Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Молекулярно-клеточные механизмы развития, функционирования и старения тимуса 11
1.1. Биология развития и анатомия тимуса 12
1.2. Типы клеток и гормоны тимуса 19
1.3. Дифференцировка клеток тимуса и их иммуноцито-химический фенотип 27
1.4. Нейроэндокринная регуляция функционирования тимуса 29
1.5. Тимус и старение 33
1.6. Вилон и эпиталон: роль и значение в нейроиммуно-эндокринной регуляции .39
Результаты собственных исследований .43
Глава 2. Материал и методы исследования .43
2.1. Исследования in vitro 43
2.2. Исследования in vivo 45
Глава 3. Действие вилона и эпиталона на эпителиаль ные клетки тимуса 50
3.1. Экспрессия маркеров активации 50
3.2. Секреторная функция 53
3.3. Пролиферативная активность при старении культур 58
3.4. Экспрессия белков ядрышковых организаторов 60
Глава 4. Действие вилона и эпиталона на тимопиты 64
4.1. Экспрессия маркеров активации 64
4.2. Апоптоз 67
4.3. Экспрессия белков ядрышковых организаторов 68
Глава 5. Действие вилона и эпиталона на перифери ческие т-лимфоциты 71
5.1. Пролиферация и апоптоз лимфоцитов 71
5.2. Внутриклеточный синтез цитокинов 76
Глава 6. Влияние вилона на морфо-функциональное состояние тимуса при преждевременном (радиационном) старении 78
6.1. Световая микроскопия 78
6.2. Электронная микроскопия 80
6.3. Иммуногистохимические и гистохимические исследования. Компьютерный анализ микроскопических изображений 87
6.3.1. Контрольная группа (1 группа) 87
6.3.2. Преждевременное старение (действие ионизирующей радиации (2 группа)) 88
6.3.3. Сочетанное действие радиации и вилона (3 группа) 88
6.3.4. Действие вилона (4 группа) 89
Обсуждение результатов 92
Глава 7. Особенности действия пептидов на клетки тимуса в процессе их дифференцировки и старения 92
Выводы 104
Указатель литературы 106
- Нейроэндокринная регуляция функционирования тимуса
- Экспрессия маркеров активации
- Электронная микроскопия
- Действие вилона (4 группа)
Введение к работе
Актуальность темы
Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста [103]. Инволюция тимуса сопровождается глубокими изменениями морфологии клеток микроокружения и недостаточной выработкой нейропептидов, цитокинов и гормонов, регулирующих функциональную активность органов иммунной системы и созревание Т-лимфоцитов [80]. Ускоренное старение тимуса, протекающее с подобной картиной, наблюдается также на фоне химиотерапевтического лечения, жесткого радиационного облучения и в условиях длительного стресса [87]. Поиск и исследование пептидов с высокой биологической активностью, способных регулировать и восстанавливать адаптационные реакции организма является приоритетным направлением современной биологии.
Участие нейрогуморальных пептидных факторов, вырабатываемых клетками тимусного микроокружения в процессах гемопоэза и формировании иммунного ответа, послужило предпосылкой к созданию на их основе лекарственных препаратов нового поколения. На основе аминокислотного анализа природных препаратов тимуса и эпифиза в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН были сконструированы синтетические пептиды вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), обладающие выраженными иммуномодулирующими свойствами [46].
Сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения позволит более глубоко понять механизмы функционирования и возрастной инволюции тимуса, а также разработать подходы к пептидергической регуляции иммунных и эндокринных функций железы в процессе старения организма.
