Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о роли системы про- и антиоксид антов, окислительной модификации белков в развитии окислительного стресса 11
1.1. Окислительный стресс в патогенезе воспаления 11
1.2. Факторы цитотоксичности фагоцитов 16
1.3. Свободнорадикальное окисление макромолекул 23
1.3.1. Окислительная модификация белков 25
1.4. Механизмы антиоксидантной защиты 33
1.4.1. Ферментативные антиоксиданты 35
1.4.2. Неферментативные антиоксиданты 42
1.5. Окислительная модификация белков и состояние тиолдисульфидной системы при окислительном стрессе 46
Заключение 49
Глава 2. Материал и методы исследования 50
2.1. Материал исследования 50
2.1.1. Клиническая характеристика пациентов с внебольничной пневмонией 51
2.1.2. Экспериментальный блок исследования 53
2.2. Методы исследования 56
2.2.1. Выделение нейтрофилов крови 56
2.2.2. Культивирование нейтрофилов крови 57
2.2.3. Определение содержания провоспалительных цитокинов в супернатантах культур нейтрофилов крови 58
2.2.4. Определение активности миелопероксидазы нейтрофилов крови 59
2.2.5. Определение уровня продукции гидроксильного радикала нейтрофилами крови 59
2.2.6. Определение содержания восстановленного и окисленного глутатиона в нейтрофилах крови 60
2.2.7. Определение концентрации SH-групп белков в нейтрофилах крови 61
2.2.8. Определение содержания белково-связанного глутатиона в нейтрофилах крови 61
2.2.9. Определение активности глутатионпероксидазы в нейтрофилах крови 62
2.2.10. Определение активности тиоредоксинредуктазы в нейтрофилах крови 63
2.2.11. Определение содержания карбонильных производных белков в нейтрофилах крови 63
2.2.12. Определение концентрации белка в нейтрофилах крови 64
2.2.13. Определение содержания ТБК-активных продуктов в плазме крови 65
2.2.14. Определение содержания карбонильных производных белков плазмы крови 66
2.2.15. Определение содержания битирозина и окисленного триптофана в плазме крови 67
2.2.16. Определение активности каталазы в плазме крови 68
2.2.17. Определение содержания церулоплазмина в плазме крови 68
2.2.18. Определение концентрации общего белка в плазме крови 69
2.3. Статистическая обработка результатов 69
Глава 3. Результаты собственных исследований 70
3.1. Клинический блок исследования 70
3.1.1. Функциональное состояние нейтрофилов крови у пациентов с внебольничной пневмонией 70
3.1.2. Оценка параметров перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы плазмы крови у пациентов с внебольничной пневмонией 73
3.1.3. Состояние тиолдисульфидной системы в нейтрофилах крови у пациентов с внебольничной пневмонией 75
3.1.4. Окислительная модификация белков нейтрофилов и плазмы крови у пациентов с внебольничной пневмонией 78
3.2. Экспериментальный блок исследования 82
3.2.1. Функциональный статус, состояние тиолдисульфидной системы и окислительная модификация белков нейтрофилов у пациентов с внебольничной пневмонией и в условиях окислительного стресса in vitro 83
3.2.2. Влияние блокатора и протектора SH-групп, ингибиторов синтеза глутатиона и каталазы на функциональное состояние нейтрофилов крови у пациентов с внебольничной пневмонией и при окислительном стрессе in vitro 87
3.2.3. Влияние блокатора и протектора SH-групп, ингибиторов синтеза глутатиона и каталазы на состояние тиолдисульфидной системы нейтрофилов крови у пациентов с внебольничной пневмонией и при окислительном стрессе in vitro 93
3.2.4. Влияние блокатора и протектора SH-групп, ингибиторов синтеза глутатиона и каталазы на окислительную модификацию белков в нейтрофилах крови у пациентов с внебольничной пневмонией и при окислительном стрессе in vitro 98
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 103
Выводы 143
Список литературы 145
- Окислительная модификация белков и состояние тиолдисульфидной системы при окислительном стрессе
- Клиническая характеристика пациентов с внебольничной пневмонией
- Определение содержания провоспалительных цитокинов в супернатантах культур нейтрофилов крови
- Состояние тиолдисульфидной системы в нейтрофилах крови у пациентов с внебольничной пневмонией
Введение к работе
Актуальность исследования. Острое воспаление остается актуальной медицинской проблемой в силу широкой распространенности и стабильно высокой летальности заболеваний, сопровождающихся развитием воспалительного процесса [Маянский Д. Н., 1997; Логвиненко Н. И., 2003; Чучалин А. Г., 2006]. Молекулярные механизмы воспаления включают увеличение продукции нейтрофилами активных форм кислорода (АФК), которые в условиях дисбаланса системы антиоксидантної! защиты обусловливают развитие окислительного стресса с проявлениями его на молекулярном, клеточном и организменном уровнях [Кулинский В. И., 1999; Дубинина Е. Е., 2006; Чеснокова Н. П., 2007; Меныцикова Е. Б. и соавт., 2008]. В частности, окислительный стресс является механизмом повреждения клеток при воспалительных заболеваниях в легких, где метаболическая активность нейтрофильных лейкоцитов не лимитируется содержанием кислорода [Wenger R. Н., 2000; Peers С, Kemp P. J., 2001].
