестрессированных мышей
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование механизмов дисфункций иммунной системы при стрессе и старении, а также возможности коррекции стресс-индуцированных и возрастных нарушений функциональной активности иммунокомпетентных клеток, представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, иммунофизиологии и геронтологии.
В настоящее время изучение защитных реакций организма при стрессе становится все более актуальным. Хотя стресс как таковой не является патологией, стрессорная реакция сопровождает развитие практически любого патологического процесса и вызывает изменения функциональной активности клеток иммунной системы. В экспериментальных моделях и наблюдениях на людях в последние годы подтверждается возможность не только негативного, подавляющего, но и активирующего эффекта стрессорных воздействий на функции иммунной системы [Фролов Б.А. и соавт., 1993; Lauc G. et al., 1998; Корнева Е.Г. и соавт., 2000; Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А., 2002, 2005].
Реакции хронического стресса по своему физиологическому значению приближены к процессам старения: в последние годы экспериментально подтверждается представление о том, что возрастные изменения в организме в большой мере обусловлены снижением уровня активности защитных функций [Борисова A.M., 1999; Полякова В.О. и соавт., 2001; Uemura К. et al., 2002; Анисимов В.Н., 2003; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003а]. Поэтому экспериментальный стресс может быть использован в исследованиях в определенной степени и как модель старения.
При исследовании возрастных, а также стресс-индуцированных нарушений функций иммунной системы, информационно значимым
является проведение анализа изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определяющих уровень защиты организма. Один из таких показателей - изменение продукции мононуклеарными фагоцитами лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ), важнейшими компонентами которых являются цитокины интерлейкин-1 (ИЛ-1), ИЛ-6 и фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) [Rosenwasser L.J., Dinarello С.А., 1981; Симбирцев А.С. и соавт., 1987; Komeva Е.А. et al., 1997; Rybakina E.G. et al., 1997b]. Представляется целесообразным и перспективным исследование изменения продукции ЛАФ макрофагами при старении.
Решающим для функционирования иммунной системы является свойство ИЛ-1 - регулятора защитных функций организма и медиатора взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем, усиливать пролиферацию тимоцитов и лимфоцитов, вызванную лектинами [Dinarello С.А., 1991, 1996; Turnbull A.V., Rivier C.L., 1999; Корнева Е.А. и соавт., 2000]. Оценка комитогенного действия ИЛ-1 - одной из ключевых его функций, также позволяет получить важную информацию о состоянии защитных реакций при дестабилизирующих воздействиях, в том числе и при стрессе.
Информативным тестом, который может способствовать раскрытию
механизмов нарушений защитных реакций организма при различных
дестабилизирующих воздействиях, является анализ изменения
цитотоксической активности натуральных киллерных (НК) клеток -
субпопуляции лимфоцитов, обладающих противовирусными и
противоопухолевыми свойствами и отличающихся особой
чувствительностью к действию стресса [Laudenslager М. et al., 1999; Ben Eliyahu S. et al., 1999, 2000; Gan X. et al., 2002; Ishihara Y. et al., 2002; Shanin S.N. et al., 2005].
В настоящее время актуальной проблемой остается поиск путей коррекции функций иммунной системы, в частности, функциональной
7 активности иммунокомпетентных клеток, нарушенных при стрессе и
старении.
Одним из перспективных направлений решения этого вопроса представляется использование синтетических пептидов, созданных на основе анализа аминокислотного состава эндогенных полипептидных регуляторов: вилона, эпиталона и кортагена, иммуномодулирующая, стресс-и геропротекторная активность которых показана в ряде лабораторных исследований и клинических наблюдений [Morozov V.G., Khavinson V.Kh., 1997; Киселева Е.П. и соавт., 1999; Khavinson V.Kh. et al., 2001; Хавинсон B.X. и соавт., 2002а, б, в; Колосова Л.И. и соавт., 2002; Щеголев Б.Ф. и соавт., 2003; Хавинсон В.Х., Кветная Т.В., 2005]. Цель и задачи исследования
Целью работы явилось комплексное изучение изменений функциональной активности трех популяций иммунокомпетентных клеток при стрессе и старении и исследование возможности их коррекции короткими синтетическими пептидами. В задачи работы входило:
Изучение стресс-индуцированных изменений цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электроболевым раздражениям задних конечностей в двух режимах и действия коротких синтетических пептидов - вилона, эпиталона и кортагена.