>
Цель и задачи исследования
Целью диссертационного исследования является сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
изучить действие пептидов на дифференцировку тимоцитов;
исследовать влияние вилона и эпиталона на пролиферацию и апоптоз Т-лимфоцитов;
определить эффекты действия вилона и эпиталона на экспрессию маркеров активации и на секреторную активность эпителиальных клеток тимуса (ТЭК);
оценить влияние пептидов на синтез внутриклеточных цитокинов;
изучить влияние пептидов на пролиферативный потенциал ТЭК при старении культур;
изучить функциональную морфологию тимуса крыс в радиационной модели ускоренного старения;
оценить геропротекторные свойства изучаемых пептидов - вилона и эпиталона.
Научная новизна работы
В работе впервые получены данные о роли пептидов (вилона и эпиталона) в регуляции функций эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов при старении. Установлены внутриклеточные пептидергические механизмы, участвующие в процессах пролиферации и дифференцировки и старения клеток тимуса. Проведен анализ морфо-функциональных изменений в тимусе при ускоренном старении. Выявлено геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона по отношению к клеткам тимуса.
Практическая значимость работы
Полученные результаты позволяют расширить представления о влиянии пептидов на развитие и функционирование клеток иммунной системы, в первую очередь Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса. Установленное геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона на клетки тимуса открьшают перспективы для детального изучения возможности применения пептидов в гериатрической практике для коррекции функций, нарушенных при старении организма.
Положения выносимые на защиту
Вилон и эпиталон обладают регуляторным действием на клетки тимуса in vitro, изменяя экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR, CD69 на их поверхности.
Вилон и эпиталон проявляют геропротекторные свойства при старении культур клеток тимуса человека, ослабляя апоптоз и усиливая пролиферацию ТЭК.
Вилон стимулирует репаративные процессы в тимусе крыс при ускоренном (радиационном) старении.
Вилон и эпиталон могут рассматриваться как потенциальные иммуно- и геропротекторы.
Связь с научно - исследовательской работой Института
Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли пептидов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Главы 3-6 представляют собственные экспериментальные данные изучения эффектов действия пептидов на ТЭК, тимоциты, периферические Т-лимфоциты и на структурно-функциональную организацию тимуса в модели преждевременного старения in vivo. В главе 7 обсуждаются полученные результаты. Текст диссертации изложен на 119 страницах, содержит 15 таблиц, иллюстрирован 26 рисунками. Список литературы содержит 129 источников, из которых отечественных - 82.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Апробация и реализация диссертации
Материалы диссертации доложены на Четвертой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2001); II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы коррекционной психологии, психотерапии, медицины» (Санкт-Петербург, 2001); Пятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2002); второй
научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М.Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002); Седьмой Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2002).
Результаты диссертации используются в научно-практической работе в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербургском Государственном университете, Санкт-Петербургской академии последипломного образования МЗ РФ. Исследования, проводимые в \у рамках диссертационной работы поддержаны грантом РФФИ 02-04-49873 и j/ грантом для студентов, аспирантов и молодых специалистов Администрации Санкт-Петербурга и Российской академии наук в 2002 г.
Нейроэндокринная регуляция функционирования тимуса
Образной квинтэссенцией оценки роли тимуса в регуляции гомеостаза может служить образное выражение академика РАМН В. В. Серова: "тимус стоит на перекрестке иммунной и эндокринной систем регуляции" [77]. На тесное взаимодействие нервной и иммунной систем исследователи обратили внимание лишь в середине годы XX столетия. Известно, что нервная система воздействует на иммунную систему непосредственно через нервы, иннервирующие красный костный мозг и вилочковую железу, а также опосредованно - через эндокринную систему. Эти закономерности были установлены, по-видимому, так поздно потому, что изменения деятельности иммунной системы проявляются скорее в тонких биохимических сдвигах, чем в классических морфологических перестройках.