Активные формы кислорода при окислительном стрессе вызывают активацию процессов перекисного окисления липидов, повреждение нуклеиновых кислот, окислительную модификацию белков [Владимиров Ю. А., 2000; Stadtman Е. R., Levine R. L., 2000; Дубинина Е. Е., 2006] не только в клетках-мишенях, но и в самих нейтрофилах. Окислительная модификация вызывает изменения структурной организации белков, их агрегацию и денатурацию, приводя к нарушению или исчезновению функциональной активности протеинов (каталитической, регуляторной, транспортной, рецепторной и др.), и может индуцировать гибель клетки [Droge W., 2002; Дубинина Е. Е., 2006; Лущак В. И., 2007].
Существенный вклад в поддержание баланса между прооксидантными эффектами и антиоксидантным потенциалом клетки вносит тиолдисульфидная система [Stadtman Е. R., Levine R. L., 2000; Chappie I. L., 2002]. Восстановленный глутатион, выступая акцептором гидроксильного радикала и синглетного кислорода, существенно снижает деструктивное и цитотоксическое действие АФК [Zhu Y. et al., 2007]. Одновременно глутатион участвует в работе глутатионзависимых ферментов, которым принадлежит ведущая роль не только в обеспечении антиоксидантных процессов, но и в регуляции структуры и функций биологических мембран, в механизмах детоксикации [Шепелев А. П. и соавт., 2000; Меныцикова Е. Б. и соавт., 2006]. В последние годы многочисленные исследования связаны с выяснением роли глутатиона в экспрессии генов, внутриклеточной сигнализации, регуляции активности ферментов, апоптоза и других процессов [Cumming R. С. et al., 2004; Fonnan Н. J., 2004; Day R. M, Suzuki Y. J., 2005; Asian M., Canatan D., 2008; Circu C. L. et al., 2009]. Наряду с этим для поддержания окислительно-восстановительного баланса клетки большое значение имеют сопряженные эффекты тиоредоксина, функционирующего как дисульфидредуктаза, и НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазы, осуществляющей его восстановление [Дас Д. К., Молик Н., 2004; Nakamura Н., 2004].
Роль тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков в регуляции функций нейтрофилов, как в норме, так и при патологии, остается недостаточно изученной. Наиболее актуальным представляется выявление взаимосвязей между дисбалансом тиолдисульфидной системы, степенью окислительной модификации белков и функциональным состоянием нейтрофилов в условиях окислительного стресса, сопровождающего развитие воспалительного процесса.
Цель исследования: установить роль тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков в механизмах изменений функциональных свойств нейтрофильных лейкоцитов крови при внебольничной пневмонии и экспериментальном окислительном стрессе.
Задачи исследования:
1. Изучить особенности функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов крови (продукция гидроксильного радикала, провоспалительных цитокинов ИЛ-8 и ФНО-а, активность миелопероксидазы) у больных внебольничнои пневмонией и при экспериментальном окислительном стрессе.
Оценить состояние тиолдисульфидной системы в нейтрофильных лейкоцитах крови у больных внебольничнои пневмонией и в условиях экспериментального окислительного стресса.
Определить содержание продуктов окислительной модификации белков в нейтрофильных лейкоцитах и плазме крови пациентов с внебольничнои пневмонией и при экспериментальном окислительном стрессе.
Оценить фукциональное состояние и окислительную модификацию белков в нейтрофилах крови у больных внебольничнои пневмонией и при экспериментальном окислительном стрессе в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибитора каталазы или синтеза глутатиона.