Исследование изменений пролиферативной активности тимоцитов мышей, подвергнутых ротационному и комбинированному стрессорным воздействиям, и возможности их коррекции вилоном, эпиталоном и кортагеном, а также анализ модулирующего влияния этих пептидов на проявление комитогенного действия ИЛ-ір.
Сравнительное изучение особенностей продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей в норме и при
8 ротационном стрессорном воздействии, а также модулирующего действия
на нее вилона, эпиталона и кортагена.
Научная новизна исследования
Проведенное исследование позволило выявить ряд характерных особенностей развития защитных реакций организма при стрессе и старении. Для этой цели использован комплекс тестов, характеризующих уровень активности защитных функций организма: изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей.
Приоритетный характер носят полученные данные о том, что старение мышей сопровождается уменьшением чувствительности их перитонеальных макрофагов к активирующему действию ЛПС in vitro, а также снижением реакции клеток на иммуностимулирующий ротационный стресс, что выражается в угнетении продукции ЛАФ макрофагами старых мышей по сравнению с тем же показателем у молодых животных.
Впервые проведено комплексное исследование влияния коротких синтетических пептидов вилона, эпиталона и кортагена на функциональную ' активность трех популяций иммунокомпетентных клеток, измененную как при стимулирующем, так и угнетающем стрессорных воздействиях. Получены новые данные, подтверждающие стресс- и геропротекторное действие исследованных пептидов. Теоретическая и практическая значимость работы
Представленная работа, посвященная исследованию изменений ряда показателей защитных функций организма: цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей, при стрессе и старении, а также действия на них коротких пептидов, носит фундаментальный характер. Основное теоретическое значение работы
9 состоит в демонстрации изменения функциональной активности ряда
популяций иммунокомпетентных клеток как мишеней для действия стресса,
а также пептидных иммуномодуляторов. Результаты исследования
расширяют сложившееся представление о возрастных изменениях функций
иммунной системы.
Установленное иммуномодулирующее, а в ряде случаев
нормализующее действие коротких пептидов на измененную при действии
стресса различной природы, длительности и интенсивности, а также при
старении, функциональную активность иммунокомпетентных клеток
экспериментальных животных, является предпосылкой для дальнейшего
исследования стресс- и геропротекторных свойств этих препаратов.
Полученные новые результаты являются фундаментальной основой для
дальнейшего обоснования применения вилона, эпиталона и кортагена в
клинической практике с целью коррекции стресс-индуцированных и
возрастных нарушений функций иммунной системы.
Основные положения, выносимые на защиту
Электроболевое раздражение задних конечностей крыс приводит к стимуляции или угнетению цитотоксической активности НК-клеток селезенки в зависимости от временного режима воздействия. Вилон, эпиталон и кортаген модулируют цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электрораздражению задних конечностей в двух режимах. Эпиталон оказывает нормализующее действие на цитотоксичность спленоцитов, измененную в результате обоих видов электроболевых воздействий, восстанавливая ее до уровня базальной активности.
В реакции бластгрансформации мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А, вилон и эпиталон вызывают повышение пролиферативной активности клеток, угнетенной при комбинированном стрессорном воздействии, а при аппликации стимулирующего ротационного
10 стресса - не влияют на нее. Кортаген не изменяет интенсивность
пролиферации тимоцитов у животных, подвергнутых обоим видам стресса.
При ротационном и комбинированном стрессорных воздействиях на мышей эпиталон и кортаген потенцируют комитогенное действие ИЛ-ір. Вилон обладает таким свойством только при комбинированном стрессе.