Недавно было установлено, что при опухолевом росте уровень различных тимусных гормонов значительно повышен, в связи со способностью некоторых опухолевых клеток к экспрессии тимусных гормоноподобных, химически измененных молекул, антитела к которым можно использовать для ранней диагностики новообразований у млекопитающих [77]. При различных изменениях гомеостаза следствием активации Т-лимфоцитов в ответ на митоген in vitro могут быть как пролиферация, так и апоптоз, причем выбор между этими формами реагирования производится, по всей видимости, на уровне индивидуальной клетки. В поздние сроки ответа на митоген вероятность апоптоза повышается. Было показано, что в культуре мононуклеаров здоровых людей в ответ на стимуляцию ФГА наряду с пролиферативной реакцией регистрируется усиление апоптоза клеток [39]. Между интенсивностью пролиферации и апоптоза при действии митогена существует обратная формы ответа клеток на стимуляцию. Ответ Т-лимфоцитов в виде апоптоза достигает максимума позже, чем пролиферативный ответ. На высоте пролиферативного ответа усиливается эффективность индукции активационного апоптоза при действии дополнительных факторов. Пролиферативный и апоптотический ответы Т-клеток на стимуляцию различаются по характеру зависимости от концентрации митогена; высокие дозы митогена способствуют более раннему проявлению апоптоза активированных клеток [39].
Было установлено, что эпителиальные клетки тимуса способны секретировать регуляторные пептиды такие как АКТГ, эндорфины, энкефалины, тиреотропин, пролактин, гонадотропины и другие [10]. Это обстоятельство позволяет рассматривать тимус не только как иммунный, но и как эндокринный орган. Именно этим гормонам и другим нейропептидам отводится в последнее время большая роль в гомеостатической функции тимуса (табл. 5).
Эпителиальные клетки тимуса помимо нейропептидов секретируют спектр уникальных полипептидов, называемых тимусными гормонами (тимопоэтин, тимулин, тимозины и другие), которые управляют некоторыми ступенями интра- и экстратимусной дифференцировки Т-клеток. Пептидные гормоны можно рассматривать как модуляторы тимусной микросреды и, особенно, ее эпителиального компонента. Эти гормоны влияют на один и тот же индуктор дифференцировки тимоцита - тимулин, что дает основание предположить гормональный контроль событий [78]. Тимозины и тимопоэтины способствуют дифференцировке Т-лимфоцитов и появлению специфических рецепторов в их клеточной мембране. Эти пептиды стимулируют выработку многих лимфокинов и продукцию иммуноглобулинов [80]. В последнее время появилось много работ, посвященных взаимосвязям тимуса и селезенки. Показано, что после спленэктомии повышается абсолютное число Т-лимфоцитов при значительном снижении их пролиферативной активности в реакции бласттрансформации с ФГА и Кон А. Спленэктомия нарушает также соотношение популяций Т-лимфоцитов: увеличивается доля Т-супрессоров и уменьшается - Т-хелперов. Через 3 суток после удаления селезенки у крыс повышаются метаболическая активность и белковый синтез в эпителиальных клетках тимуса. Было установлено, что через несколько месяцев после удаления селезенки уменьшается масса тимуса, а в самом тимусе возникают изменения, сходные с инволютивными процессами. Экспериментальное удаление селезенки у крыс приводит к значительному изменению морфофункционального состояния структур, содержащих биогенные амины в тимусе. Максимальный ответ на спленэктомию выявляется через 15 суток после операции и выражается в уменьшении размеров коркового и мозгового вещества тимуса и увеличении концентрации биогенных аминов, особенно гистамина, и количества молодых форм тучных клеток. Выявленные изменения свидетельствуют о супрессивных процессах и инволюции тимуса после спленэктомии. Данный эффект, вероятно, связан с резким уменьшением содержания цитокинов в вилочковой железе [51].