Выявить общие закономерности и механизмы влияния тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков на функциональные свойства нейтрофильных лейкоцитов крови у больных внебольничнои пневмонией и при экспериментальном окислительном стрессе.
Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка состояния тиолдисульфидной системы, окислительной модификации белков и функциональных свойств нейтрофильных лейкоцитов крови при остром воспалении на примере внебольничнои пневмонии и экспериментальном окислительном стрессе, индуцированным 200 мкМ перекисью водорода. Установлено, что в нейтрофильных лейкоцитах крови больных внебольничнои пневмонией и при окислительном стрессе in vitro дисбаланс тиолдисульфидной системы и окислительная модификация белков сопровождаются изменениями функционального состояния клеток (возрастанием продукции гидроксильного радикала, провоспалительных цитокинов ИЛ-8 и ФНО-а и активности миелопероксидазы).
Показано, что в условиях действия протектора SH-rpynn 1,4-дитиоэритритола в нейтрофильных лейкоцитах крови пациентов с внебольничной пневмонией и при экспериментальном окислительном стрессе происходит снижение содержания карбонильных производных белков. При культивировании нейтрофилов крови больных внебольничной пневмонией и с индуцированным окислительным стрессом с ингибитором каталазы или синтеза глутатиона выявлено, что дефицит восстановленного глутатиона в клетках приводит к активации окислительной модификации белков, снижению активности миелопероксидазы и продуции гидроксильного радикала на фоне повышенной продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-8 и ФНО-а.
Установлено, что молекулярные механизмы изменений функциональных свойств нейтрофильных лейкоцитов крови при внебольничной пневмонии и экспериментальном окислительном стрессе, индуцированным 200 мкМ перекисью водорода, являются однотипными и сопряжены с участием восстановленного и белково-связанного глутатиона в защите внутриклеточных белков от окислительного повреждения.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в результате проведенного исследования новые данные фундаментального характера позволяют расширить существующие представления о механизмах регуляции функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов крови в условиях острого воспаления в клинике внутренних болезней и окислительного стресса in vitro. Выявлена роль восстановленного глутатиона в регуляции процессов окислительной модификации белков и в поддержании функционального состояния нейтрофилов крови у пациентов с внебольничной пневмонией и при окислительном стрессе in vitro. Установленные закономерности могут быть использованы для дальнейшего изучения редокс-чувствительных механизмов нарушений функциональных свойств нейтрофилов и послужить основой для разработки молекулярных технологий регуляции функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов крови при развитии воспалительного процесса.
Положения, выносимые на защиту:
Окислительный стресс при внебольничной пневмонии сопровождается дисбалансом тиолдисульфидной системы (снижение содержания восстановленного глутатиона, тиоловых групп белков, активности глутатионпероксидазы и возрастание концентрации окисленной формы глутатиона), активацией процессов окислительной модификации белков в нейтрофильных лейкоцитах крови и изменениями функциональных свойств клеток (возрастание продукции гидроксильного радикала, ИЛ-8, ФНО-а и активности миелопероксидазы).
Активация окислительного повреждения белков в нейтрофилах крови у больных внебольничной пневмонией и при экспериментальном окислительном стрессе в условиях действия ингибитора синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимина или ингибитора каталазы 3-амино-1,2,4-триазола сопряжена с дефицитом восстановленного глутатиона и нарушением образования белково-связанного глутатиона.
Механизмы изменений функциональных свойств нейтрофильных лейкоцитов крови (продукции гидроксильного радикала, ИЛ-8, ФНО-а и активности миелопероксидазы) у пациентов с внебольничной пневмонией и при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированным 200 мкМ перекисью водорода, являются однотипными и опосредованы снижением восстановительного потенциала тиолдисульфидной системы и активацией процессов окислительной модификации белков.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на XX Съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007), Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), III общероссийской научной конференции с международным участием «Перспективы развития вузовской науки» (Дагомыс-Сочи, 2007), 18 Конгрессе Европейского респираторного общества (Берлин, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 3 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы, включающего 310 источников, из них — 95 отечественных и 215 иностранных. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 5 рисунками.
Окислительная модификация белков и состояние тиолдисульфидной системы при окислительном стрессе
В настоящее время окислительное повреждение белков рассматривается как «ранний индикатор поражения тканей при различных патологических состояниях», в том числе воспалительных процессах [Дубинина Е.Е., 2006]. Показано, что сывороточные белки окислительно модифицируются образующимися в ходе развития воспаления прооксидантами и могут выступать, в свою очередь, как факторы активации нейтрофилов [Kormoczi G.F. etal.,2001].