Продукция ЛАФ стимулированными ЛПС перитонеальными макрофагами старых, 19-20-ти месячных мышей на 62,5% слабее, чем клетками молодых, 2-х месячных животных. Ротационный стресс индуцирует образование ЛАФ макрофагами старых мышей менее выражено, чем клетками молодых животных.
Вилон, эпиталон и кортаген индуцируют продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей; вилон обладает таким же действием на макрофаги старых мышей. Вилон и кортаген повышают чувствительность к ЛПС макрофагов старых мышей, восстанавливая активность этих клеток, сниженную при старении.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на 5-м Съезде иммунологов
и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003), на 3-м Российском конгрессе
по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная
патология органов и систем» (Москва, 2004), 2-м Российском Симпозиуме
по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 6-м
Международном конгрессе Международного общества по
нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005). Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 193 источника, в том числе 89 отечественных и 104 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 17 рисунками и 3 таблицами.
Изменение защитных функций организма при стрессе
Исследование проблемы «стресс и защитные функции организма» в настоящее время, характеризующееся повышенными эмоциональными нагрузками и интенсификацией жизни, становится все более актуальным. На протяжении всей жизни человек сталкивается со стрессорными ситуациями, которые, часто оказывая дестабилизирующее воздействие на защитные реакции организма, в конечном итоге приводят к развитию дисфункций иммунной системы и возникновению сопутствующих заболеваний. Хотя сам по себе стресс и не является патологией, стрессорные реакции сопровождают развитие любого патологического процесса и вызывают нарушения функционального взаимодействия иммунной и нейроэндокринной систем организма, определяющего уровень активности защитных функций [Buckingham J.C., 1996; Berczi L, 1998; Корнева Е.А. и соавт., 2000; Расак К., Palkovits М., 2001; Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А., 2002, 2005; Shanin S.N. et al., 2005]. По современным представлениям, защитные функции организма включают механизмы врожденного и приобретенного иммунитета, а также их регуляцию.
Стрессорная реакция является неотъемлемым компонентом адаптации индивидуума к действию раздражителей различной природы и приводит к мобилизации защитных резервов организма. Начиная с основополагающих исследований Г. Селье [Selye Н., 1936, 1950; Селье Г., 1960] и его последователей, к классическим проявлениям общего адаптационного синдрома относят активацию гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАКС) с последующим повышением концентрации глюкокортикоидных гормонов в крови, увеличение содержания катехоламинов в крови, повышение количества гранулоцитов и снижение массы тимуса, а также изъязвление слизистой желудочно-кишечного тракта. В настоящее время установлено, что механизмы обеспечения устойчивости организма к неблагоприятным воздействиям, включающие врожденные и приобретенные защитные реакции, вовлекаются в ответ организма на любое стрессорное воздействие уже на самых ранних этапах развития стрессорной реакции [Takaki A. et al., 1998; Шанин С.Н. и соавт., 1999; Расак К., Palkovits М., 2001; Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А., 2002; Фомичева Е.Е. и соавт., 2006]. Наряду с сопровождающим стрессорное воздействие увеличением концентрации глюкокортикоидных гормонов в крови, на ранней стадии развития стрессорной реакции возрастает уровень адренокортикотропного гормона (АКТГ) в крови, изменяется концентрация тиреотропного гормона, содержание трийодтиронина (Т3) и тироксина (ТД претерпевает изменения секреция альдостерона, пролактина, половых гормонов, соматотропного гормона [Расак К., Palkovits М., 2001; Фомичева Е.Е. и соавт., 2006]. Стрессорные воздействия обуславливают различные изменения в характере функционирования практически всех органов и систем организма, среди которых иммунная система выступает как одна из центральных «мишеней» действия стресса. Так, в недавно проведенных исследованиях установлено, что неотъемлемым компонентом развития стрессорной реакции в организме является повышение уровня цитокина интерлейкина-1 (ИЛ-1) в крови, обусловленное его выделением иммунокомпетентными клетками-продуцентами [Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А., 2002].