Выявлены суточные (циркадные) ритмы содержания субпопуляций лимфоцитов в крови человека и экспериментальных животных, проявляющиеся в экспрессии различных рецепторов и маркеров (CD4, CD8, CD3,CD56), а также продукции цитокинов: ИЛ, ИНФ, ФНО. Исследовали действие экзогенного ИЛ I 2 на субпопуляционный состав клеток тимуса и селезенки мышей в разное время суток [58]. Работа проводилась на мышах, которых разделили на три группы, ИЛ-2 вводили однократно внутрибрюшинно: 1-й группе - в 10 часов, 2 й группе - в 20 часов, 3-ей группе (контроль) вводили физиологический раствор в то же время суток. Введение ИЛ-2 вызывало увеличение числа тимоцитов. Этот эффект на 3 и 4 сутки (в 10 и 15 часов) был более выражен во 2-й группе, а на 5 сутки - в 1-й группе (10 и 15 часов). При вечернем введении ИЛ-2 его эффект проявлялся раньше, но, и раньше угасал. И при утреннем, и при вечернем введении ИЛ-2 изменялась суточная динамика количества тимоцитов. При этом во 2-й группе эффект был более продолжительным. Проведенные исследования показали, что введение экзогенного ИЛ-2 мышам вызывает повышение общего количества клеток в тимусе, доли CD3+-, CD4+- и CD8+-тимоцитов, а также снижение содержания клеток с фенотипом CD25+.
Ведение экзогенного ИЛ-2 меняет характер суточных вариаций исследованных показателей, что выражается в смещении времени максимальных и минимальных их значений на другие часы суток, а также в увеличении размаха колебаний. Выраженность эффектов экзогенного цитокина зависит от времени его введения: общее количество тимоцитов, процент субпопуляций CD3+- и С04+-тимоцитов в наибольшей степени изменяются после вечернего введения, а процент CD8+- и С025+-клеток - после утреннего [76].
Результаты этих экспериментов, а также другие данные литературы свидетельствуют о том, что значительную роль в регуляторных функциях тимуса играет продукция его клетками цитокинов [49]. Имеющиеся данные об образовании цитокинов и проявлением их активности в тимусе представлены в таблице 5. Цитокины продуцируются как субпопуляцией тимоцитов, так и стромальными клетками - макрофагами, дендритными и эпителиальными клетками. Предполагают, что взаимодействия между поверхностными молекулами и цитокинами регулируют набор цитокинов и их продукцию разными типами клеток [58,76,91].
Экспрессия маркеров активации
Действие вилона и эпиталона на тимоциты было конкордантным. Оба пептида усиливали экспрессию на тимоцитах двух молекул активации - HLA-DR и CD54 и ослабляли экспрессию раннего активационного антигена CD69. Действие вилона на экспрессию CD54 выражено сильнее, а его действие на CD69 проявляется в более широком диапазоне доз. В то же время, более выраженным эффектом на экспрессию молекул МНС II, HLA-DR, оказывает эпиталон. При действии в ко-культуре тимоцитов и ТЭК в ряде случаев эффект пептидов оказывается несколько иным: так вил он в высокой дозе не ослабляет, а усиливает экспрессию CD69 на тимоцитах (табл. 13, рис.10). На рис. 11 представлены типичные гистограммы, отражающие экспрессию CD54, при цитофлуорометрическом определении экспрессии мембранных антигенов под действием пептидов.Действие вилона. При введении в кулыуральную среду вилона в концентрации 2 нг/мл существенных изменений в клеточном составе тимоцитов зарегистрировано не было. В тимоцитах отмечалось лишь незначительное повышение числа гранул серебра по сравнению с контрольными значениями. Среднее число гранул серебра на ядро в этих условиях составляло 3,3+0,13, что недостоверно превышало контрольные значения на 4% (р 0,5) (табл. 10).
Увеличение в культуральной среде концентрации вилона до 20 нг/мл и 200 нг/мл приводило к заметному повышению числа гранул серебра в тимоцитах. При концентрации вилона 20 нг/мл количество гранул серебра составляло в среднем 3,73+0,12 на ядро; при концентрации 200 нг/мл среднее число гранул серебра на ядро тимоцитов составляло 3.93+0,10. Эти показатели достоверно превышали контрольные значения соответственно на 18% и 24% (р 0,001) (табл. 10). В то же время существенных различий в содержании гранул серебра при концентрации вилона 20 нг/мл и 200нг/мл не выявлено (р 0,1) (табл. 10).