Известно, что при воспалительных заболеваниях, таких как острый респираторный дистресс-синдром, в ткани легких резко возрастает уровень ОСГ и N02 , что сопровождается окислением, хлорированием и нитрованием тирозиновых остатков сурфактантного белка SP-A [Maruyama Y. et al., 2004]. Модификация белка приводит к нарушению его функциональных свойств, связанному с агрегацией липидов и соединением с маннозой. Снижение способности липидов к агрегации в результате окислительной деструкции сурфактантного белка приводит к нарушению формирования тубулярного миелина, необходимого для функционирования сурфактанта легких. В свою очередь, окисленные белки сурфактанта становятся более чувствительными к протеолизу, скорость их деградации превышает синтез de novo, что приводит к снижению пула функционально активного SP-A [Davis А.С. et al., 2002].
Состояние системы глутатиона также может играть важную роль в жизнеспособности эффекторных клеток воспаления и защите против эндогенных и экзогенных оксидантов [Beier J., Beeh К.М., 2005; Circu С. L. et al., 2009]. Это подтверждено ранними исследованиями, показывающими, что фагоциты, полученные от пациентов с генетическим дефицитом глутатионсинтетазы или ГР быстро повреждаются в течение фагоцитоза [Roos D. et al., 1979; Spielberg S.P. et al., 1979], а также если восстановление GSSG ингибировано [Cohen H.J., Tape E.H., 1987]. Сравнение активности ферментов глутатионового цикла в нейтрофилах и моноцитах по данным A.A. Voetman и D. Roos [1980] показало сходную активность ГПО и ГР в этих клетках. Однако P. Pietarinen-Runtti et al. [2000] установили, что нейтрофилы имеют более низкие уровни мРНК ГПО, ее активности и содержания GSH, чем моноциты. Уменьшение концентрации GSH и активности ГПО могут вносить вклад в короткую продолжительность жизни нейтрофилов [Narayanan Р.К., 1997; Curi Т.С. et al., 1998; Pietarinen-Runtti P. etal., 2000].
В нейтрофилах респираторный взрыв сопровождается образованием дисульфидных связей между низкомолекулярными тиолами и сульфгидрильными группами белков — так называемая «S-тиоляция», с последующей «детиоляцией». При исследовании динамической природы этого процесса в моноцитах человека in vitro было показано, что степень выраженности «S-тиоляции» и респираторного взрыва, стимулируемого опсонизированным зимозаном или форболмиристатацетатом, находятся в близкой ассоциации. Индивидуальные белки подвергались «S-тиоляции» и «детиоляции» при инкубации клеток с различными прооксидантами, причем предположительно перекись водорода является особенно эффективным агентом в посредничестве «S-тиоляции». Известно, что «S-тиоляция» ингибируется при добавлении каталазы и стимулируется в присутствии азида натрия, который ингибирует КАТ [Сагг А.С., Winterbourn С.С, 1997]. Показано, что добавление ЬЬОо к моноцитам или лимфоцитам индуцирует быструю «S-тиоляцию» (от 1 до 3 минут), с последующей «детиоляцией» большинства белков в течение 15-30 минут [Leichert L.I., Jakob U., 2004].
При инкубации нейтрофилов in vitro в присутствии Н202 и ингибитора ГР была эффективна «S-тиоляция», но «детиоляция» была ингибирована, что позволило предположить участие в этом процессе системы глутатиона. Установлено, что GSH наиболее распространенный в клетке низкомолекулярный тиол, участвующий в «S-тиоляции». Время максимального восстановления цитозольного GSSG в ходе респираторного взрыва (10 минут) совпадает со временем, в течение которого в клетке наблюдается самый высокий уровень белковосвязанного глутатиона [Seres Т. etal, 1996].
Напротив, в исследовании [Chai Y.C. et al., 1994] при изучении «S-тиоляции» индивидуальных белков нейтрофилов в ходе респираторного взрыва, включая актин? не были получены доказательства участия глутатиона в этом процессе. В течение первых 30 минут после стимуляции нейтрофилов 10% клеточного глутатиона обнаруживалось в белковосвязанном виде (2 нмоль/мг белка). При этом не отмечалось увеличения концентрации GSSG. Это дало основание авторам предполагать, что «S-тиоляция» белков происходила не посредством тиолдисульфидного обмена. Возможно, глутатион синтезировался на начальных стадиях респираторного взрыва, компенсируя то количество глутатиона, которое связалось с белком.