Реакция ГТАКС на действие стрессорного агента является неспецифической - не зависит ни от вида, ни от природы раздражителя и сопровождается стереотипным ответом - повышением секреции АКТГ в гипофизе и уровня глюкокортикоидных гормонов в крови [Корнева Е.А., Шхинек Э.К., 1988]. Однако характер стресс-индуцированного повышения уровня глюкокортикоидных гормонов в крови и изменения активности других гормональных систем, а также иммунологических процессов в организме, зависит от природы стрессора, интенсивности и длительности его воздействия. Установлено, что стрессорные воздействия различной природы вызывают существенное, но кратковременное повышение уровня глюкокортикоидных гормонов в крови, но приводят к различным изменениям иммунного ответа: стимулируют его (при, так называемых, адаптивных формах стресса), угнетают (при длительном стрессе, когда адаптивный его характер сменяется патогенетическим), либо не оказывают на него выраженного влияния [Корнева Е.А., Шхинек Э.К., 1988; Корнева Е.Г., 1993; Rybakina E.G. et al., 1997b; Lauc G. et al., 1998; Takaki A. et al., 1998; Шанин C.H. и соавт., 1999; Корнева Е.Г. и соавт., 2000]. Таким образом, в последние годы как на экспериментальных моделях, так и в наблюдениях на людях, подтверждается возможность не только негативного, подавляющего, но и активирующего эффекта стрессорных воздействий на защитные функции. Так, например, было установлено, что воздействие разных по силе тяжести травм, оказывает противоположные эффекты на защитные реакции организма [Александров В.Н., 1983], а действие ротационного стресса разной длительности сказывается на динамике секреции провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-а) и АКТГ, а также на активности натуральных киллерных (НК) клеток [Hale K.D. et al., 2001]. При хроническом, тяжелом стрессе подавление функции иммунной системы может существенно сказываться на уровне защищенности организма, то есть может страдать «качество здоровья». Этот термин применяется в современных работах специалистов по организации здравоохранения и профилактической медицине и главный смысл его сводится к снижению возможности организма противостоять воздействию среды, что является основой возникновения различных форм нарушений защитных функций организма и, как следствие, развития заболеваний различной природы.
Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых двукратному (по 30 мин каждое) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов
Через 20 час после окончания повторного 30-минутного электроболевого раздражения задних конечностей крыс, цитотоксическая активность НК-клеток селезенки существенно возрастала до 57±7% по Концентрация пептидов (х 10 нг/мл) ШИнтакт Контроль НВилон НЭпиталон ИКортаген Рис. 1. Модулирующее действие вилона, эпиталона и кортагена на цитотоксическую активность НК-клеток селезенки нестрессированных крыс. Примечание: - р 0,05 по сравнению с цитотоксической активностью НК-клеток интактных и контрольных животных. 59 сравнению с уровнем цитотоксичности спленоцитов интактных и контрольных животных (рис. 2). Установлено, что при добавлении в инкубационную среду вилона происходило снижение цитотоксической активности НК-клеток, достоверное при концентрациях пептида от 0.125 х 10 до 1.0 х 10 нг/мл. Эпиталон во всех использованных концентрациях также подавлял цитотоксичность спленоцитов стрессированных животных. При концентрациях эпиталона 0.5 х 10 , 0.25 х 10 и 0.0625 х 10 нг/мл цитотоксическая активность НК-клеток практически возвращалась к исходному уровню, достигая значений, достоверно не отличающихся от значения базальной активности спленоцитов интактных и контрольных крыс (рис. 2). Кортаген в условиях эксперимента только в концентрациях 0.125 х 103 и 0.5 х 103 нг/мл вызывал снижение цитотоксичности НК-клеток до 38 -39±7%. 3.1.3. Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых однократному (в течение 1 часа) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов В отличие от двукратной (по 30 мин каждая) аппликации электроболевого стресса, однократное длительное (в течение 1 часа) » электрораздражение задних конечностей крыс через 2 часа после прекращения процедуры стрессирования приводило к существенному снижению цитотоксической активности НК-клеток селезенки (с 39±5% у интактных и 37±7% у контрольных животных до 5±1% - у стрессированных) (рис. 3). 