При концентрациях вилона 20 нг/мл и 200 нг/мл отмечалась заметная морфологическая гетерогенность популяции тимоцитов. Среди тимоцитов обычных размеров и строения наблюдалось большое число крупных клеток с нежной структурой хроматина ядер. В таких клетках отмечалось более высокое содержание гранул серебра, чем в тимоцитах. В отдельных клетках число гранул серебра достигало 5-7 и более гранул.
Действие эпиталона. Эпиталон подавлял экспрессию аргирофильных белков в тимоцитах. При этом действие препарата не зависело от его концентрации. Так, в тимоцитах количество гранул серебра при концентрации эпиталона 2 нг/мл составляло в среднем на ядро 2,42+0,09, что было достоверно ниже контрольных значений на 30% (р 0,001) (табл. 12).
Практически сходные изменения в содержании гранул серебра в тимоцитах были зарегистрированы при концентрациях эпиталона 20 нг/мл и 200 нг/мл. При концентрации эпиталона 20 нг/мл количество гранул серебра составляло в среднем 2,52+0,09 на ядро; при концентрации 200 нг/мл среднее число гранул серебра на ядро тимоцитов составляло 2,47+0,13. Эти показатели были достоверно ниже, чем в контроле, соответственно на 25% и 27% (р 0,001).
Регистрируемые различия в содержании гранул серебра в тимоцитах в зависимости от концентрации эпиталона недостоверны (р 0,5) (табл. 12). Отклонения от средних значений при использовании различных доз препаратов носили разнонаправленный характер. Отсутствие костимулирующего эффекта пептидов, возможно, связан с использованием высоких концентарций ФГА (10 мкг/мл) для стимуляции Т-клеток.
Сходная картина проявилась при оценке влияния пептидов на клетки, находящиеся в S-фазе цикла. Пептиды не влияют на клеточный цикл покоящихся мононуклеаров. Значимые эффекты отсутствуют и в отношении ФГА активированных клеток, однако при высоких дозах обоих пептидов намечается тенденция к повышению доли клеток, находящихся в фазах G2/M.
На рисунке 15 проиллюстрирован принцип цитофлуорометрического определения фаз цикла на примере двух проб, отличающихся по величине фракции клеток, находящихся в S-фазе.
Электронная микроскопия
Электронно-микроскопическое изучение тимуса животных контрольных групп показал, что в корковом веществе долек тимоциты образуют скопления, состоящие из клеток, имеющих сходные размеры и морфологическую структуру. Эти клетки имеют крупные ядра с конденсированным по периферии хроматином, одним-двумя ядрышками крупного размера, и узкий ободок цитоплазмы, содержащий небольшое число митохондрий и полирибосом. Среди этих клеток встречаются крупные тимоциты, имеющие более широкий ободок цитоплазмы и содержащие большое число митохондрий, - так называемые активированные лимфоциты. Среди ретикулярных клеток в тимусе интактных крыс большинство составляют макрофаги. В их цитоплазме находятся многочисленные первичные и вторичные лизосомы, а также фагосомы. Степень нагруженности последних фагоцитированным материалом варьирует.
При исследовании сосудов в тимусе контрольных животных видно, что ядра эндотелиальных клеток имеют ровные контуры, в цитоплазме находятся канальцы эндоплазматического ретикулума, умеренное количество небольших митохондрий, пиноцитозные везикулы. В просвете сосудов как правило, выявляются единичные эритроциты.
