Содержание к диссертации
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Изменение защитных функций организма при стрессе 12
Тимоциты и Т-лимфоциты в реализации защитных функций организма 16
Натуральные киллерные клетки: функциональная активность и чувствительность к действию стресса 20
Мононуклеарные фагоциты как компонент системы защиты организма 25
1.2. Старение: история развития проблемы и взаимосвязь с
активностью защитных функций организма 30
1.3. Регуляторные пептиды и их синтетические аналоги 37
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
Общие условия работы 45
Экспериментальные животные 45
Модели экспериментального стресса 46
Исследуемые пептиды 47
2.5. Определение цитотоксической активности НК-клеток селезенки
крыс 48
Выделение спленоцитов из селезенки крыс 48
Приготовление клеток-мишеней для НК-клеток селезенки 49
Оценка цитотоксической активности НК-клеток селезенки 49
2.6. Определение влияния исследуемых пептидов на пролиферацию
тимоцитов мышей, стимулированных мито геном и препаратом ИЛ-ір
50
Приготовление тимоцитов 50
Приготовление среды для культивирования клеток 50
Постановка реакции бласттрансформации тимоцитов мышей 51
2.7. Определение активности лимфоцит-активирующих факторов в
инкубатах перитонеальных макрофагов мышей 52
Получение перитонеальных макрофагов мышей и условия инкубации клеток 52
Определение активности ЛАФ в инкубатах перитонеальных макрофагов 53
2.8. Статистическая обработка результатов 55
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 56
3.1. Цитотоксическая активность натуральных киллерных клеток
селезенки крыс после электроболевого раздражения задних
конечностей и действия вилона, эпиталона и кортагена 56
Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки нестрессированных крыс под действием коротких пептидов 56
Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых двукратному (по 30 мин каждое) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов 57
Изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых однократному (в течение 1 часа) электрораздражению задних конечностей, под действием коротких пептидов 59
3.2. Пролиферативная активность тимоцитов мышей,
стимулированных Конканавалином А и интерлейкином-ір, при
ротационном и комбинированном стрессе, а также действии вилона,
эпиталона и кортагена 63
Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов нестрессированных мышей 66
Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов мышей при ротационном стрессорном воздействии 70
Действие коротких пептидов на пролиферативную активность тимоцитов мышей при комбинированном (охлаждение с последующей иммобилизацией) стрессорном воздействии 74
3.3. Продукция лимфоцит-активирующих факторов
перитонеальными макрофагами мышей при старении, стрессе и
действии вилона, кортагена и эпиталона 78
Влияние коротких пептидов на продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей 79
Влияние коротких пептидов на стресс-индуцированную продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей 84
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 90
ВЫВОДЫ 103
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 105
СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АКТГ
ГГАКС
ГМ-КСФ
Кон А
НК-клетки
Н-СМаза
РБТТ
рИЛ-1р
СМ-путь
МНС
Адренокортикотропный гормон
Гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система
Гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор
Интерлейкин
Интерферон
Конканавалин А
Лимфоцит-активирующий фактор
Липополисахарид
Натуральные киллерные клетки
Нейтральная сфингомиелиназа
Реакция блаеттрансформации тимоцитов
Рекомбинантный интерлейкин-1 бета
Сфингомиелиновый путь
Симпатическая нервная система
Супероксиддисмутаза
Т-клеточный рецептор
Трансформирующий ростовой фактор
Фактор некроза опухолей
Cell differentiation antigens или cluster definition — антигены кластеров дифференцировки клеток
Immunoglobulin - иммуноглобулин
Major histocompatibility complex - главный комплекс (генов или белков) гистосовместимости
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование механизмов дисфункций иммунной системы при стрессе и старении, а также возможности коррекции стресс-индуцированных и возрастных нарушений функциональной активности иммунокомпетентных клеток, представляет собой одно из основных направлений развития современной иммунологии, иммунофизиологии и геронтологии.
В настоящее время изучение защитных реакций организма при стрессе становится все более актуальным. Хотя стресс как таковой не является патологией, стрессорная реакция сопровождает развитие практически любого патологического процесса и вызывает изменения функциональной активности клеток иммунной системы. В экспериментальных моделях и наблюдениях на людях в последние годы подтверждается возможность не только негативного, подавляющего, но и активирующего эффекта стрессорных воздействий на функции иммунной системы [Фролов Б.А. и соавт., 1993; Lauc G. et al., 1998; Корнева Е.Г. и соавт., 2000; Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А., 2002, 2005].