Клиническая характеристика пациентов с внебольничной пневмонией
В программу обследования были включены 48 пациентов (23 мужчины и 25 женщин) с диагнозом внебольничной пневмонии (ВП). Из них 30 больных с преимущественно альвеолярным типом лёгочного инфильтрата (17 мужчин и 13 женщин) и 18 пациентов с преимущественно интерстициальным типом лёгочного инфильтрата (6 мужчин и 12 женщин).
Диагноз внебольничной пневмонии был поставлен на основании клинической картины (кашель с отделением мокроты, одышка смешанного характера, повышение температуры тела до 38С), физикального (перкуссия и аускультация), рентгенологического, бактериологического исследований.
При перкуссии грудной клетки у больных выявлялись: симптом уплотнения легкого, притупление перкуторного звука, усиление голосового дрожания, при аускультации над очагом воспаления определялись крепитация или влажные звучные мелкопузырчатые хрипы.
Всем пациентам при поступлении в стационар для верификации диагноза проводили прямую обзорную и боковую рентгенографию органов грудной клетки и дополнительно компьютерная томография высокого разрешения с шагом 2 мм. У обследованных больных рентгенологически определялись усиление легочного рисунка, участки инфильтрации паренхимы легких. Правое и левое легкое были поражены с одинаковой частотой - у 21 пациента (44 %) и 27 пациентов (56 %) соответственно.
Данные компьютерной томографии легли в основу разделения пациентов с ВП на подгруппы согласно верифицируемому типу легочного инфильтрата - преимущественно альвеолярному или интерстициальному. Разные типы инфильтрации легочной паренхимы сопровождались разной выраженностью основных клинических симптомов/синдромов ВП (табл. 2).
Для верификации возбудителя проводились бактериологические исследования, для выявления пневмонии, вызванной Mycoplasma pneumoniae, - ГЩР-диагностика. По данным бактериологических посевов и ПЦР-диагностики у 40% пациентов наблюдалось инфицирование Mycoplasma pneumoniae, у 60% больных Pneumococcus (Streptococcus pneumoniae).
Клинико-лабораторное исследование включало биохимический анализ крови (содержание С-реактивного белка, серомукоидов, общего белка, глюкозы, при необходимости активность аминотрансфераз (аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы)), общий анализ мочи и крови. При этом в сыворотке больных ВП были зарегистрированы повышение концентрации С-реактивного белка (выше 10 мг/л), нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево, увеличение скорости оседания эритроцитов (выше 15 мм/час).
В плазме крови пациентов с ВП определяли содержание ТБК-активных продуктов, церулоплазмина, карбонильных производных белков, битирозина и триптофана и активность каталазы. У пациентов с ВП оценивали функциональный статус нейтрофильных лейкоцитов (продукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-8, ФНО-а), гидроксильного радикала и активность миелопероксидазы), состояние тиолдисульфидной системы (содержание GSH, GSSG, тиоловых групп белков (белок-SH), белково-связанного глутатиона (белок-SSG), активность ГПО, ТРР) и процессы окислительной модификации белков (содержание карбонильных производных белков методом ИФА) в нейтрофилах (табл. 3).
Развитие окислительного стресса при остром воспалении происходит при участии активных форм кислорода, среди которых одной из ведущих является Н202.
Средством, позволяющим устанавливать взаимосвязи между теорией и опытом в медицинской науке служит экспериментальная модель [Веденов А.А., 1988]. Широко используемым для индукции ОС агентом является перекись водорода. По данным литературы концентрации Н2СЬ от 100 до 500 мкМ являются оптимальными для моделирования окислительного стресса [Pietarinen-Runtti P. et al., 2000; Коваленко Е.И. и соавт., 2007]. Более высокие концентрации (от 1 мМ) активируют запуск программированной гибели клеток, культивируемых in vitro [dimming R.C., Nancy L., 2004].
Для моделирования ситуации ОС выделенные нейтрофилы крови (см. пункт 2.2.1.) здоровых доноров (суспензию, стандартизованную до 2 106 клеток/мл) культивировали в стерильных условиях в полной питательной среде (90% RPMI-1640 ("Вектор-Бест", Новосибирск), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург), инактивированной при 56 С в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 2 мМ/мл HEPES («Flow», Великобритания)) с добавлением перекиси водорода в конечной концентрации 200 мкМ. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37 С и 5% С02 в стерильных пенициллиновых флаконах.