Тучные клетки встречаются в междольковой соединительной ткани, вблизи кровеносных сосудов. Они имеют эксцентрично расположенное ядро и цитоплазму, заполненную секреторными гранулами высокой электронной плотности. Ретикуло-эпителиальные клетки, которые чаще хорошо видны в мозговом веществе долек, имеют отростчатую форму, рыхлое ядро неправильной формы и цитоплазму, богатую канальцами эндоплазматического ретикулума. В цитоплазме таких клеток встречаются немногочисленные мелкие секреторные гранулы высокой электронной плотности.
количество цитолизосом с фагоцитированным материалом, х 28000. При преждевременном старении (после облучения у животных группы 2) среди наиболее выраженных изменений в тимусе отмечены следующие: отслоение участков наружной ядерной мембраны, нарушение тесных контактов между отдельными тимоцитами. Однако, облучение не уменьшает числа делящихся тимоцитов, находящихся на разных стадиях митоза. Увеличивается частота встречаемости макрофагов, в цитоплазме которых отмечается появление крупных цитолизосом.
В стенках кровеносных сосудов под воздействием облучения также выявляются ультраструктурные изменения. Они связаны с увеличением плотности цитоплазмы одних эндотелиальных клеток и отеком цитоплазмы другах, разрыхлением базальной мембраны и расширением периваскулярных пространств. Цитоплазма эндотелиальных клеток образует многочисленные тонкие выросты в просвет сосудов. Наблюдается появление вакуолей и обеднение митохондрий. Цитоплазма перицитов и их отростки выглядят уплотненными.
Среди тучных клеток наблюдаются различия в реакции на облучение. Так одни клетки не отличаются по своей структуре от мастоцитов контрольных животных, тогда как в других наблюдается образование обширных вакуолей, в которых одновременно может находиться до десятка секреторных гранул различной степени электронной плотности, отражающей разные стадии лизиса секреторного материала.
В ретикуло-эпителиальных клетках наблюдается заметное отслоение наружной мембраны, расширение мембран эндоплазматического ретикулума, появление многочисленных мелких вакуолей, набухание и лизис крист митохондрий. Мелкие секреторные гранулы в небольшом количестве встречаются в перинуклеарном пространстве.
На 21 день после начала эксперимента у облученных животных (группа 2а) в корковом веществе долек тимуса не наблюдается выраженных изменений по сравнению с группой 2. Тимоциты имеют очень узкий ободок цитоплазмы, в которой находится ограниченное число рибосом и митохондрий. Среди делящихся тимоцитов не отмечено появления клеток с патологически протекающими митозами. Митохондрии в делящихся клетках умеренной плотности, с хорошо сохранившимися кристами.
Ретикуло-эпителиальные клетки немногочисленны, а число секреторных гранул в их цитоплазме варьирует от практически полного отсутствия до некоторого увеличения по сравнению с их количеством во 2 группе.
Рис. 20. Тимус. Контроль. Ретикуло - эпителиальная клетка, содержащая в цитоплазме немногочисленные мелкие секреторные гранулы, х 14000.
Щ Со стороны кровеносных капилляров сохраняется некоторая отечность цитоплазмы эндотелиальных клеток и периваскулярных пространств. Отсутствуют признаки активности трансэндотелиального транспорта. Можно отметить также заметное сужение просвета мелких капилляров.
У животных, которым вводился вилон, на 14 сутки от начала облучения выраженных изменений со стороны тимоцитов не отмечено. В корковом веществе тимуса они располагаются, тесно прилегая друг к другу, имеют относительно одинаковые по размеру ядра с одним - двумя ядрышками. Ободок цитоплазмы очень тонкий, встречаются единичные митохондрии, в которых хорошо просматриваются кристы.
Часто встречаются макрофаги, иногда в их цитоплазме видны фагоцитированные клетки на поздних стадиях деградации.
Со стороны кровеносных сосудов наблюдается уменьшение отека цитоплазмы эндотелиальных клеток и периваскулярных пространств. Заметно увеличена их пиноцитозная активность.