1,0 0,5 0,25 0,125 0,0625 Концентрация пептидов (х 103 нг/мл) D Интакт D Контроль И Стресс ДВилон ВЭпиталон ИКортаген Рис. 2. Модулирующее действие вилона, эпиталона и кортагена на цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых двукратному (по 30 мин каждое) электроболевому раздражению. Примечание: - р 0,05 по сравнению с цитотоксической активностью НК-клеток стрессированных животных; # - р 0,05 по сравнению с цитотоксической активностью НК-клеток интактных и контрольных животных. 1,0 0,5 0,25 0,125 0,0625 Концентрация пептидов (х 10 нг/мл) Интакт Контроль Ш Стресс ИВилон ЭЭпиталон ИКортаген Рис. 3. Модулирующее действие вил она, эпиталона и кортагена на цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых однократному (в течение одного часа) электроболевому раздражению. Примечание: - р 0,05, - р 0,01 по сравнению с цитотоксической активностью НК-клеток стрессированных животных; # - р 0,05 по сравнению с цитотоксической активностью НК-клеток интактных и контрольных животных. Вилон во всех использованных концентрациях, кроме концентрации 0.125 х 103 нг/мл, вызывал повышение цитотоксической активности НК-клеток, сниженной в результате электроболевого воздействия. Эпиталон во всем диапазоне использованных концентраций также усиливал цитотоксичность НК-клеток по сравнению с активностью клеток стрессированных животных, восстанавливая ее (во всех концентрациях, кроме 0.5 х 10 нг/мл) до значений базальной активности клеток у интактных и контрольных животных, то есть более высоких, чем в случае применения вилона (рис. 3).
Однако наиболее выраженной способностью к восстановлению нарушенной в результате электроболевого воздействия цитотоксической активности НК-клеток селезенки обладал кортаген, повышавший ее до значений базального уровня у интактных и контрольных животных, а при 1 1 1 трех использованных концентрациях (1.0 х 10 , 0.25 х 10 и 0.125 х 10 нг/мл) - достоверно выше этих уровней. Таким образом, пептиды вилон и эпиталон при внесении их в суспензию спленоцитов нестрессированных крыс в концентрациях 1 х 103, 111 1 0.5 х 10 , 0.25 х 10 , 0.125 х 10 и 0.0625 х 10 нг/мл вызывают повышение цитотоксической активности НК-клеток селезенки. Кортаген не вызывает усиления цитотоксической активности НК-клеток интактных и контрольных животных, а при концентрации 0.0625 х 10 нг/мл даже подавляет ее. Концентрации пептидов определены, исходя из данных экспериментов, в которых были исследованы их иммуномодулирующие эффекты в условиях in vitro [Морозов В.Г. и соавт., 2000; Khavinson V.Kh. et al., 2002]. При использовании экспериментальных моделей стресса установлено, что стресс-обусловленные изменения функциональной активности спленоцитов зависят от временного режима электроболевого воздействия: кратковременное двукратное (по 30 мин каждое) электроболевое раздражение при условии забора материала через 20 час приводит к стимуляции цитотоксической активности НК-клеток селезенки, а длительное однократное воздействие с удалением селезенки через 2 часа после его окончания, вызывает подавление цитотоксичности спленоцитов. Пептиды вилон, эпиталон и кортаген обладают модулирующим действием на цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, нарушенную в результате электроболевых воздействий в различном режиме. Вилон и эпиталон снижают цитотоксичность НК-клеток, повышенную после двукратного электроболевого воздействия, и усиливают ее в случае подавления, вызванного жестким однократным электрораздражением. Однако отличительной особенностью действия эпиталона является то, что он в трех использованных концентрациях восстанавливает до базального уровня цитотоксическую активность НК-клеток селезенки, повышенную после двукратного электроболевого воздействия, и в четырех концентрациях - сниженную после жесткого однократного электрораздражения, оказывая нормализующее действие на нарушенную функциональную активность спленоцитов.