Реакции хронического стресса по своему физиологическому значению приближены к процессам старения: в последние годы экспериментально подтверждается представление о том, что возрастные изменения в организме в большой мере обусловлены снижением уровня активности защитных функций [Борисова A.M., 1999; Полякова В.О. и соавт., 2001; Uemura К. et al., 2002; Анисимов В.Н., 2003; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003а]. Поэтому экспериментальный стресс может быть использован в исследованиях в определенной степени и как модель старения.
При исследовании возрастных, а также стресс-индуцированных нарушений функций иммунной системы, информационно значимым
является проведение анализа изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, определяющих уровень защиты организма. Один из таких показателей - изменение продукции мононуклеарными фагоцитами лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ), важнейшими компонентами которых являются цитокины интерлейкин-1 (ИЛ-1), ИЛ-6 и фактор некроза опухолей-а (ФНО-а) [Rosenwasser L.J., Dinarello С.А., 1981; Симбирцев А.С. и соавт., 1987; Komeva Е.А. et al., 1997; Rybakina E.G. et al., 1997b]. Представляется целесообразным и перспективным исследование изменения продукции ЛАФ макрофагами при старении.
Решающим для функционирования иммунной системы является свойство ИЛ-1 - регулятора защитных функций организма и медиатора взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем, усиливать пролиферацию тимоцитов и лимфоцитов, вызванную лектинами [Dinarello С.А., 1991, 1996; Turnbull A.V., Rivier C.L., 1999; Корнева Е.А. и соавт., 2000]. Оценка комитогенного действия ИЛ-1 - одной из ключевых его функций, также позволяет получить важную информацию о состоянии защитных реакций при дестабилизирующих воздействиях, в том числе и при стрессе.
Информативным тестом, который может способствовать раскрытию
механизмов нарушений защитных реакций организма при различных
дестабилизирующих воздействиях, является анализ изменения
цитотоксической активности натуральных киллерных (НК) клеток -
субпопуляции лимфоцитов, обладающих противовирусными и
противоопухолевыми свойствами и отличающихся особой
чувствительностью к действию стресса [Laudenslager М. et al., 1999; Ben Eliyahu S. et al., 1999, 2000; Gan X. et al., 2002; Ishihara Y. et al., 2002; Shanin S.N. et al., 2005].
В настоящее время актуальной проблемой остается поиск путей коррекции функций иммунной системы, в частности, функциональной
7 активности иммунокомпетентных клеток, нарушенных при стрессе и
старении.
Одним из перспективных направлений решения этого вопроса представляется использование синтетических пептидов, созданных на основе анализа аминокислотного состава эндогенных полипептидных регуляторов: вилона, эпиталона и кортагена, иммуномодулирующая, стресс-и геропротекторная активность которых показана в ряде лабораторных исследований и клинических наблюдений [Morozov V.G., Khavinson V.Kh., 1997; Киселева Е.П. и соавт., 1999; Khavinson V.Kh. et al., 2001; Хавинсон B.X. и соавт., 2002а, б, в; Колосова Л.И. и соавт., 2002; Щеголев Б.Ф. и соавт., 2003; Хавинсон В.Х., Кветная Т.В., 2005]. Цель и задачи исследования
Целью работы явилось комплексное изучение изменений функциональной активности трех популяций иммунокомпетентных клеток при стрессе и старении и исследование возможности их коррекции короткими синтетическими пептидами. В задачи работы входило:
Изучение стресс-индуцированных изменений цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электроболевым раздражениям задних конечностей в двух режимах и действия коротких синтетических пептидов - вилона, эпиталона и кортагена.
Исследование изменений пролиферативной активности тимоцитов мышей, подвергнутых ротационному и комбинированному стрессорным воздействиям, и возможности их коррекции вилоном, эпиталоном и кортагеном, а также анализ модулирующего влияния этих пептидов на проявление комитогенного действия ИЛ-ір.
Сравнительное изучение особенностей продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами молодых и старых мышей в норме и при
8 ротационном стрессорном воздействии, а также модулирующего действия
на нее вилона, эпиталона и кортагена.