В тучных клетках, расположенных в междольковой соединительной ткани, не обнаруживается признаков, свидетельствующих об активизации секреции веществ из них, скорее наблюдается усиление процессов синтеза - в цитоплазме большинства мастоцитов отмечается присутствие большого количества секреторных гранул высокой электронной плотности. В междольковой соединительной ткани отмечено появление эозинофильных лейкоцитов.
В ретикуло-эпителиальных клетках наблюдается слабо выраженное отслоение наружной ядерной мембраны (кариолеммы), уменьшение вакуолизации цитоплазмы, однако встречаются отдельные вакуоли с гранулярным содержимым. Количество гранул в таких клетках невелико, иногда это единичные гранулы.
На 21 сутки после начала эксперимента у животных, получавших вилон (группа За) обращает на себя внимание скопление тучных клеток не только в междольковой соединительной ткани, но и в корковом веществе долек тимуса. Эти клетки содержат в своей цитоплазме секреторные гранулы разных размеров и электронной плотности.
При электронно-микроскопическом исследовании тимуса облученных животных, получавших вилон, в корковом веществе появляются гранулярные лейкоциты (преимущественно полиморфноядерные, реже эозинофильные), а также плазматические клетки, располагающиеся небольшими группами. Ретикуло-эпителиальные клетки не обнаруживают выраженных морфологических изменений, но количество секреторных гранул в их цитоплазме невелико.
Таким образом, проведенные исследования показали, что при преждевременном старении, вызванном фракционированным облучением в диапазоне сублетальных доз в тимусе животных, получавших вилон, выявляются особенности структурно-функциональной организации, которые проявляются, в основном, на ультраструктурном уровне. Обращает внимание быстрое восстановление структуры сосудистой стенки и формирования периваскулярного пространства под действием вилона. Инфильтрация коркового вещества зернистыми лейкоцитами и плазматическими клетками при этом, возможно, связана именно с интенсификацией репаративных процессов, так как известно, что гранулоциты чувствительны к активации различными гуморальными и клеточными факторами. Скопление тучных клеток в корковом веществе может быть вызвано тем, что для окончательной дифференцировки мастоцитов требуется присутствие интерлейкина-3, продуцируемого Т-лимфоцитами.
Действие вилона (4 группа)
В группе необлученных животных после введения вилона наиболее существенный эффект регистрируется по изменению пролиферативной активности клеток в тимусе. IPCNA достигает 37±3%. Эти данные отражают влияние вилона на дифференцировку и скорость миграции морфологически зрелых Т-лимфоцитов из коркового слоя тимуса в мозговое вещество.
Все остальные изученные параметры в тимусе остаются в пределах варьирования морфо-функциональных показателей у контрольных животных. Результаты компьютерного анализ приведены на рис. 25 и 26.
Обработка тимоцитов человека исследованными цитогенами (вилоном-В и эпиталоном-Э) in vitro, влияет на проявления активации тимоцитов, индуцируемые контактом с ТЭК: пептиды ослабляют экспрессию раннего маркера активации CD69 (В Э) и усиливают экспрессию поздних маркеров активации CD54 (В Э) и HLA-DR (Э В). Эффекты вилона и эпиталона, выявленные в данных тест-системах, конкордантны по направленности, хотя отличаются по степени выраженности. Изученные пептиды, особенно эпиталон, защищают тимоциты от апоптоза, индуцированного контактом с ТЭК.