Пролиферативная активность тимоцитов мышей, стимулированных Конканавалином А и интерлейкином-ір, при ротационном и комбинированном стрессе, а также действии вилона, эпиталона и кортагена
Результаты исследования влияния коротких синтетических пептидов на цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электроболевому раздражению задних конечностей в двух режимах, оказывающих стимулирующее и супрессирующее воздействие на цитотоксичность этих клеток, которые представлены в подразделе 3.1., а также данные литературы, описанные в главе «Обзор литературы», позволяют предположить, что мишенью действия этих пептидов могут быть и другие виды иммунокомпетентных клеток, прежде всего, обладающие особой чувствительностью к действию стресса. К таким клеткам относятся также и тимоциты. Во втором подразделе работы исследованы изменения пролиферативной активности тимоцитов мышей, подвергнутых ротационному и комбинированному стрессорным воздействиям, и возможности их коррекции короткими пептидами вилоном, эпиталоном и кортагеном, а также проанализировано модулирующее влияние этих пептидов на проявление комитогенного действия цитокина ИЛ-10 - одного из ключевых свойств этого важнейшего регулятора защитных функций организма.
В работе использованы две модели экспериментального стресса на мышах-гибридах (CBAxC57BL6)Fi, применение которых позволило провести сравнительное исследование эффектов кратковременного, мягкого, нетравмирующего ротационного воздействия и изменений пролиферативной активности тимоцитов при сильном и длительном комбинированном воздействии (сочетании охлаждения и иммобилизации животных).
Многолетние исследования влияния ротационного стрессорного воздействия на величину гуморального иммунного ответа к эритроцитам барана показывают, что оно не вызывает торможения гуморального иммунного ответа, уровень которого определялся по общим титрам антител в сыворотке крови и по количеству антителообразующих клеток в селезенке - проявляется даже тенденция к его усилению. Комбинированное воздействие, напротив, вызывает достоверное падение числа антителообразующих клеток в селезенке и общих титров антител в крови мышей, то есть приводит к развитию выраженной супрессии гуморального иммунного ответа [Шанин С.Н. и соавт., 1999; Корнева Е.А. и соавт., 2000]. Эти данные отличаются высокой воспроизводимостью и относятся также и к результатам настоящего исследования. Установлено, что после аппликации ротационного стресса не отмечается появления деструкции секреторного отдела слизистой желудка, практически не изменяется масса тимуса и селезенки (табл.1). Таблица 1. Масса тимуса и селезенки мышей после ротационного воздействия Группы животных МАССА мг/100 г Тимуса Селезенки 1. Интактные (п=15) 68,2 ±3,4 341 ±32 2. Стрессированные (п=14) 70,0 ± 6,7 406 ±51 Примечание: в скобках указано количество животных в группе (п). Аппликация комбинированного стресса индуцировала значительные изменения со стороны тимико-лимфатической системы: в 1,9 раза снижалась масса тимуса и в 1,36 раза - масса селезенки (табл. 2). В слизистой желудка образовывалось большое количество эрозий (11,3 ± 2,6 на мышь). Таблица 2. Масса тимуса и селезенки мышей после комбинированного воздействия Группы животных МАССАмг/ЮОг Тимуса Селезенки 1. Интактные (п=12) 70,2 ± 3,4 331 ±36 2. Стрессированные (п=14) 36,8 ±5,8 212 ±41 Примечание: в скобках указано количество животных в группе (п); - р 0,05 по сравнению с теми же показателями у интактных мышей. Реакцию бластгрансформации