В условиях данной модели изучали функциональный статус нейтрофилов, состояние тиолдисульфидной системы и процессы окислительной модификации белков в клетках.
Для оценки участия глутатиона в защите белков нейтрофилов от окислительной модификации и его роли в поддержании функциональной активности клеток в условиях ОС in vitro и при ВП выделенные нейтрофильные лейкоциты инкубировали с блокатором SH-групп N-этилмалеимидом (NEM) («Sigma», США) или ингибитором синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимином (BSO) («Sigma», США) или протектором SH-групп - 1,4-дитиоэритритолом (DTE) («Sigma», США).
Определение содержания провоспалительных цитокинов в супернатантах культур нейтрофилов крови
Для определения содержания ИЛ-8 и ФНО-а в супернатантах культур нейтрофильных лейкоцитов использовали твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ELISA).
Принцип метода заключается в конъюгации одного эпитопа молекулы цитокина с мышиными моноклональными антителами, сорбированными на твердой фазе микропланшета. Другой тип антител — кроличьи поликлональные антитела, специфичные против человеческих цитокинов, соединяются с независимым эпитопом цитокина. Избыток кроличьих антител удаляли. К сорбированным на твердой фазе комплексам «цитокин-антитело» добавляли окрашивающий раствор. Оптическая плотность раствора пропорциональна концентрации определяемого вещества и регистрируется колориметрически. Калибровочная кривая строится с использованием среды, не содержащей продукты жизнедеятельности клеток («О доза») и стандартных растворов цитокинов с известной концентрацией.
Процедуру выполнения ИФА проводили по инструкции, предлагаемой производителем тест-систем («Вектор-Бест», Россия). Для этого микропипеткой добавляли по 100 мкл «0 дозы» и стандартов № 0—4 для ИЛ-8 и ФНО-а в соответствующие ячейки. В оставшиеся ячейки помещали 100 мкл супернатанта и инкубировали планшет при 37 С в течение 120 мин. После пятикратного цикла промывки автоматическим вошером, в каждую ячейку добавляли по 100 мкл поликлональных антител, инкубировали 60 мин при 37 С и повторяли цикл промывки. Далее вносили в каждую лунку стрипов по 100 мкл конъюгата пероксидазы хрена и инкубировали необходимое по методике время (30 мин). 100 мкл окрашивающего раствора тетраметилбензидина вводили в лунки после очередного цикла промывок и оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Реакцию останавливали добавлением в ячейки стоп-раствора (0,5 М серная кислота). Оптическую плотность образцов регистрировали на микропланшетном ридере ("Bio-Rad 550 \ Россия) при длине волны 450 нм. Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой. Результаты выражали в пг/мл.
Активность МПО нейтрофилов крови оценивали методом, основанным на преобразовании ферментом ортофенилендиамина.
Нейтрофилы лизировали дистиллированной водой с добавлением тритона Х-100. К 0,3 мл лизата приливали 1,2 мл субстратной смеси (0,04 % ортофенилендиамин и 0,014% Н2Ог на 0,2 М фосфатном буфере рН=5,0), через 5 мин реакцию останавливали, добавляя 1,2мл IN серной кислоты. Экстинкцию измеряли при длине волны 492 нм против контроля, в котором вместо лизата клеток использовали 0,3 мл дистиллированной воды.
Расчет активности миелопероксидазы производили с помощью калибровочного графика, для построения которого растворы пероксидазы хрена («Sigma», США) с концентрациями от 0,01 до 2 мкг/мл обрабатывали аналогично опытным пробам. Концентрацию пероксидазы хрена, соответствующую оптической плотности образцов умножали на 100 и получали условные единицы (у.е.) активности миелопероксидазы.
Принцип метода основан на разрушении модельного субстрата 2 дезокси-Д-рибозы гидроксильным радикалом, образуемым опсонизированными нейтрофилами.