Усиление экспрессии CD54 свидетельствует о повышении адгезивных свойств клеток. Адгезивность может повышаться в отношении как стромальных клеток, так и самих тимоцитов, которые экспрессируют интегрин LFA-1, рецептором которого является молекула CD54 (ICAM-1). Несколько труднее оценить значимость усиления экспрессии на тимоцитах молекул главного комплекса гистосовместимости II класса. Лишь в последние годы начато изучение роли этих молекул в функционировании Т-лимфоцитов в качестве антигенпрезентирующих клеток (подобная презентация, как правило приводит к анергии Т-клеток, которым "преподносится" антиген). Возможно, экспрессия молекул МНС II класса и связанная с ней супрессорная активность тимоцитов имеют отношение к регуляции процессов внутритимусной селекции. С положительной селекцией клонов тимоцитов связана также экспрессия на поверхности тимоцитов молекулы CD69. К селекции, особенно отрицательной, имеет прямое отношение апоптоз тимоцитов. Влияя на экспрессию названных молекул и на выраженность апоптоза, пептиды могут вмешиваться в селекцию клонов тимоцитов, контролируя и модифицируя его. Таким образом, они оказывают влияние на формирование антигенраспознающего репертуара и, возможно, способствуют предотвращению аутоагрессии. Однако указать конкретные точки воздействия пептидов на внутритимусные процессы и более точно определить оказываемые ими эффекты in vivo пока затруднительно.
Вилон и эпиталон подавляют экспрессию молекулы адгезии CD54 (ICAM-1) и продукта МНС II (HLA-DR); вилон усиливает, а эпиталон подавляет экспрессию раннего маркера активации CD69. Экспрессия двух первых молекул имеет прямое отношение процессам селекции, поскольку ее условием является адгезия тимоцитов к ТЭК и распознавание тимоцитами молекул МНС на поверхности ТЭК. Функциональное назначение молекулы CD69 на ТЭК не установлено; она является лишь признаком активации клеток. Пока трудно сказать, каков биологический смысл ослабления экспрессии CD54 и HLA-DR (в частности, для процесса селекции), особенно в сочетании с усилением экспрессии этих же молекул, которое наблюдается при действии пептидов на тимоциты. Вероятно, такое разнонаправленное действие обеспечивает определенный баланс адгезии и деадгезии тимоцитов и клеток стромы, а также положительных и отрицательных сигналов при распознавании тимоцитами молекул МНС. Очевидно, что такая сбалансированность необходима для эффективного осуществления процесса селекции.
Пептиды усиливают спонтанную выработку цитокинов, не влияют на спонтанную выработку тимулина, но отменяют усилении секреции этого гормона под влиянием контакта ТЭК с тимоцитами. Вероятно, внутритимусные пептиды, в частности, вилон, могут выступать в роли физиологических стимуляторов выработки ИЛ-1 и ИЛ-7, очень важных для осуществления контроля развития (дифференцировки и пролиферации) тимоцитов. В то же время в отношении тимулина они являются скорее ограничителями, сдерживающими чрезмерную выработку этого гормона ТЭК, постоянно контактирующими с тимоцитами.
Наконец, вилон, но не эпиталон, является фактором в определенной степени "омолаживающим" состарившиеся ТЭК: он повышает пролиферативный потенциал ТЭК, длительно пассированных в культуре. Здесь интересным является как сам эффект, подтверждающий представления о способности данного пептида повышать активность иммунной системы стареющих организмов, так и свидетельство тканеспецифичности этого эффекта: подобное действие оказывает на ТЭК пептид, в норме присутствующий в тимусе, но не "посторонний" для тимуса эпиталон.
Изученные пептиды оказывают умеренно выраженное, но достаточно закономерное действие на мононуклеары крови и активированные Т-лимфоциты. В ряде случаев эффекты вилона и эпиталона противоположны по направленности, как это наблюдается при оценке активационного апоптоза Т-клеток, который эпиталон усиливает, а вилон несколько ослабляет. Вероятно, оба эффекта в определенных ситуациях могут быть полезными: ограничение апоптоза полезно в начальный период иммунного ответа, когда предпочтительным является выход активированных клеток не в апоптоз, а в активацию, тогда как усиление апоптоза желательно на поздних стадиях ответа, когда гибель отработавших клеток предохраняет организм от опасности их т злокачественного перерождения и аутоагрессии.