Научная новизна исследования
Проведенное исследование позволило выявить ряд характерных особенностей развития защитных реакций организма при стрессе и старении. Для этой цели использован комплекс тестов, характеризующих уровень активности защитных функций организма: изменение цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей.
Приоритетный характер носят полученные данные о том, что старение мышей сопровождается уменьшением чувствительности их перитонеальных макрофагов к активирующему действию ЛПС in vitro, а также снижением реакции клеток на иммуностимулирующий ротационный стресс, что выражается в угнетении продукции ЛАФ макрофагами старых мышей по сравнению с тем же показателем у молодых животных.
Впервые проведено комплексное исследование влияния коротких синтетических пептидов вилона, эпиталона и кортагена на функциональную ' активность трех популяций иммунокомпетентных клеток, измененную как при стимулирующем, так и угнетающем стрессорных воздействиях. Получены новые данные, подтверждающие стресс- и геропротекторное действие исследованных пептидов. Теоретическая и практическая значимость работы
Представленная работа, посвященная исследованию изменений ряда показателей защитных функций организма: цитотоксической активности НК-клеток селезенки крыс, продукции ЛАФ перитонеальными макрофагами мышей и пролиферативной активности тимоцитов мышей, при стрессе и старении, а также действия на них коротких пептидов, носит фундаментальный характер. Основное теоретическое значение работы
9 состоит в демонстрации изменения функциональной активности ряда
популяций иммунокомпетентных клеток как мишеней для действия стресса,
а также пептидных иммуномодуляторов. Результаты исследования
расширяют сложившееся представление о возрастных изменениях функций
иммунной системы.
Установленное иммуномодулирующее, а в ряде случаев
нормализующее действие коротких пептидов на измененную при действии
стресса различной природы, длительности и интенсивности, а также при
старении, функциональную активность иммунокомпетентных клеток
экспериментальных животных, является предпосылкой для дальнейшего
исследования стресс- и геропротекторных свойств этих препаратов.
Полученные новые результаты являются фундаментальной основой для
дальнейшего обоснования применения вилона, эпиталона и кортагена в
клинической практике с целью коррекции стресс-индуцированных и
возрастных нарушений функций иммунной системы.
Основные положения, выносимые на защиту
Электроболевое раздражение задних конечностей крыс приводит к стимуляции или угнетению цитотоксической активности НК-клеток селезенки в зависимости от временного режима воздействия. Вилон, эпиталон и кортаген модулируют цитотоксическую активность НК-клеток селезенки крыс, подвергнутых электрораздражению задних конечностей в двух режимах. Эпиталон оказывает нормализующее действие на цитотоксичность спленоцитов, измененную в результате обоих видов электроболевых воздействий, восстанавливая ее до уровня базальной активности.
В реакции бластгрансформации мышиных тимоцитов, стимулированных Кон А, вилон и эпиталон вызывают повышение пролиферативной активности клеток, угнетенной при комбинированном стрессорном воздействии, а при аппликации стимулирующего ротационного
10 стресса - не влияют на нее. Кортаген не изменяет интенсивность
пролиферации тимоцитов у животных, подвергнутых обоим видам стресса.
При ротационном и комбинированном стрессорных воздействиях на мышей эпиталон и кортаген потенцируют комитогенное действие ИЛ-ір. Вилон обладает таким свойством только при комбинированном стрессе.
Продукция ЛАФ стимулированными ЛПС перитонеальными макрофагами старых, 19-20-ти месячных мышей на 62,5% слабее, чем клетками молодых, 2-х месячных животных. Ротационный стресс индуцирует образование ЛАФ макрофагами старых мышей менее выражено, чем клетками молодых животных.
Вилон, эпиталон и кортаген индуцируют продукцию ЛАФ макрофагами молодых мышей; вилон обладает таким же действием на макрофаги старых мышей. Вилон и кортаген повышают чувствительность к ЛПС макрофагов старых мышей, восстанавливая активность этих клеток, сниженную при старении.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на 5-м Съезде иммунологов
и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003), на 3-м Российском конгрессе
по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная
патология органов и систем» (Москва, 2004), 2-м Российском Симпозиуме
по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 6-м
Международном конгрессе Международного общества по
нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005). Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 193 источника, в том числе 89 отечественных и 104 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 17 рисунками и 3 таблицами.