тимоцитов (РБТТ) определяли по скорости включения меченого тимидина в ДНК делящихся клеток в результате комитогенного действия препарата рИЛ-ір в дозе 250 нг/мл на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А в субоптимальной дозе 0,75 мкг/мл. Задачей первого этапа работы было исследование возможного прямого митогенного действия пептидов вилона, эпиталона и кортагена на РБТТ. Установлено, что ни один из исследуемых пептидов в концентрациях 2.5 х 10"1; 2.5 х 10"3; 2.5 х 10"5; 2.5 х 10"7 и 2.5 х 10 9 нг/мл не проявляет прямого митогенного эффекта: в отсутствие лектина и рИЛ-ір они не индуцируют РБТТ (табл. 3). Таблица 3. Пролиферативная активность тимоцитов (в ср.т.) при действии вилона, эпиталона и кортагсна Пептиды Без пептидов Концентрация пептидов, 2.5 х 10"х нг/мл 10" 10 3 10"5 ю-7 ю-9 Вилон 1555 1500 2111 2276 2322 2352 Эпиталон 2906 3345 2031 2016 2374 2262 Кортаген 2066 1459 1541 1765 1606 2379 Внесение вилона в инкубационную среду, содержащую взвесь тимоцитов и Кон А в субоптимальной дозе, приводило к достоверному усилению включения меченого тимидина в ДНК делящихся клеток при концентрациях пептида 2.5 х 10" и 2.5 х 10" нг/мл (в остальных дозах вилон не оказывал влияния на пролиферацию тимоцитов, стимулированных Кон А) (рис. 4). Полученные данные демонстрируют комитогенное действие вилона в двух дозах на пролиферацию тимоцитов.
Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов нестрессированных мышей
При изучении влияния ротационного стресса на пролифератнвную активность тимоцитов мышей, вызванную действием лектина Кон А в субоптимальной дозе и усиленную комитогенным действием рИЛ-lp (но в отсутствие исследуемых пептидов), установлено, что такой вид стресса вызывает интенсификацию реакции бласттрансформации тимоцитов на 66% (при инкубации клеток с Кон А) и на 74% (при инкубации клеток с Кон А и рИЛ-ір) по сравнению с уровнем РБТТ у контрольных животных (помещенных в индивидуальные контейнеры, но не подвергнутых ротации), тимоциты которых были стимулированы теми же препаратами (рис. 6, 7, 8). В этих рисунках за 100% принят уровень РБТТ у контрольных животных, тимоциты которых были стимулированы Кон А в субоптимальной дозе или Кон А + рИЛ-ір (рис. 6, 7, 8).
Добавление к инкубируемым тимоцитам вилона на фоне повышенной под действием ротационного стресса способности клеток включать меченый тимидин в присутствии Кон А или Кон А + рИЛ-ір, не приводило к достоверному изменению интенсивности РБТТ у стрессированных животных (рис. 6). Напротив, эпиталон в концентрации 2.5 х 10 5 вызывал достоверное усиление РБТТ у стрессированных мышей при инкубации тимоцитов с Кон А, а при сочетанном действии на клетки Кон А и рИЛ-ір этот пептид усиливал РБТТ (в среднем на 90-120%) в широком диапазоне концентраций от 2.5 х 10"3 до 2.5 х 10 9 (рис. 7). При внесении в суспензию
Влияние кортагена на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Конканавалином А в субоптимальной дозе и Конканавалином А + интерлейкин-ір после ротационного стрессорного воздействия. Примечание: # - р 0,05 по сравнению с уровнем РБТТ у интактных и контрольных животных; - р 0,05 по сравнению с тем же показателем у стрессированных животных. клеток кортагена не наблюдалось изменения интенсивности РБТТ у стрессированных животных при инкубации тимоцитов с Кон А. При инкубации тимоцитов с Кон А + рИЛ-lp, кортаген усиливал РБТТ в концентрациях 2.5 х 10 5 и 2.5 х 10"9 нг/мл (рис. 8). 3.2.3. Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов мышей при комбинированном (охлаждение с последующей иммобилизацией) стрессорном воздействии В отличие от ротационного стрессорного воздействия, комбинированное воздействие, вызванное охлаждением и иммобилизацией мышей, вызывало снижение уровня РБТТ на 46% при инкубации клеток с Кон А, и на 68% - при инкубации тимоцитов с Кон А + рИЛ-lp (рис. 9, 10, 11). Внесение с инкубационную среду вилона в концентрациях 2.5 х 10"1, 2.5 х 10", 2.5 х 10 и 2.5 х 10" нг/мл приводило к повышению интенсивности РБТТ у стрессированных животных при инкубации клеток с Кон А, а в концентрациях от 2.5 х 10" до 2.5 х 10" нг/мл - при инкубации клеток с Кон А совместно с рИЛ-ір (рис. 9). Эпиталон был эффективен в качестве стимулятора РБТТ стрессированных животных в концентрациях 2.5 х 10"1 и 2.5 х 10 9 нг/мл при инкубации тимоцитов с Кон А, и во всех исследованных концентрациях (от 2.5 х 10"1 до 2.5 х 10"9 нг/мл) - при инкубации с Кон А + рИЛ-ір (рис. 10). Добавление к клеткам кортагена, так же, как и в случае ротационного стресса, не вызывало изменения интенсивности РБТТ у стрессированных животных при инкубации тимоцитов с Кон А. При инкубации клеток с Кон А + рИЛ-1р, кортаген во всех концентрациях (от 2.5 х 10 1 до 2.5 х 10"9 нг/мл) усиливал РБТТ стрессированных животных (рис. 11). Таким образом, вилон в использованном диапазоне концентраций не изменяет интенсивность РБТТ у животных, подвергнутых действию Включение Н-тимидина, % к контролю Концентрация вилона в пробах, 2.5х10("х)нг/мл ІКонА НКонА + ИЛ-ір Рис. 9. Влияние вилона на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Конканавалином А в субоптимальной дозе и Конканавалином А + интерлейкин-1р после комбинированного стрессорного воздействия. Примечание: # - р 0,05 по сравнению с уровнем РБТТ у интактных и контрольных животных; - р 0,05 по сравнению с тем же показателем у стрессированных животных. Включение Н-тимидина, % к контролю Концентрация эпиталона в пробах, 2.5х10("х)нг/мл ІКонА НКонА + ИЛ-1р Рис. 10. Влияние эпиталона на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Конканавалином А в субоптимальной дозе и Конканавалином А + интерлейкин-ір после комбинированного стрессорного воздействия. Примечание: # - р 0,05 по сравнению с уровнем РБТТ у интактных и контрольных животных; - р 0,05 по сравнению с тем же показателем у стрессированных животных. Включение Н-тимидина, % к контролю Концентрация кортагена в пробах, 2.5х10("х)нг/мл ІКонА 0КонА + ИЛ-ір Рис. 11. Влияние кортагена на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных Конканавалином А в субоптимальной дозе и Конканавалином А + интерлейкин-ір после комбинированного стрессорного воздействия. Примечание: # - р 0,05 по сравнению с уровнем РБТТ у интактных и контрольных животных; - р 0,05 по сравнению с тем же показателем у стрессированных животных. иммуностимулирующего ротационного стресса, однако повышает интенсивность РБТТ, сниженную в результате иммуносупрессирующего комбинированного стрессорного воздействия, при инкубации клеток с Кон А, а также с Кон А + рИЛ-1р. В отличие от вилона, эпиталон в условиях как ротационного, так и комбинированного стресса, вызывает усиление РБТТ (в концентрациях 2.5 х 10 5 нг/мл и 2.5 х 10"1, 2.5 х 10"9 нг/мл, соответственно) при стимуляции клеток Кон А, а также усиливает комитогенное действие рИЛ-ір в диапазоне концентраций от 2.5 х 10"3 до 2.5 х 10"9 нг/мл при ротационном стрессорном воздействии и при всех концентрациях - в случае комбинированного стресса.