В две опытные пробы добавляли по 250 мкл суспензии нейтрофилов, содержащей не менее 2-10 клеток в 1 мл, 250 мкл 15 мМ раствора 2-дезокси-Д-рибозы на среде Хенкса (рН=7,4) и 30 мкл раствора зимозана. Затем в одну из них добавляли 250 мкл 240 мМ раствора абсолютного этанола, а в другую - 250 мкл среды Хенкса. Обе пробы инкубировали 30 мин при 37 С, затем в них добавляли по 0,6 мл 1 % раствора ТБК и 0,6 мл 2,8 % раствора трихлоруксусной кислоты. Обе пробы инкубировали 15 мин при 100 С и после охлаждения центрифугировали 10 мин при 500 g. Оптическую плотность измеряли при длине волны 532 нм.
Расчет производили с учетом разведения и коэффициента молярной экстинкции образующегося продукта (1,56-10 М"1см-1). Результаты выражали в нмоль/мг белка.
Содержание восстановленного и окисленного глутатиона определяли методом, предложенным М.Е. Anderson [1985] в модификации Kojima S. et al. [2004].
Принцип метода основан на том, что восстановленный глутатион
взаимодействует с 5,5 -дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) -реактивом Эллмана на SH-группы, с образованием тио-2-нитробензойной кислоты, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. При этом образуется окисленный глутатион, который восстанавливается глутатионредуктазой и восстановленная форма трипептида вновь взаимодействует с ДТНБ.
Скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию общего глутатиона. Для определения окисленной формы трипептида пробы предварительно инкубируются с блокатором SH-групп -2-винилпиридином («Wako», Япония), который необратимо связывает в пробе восстановленный глутатион и, в данном случае, скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию окисленного глутатиона.
Лизат нейтрофилов готовили на 5 % сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы.
Количество общего глутатиона (GSH+GSSG) определяли в пробе содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (рН=7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатионредуктазы («Wako», Япония). При измерении уровня окисленного глутатиона супернатант предварительно инкубировали 30 мин с 2-винилпиридином (10 мМ), после чего определяли скорость реакции в описанной выше инкубационной среде. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производили с помощью калибровочных графиков, для построения которых растворы восстановленного и окисленного глутатиона («MP», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ обрабатывали аналогично опытным пробам. Концентрацию восстановленного глутатиона рассчитывали как разницу между концентрацией общего и окисленного глутатиона. Результаты представляли в нмоль/мг белка. Дополнительно рассчитывали величину отношения GSH/GSSG, как маркера окислительного стресса. Принцип метода основан на способности тиоловых соединений при взаимодействии с ДТНБ образовывать окрашенное соединение тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. К 0,1 мл осадка белка, растворенного в 0,4 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН=7,0) добавляли 0,1 мл 0,4 мг/мл ДТНБ и измеряли поглощение при 412 нм против контроля, содержащего вместо осадка белка воду. Расчет производили с учетом коэффициента молярной экстинкции 13-10 М" см" . Результаты выражали в нмоль SH на мг белка.
Состояние тиолдисульфидной системы в нейтрофилах крови у пациентов с внебольничной пневмонией
Активация процессов свободнорадикального окисления в клетках сопряжена с индукцией изменений в антиоксидантной защите, наиболее существенным звеном которой является тиолдисульфидная система (ТДС). Низ комол екулярные тиолы, очень широко представленные в клетке в виде трипептида глутатиона, и SH-содержащие белки присутствуют в клетке в восстановленном и окисленном состоянии.
Нейтрофилы, являясь главными продуцентами АФК при остром воспалении, сами испытывают значительную окислительную нагрузку, в связи с чем неизбежны компенсаторные реакции со стороны тиолдисульфидной системы. При оценке состояния ТДС в нейтрофилах у больных внебольничной пневмонией были выявлены следующие закономерности (табл. 6).
Концентрация восстановленного глутатиона в нейтрофильных лейкоцитах пациентов с ВП была снижена в 3,0 раза (р 0,05) относительно контрольных величин, составляющих 4,84 (4,64-5,39) нмоль/мг белка. Снижение уровня GSH свидетельствует об его интенсивном расходовании для инактивации АФК. Также нами был отмечен факт активного вовлечения функционально свободных SH-гругш белков нейтрофилов в реакции окисления при ВП, в результате чего их содержание было снижено в 1,9 раза (р 0,05) относительно аналогичного показателя в контроле, составляющего 3,15 (2,83-3,39) нмоль/мг белка. Функционально свободные SH-группы белков при нейтрализации оксидантов расходуются в первую очередь, оказывая протекторный эффект в отношении SH-групп активных центров ферментов.
Одновременно в нейтрофильных лейкоцитах у больных ВП отмечалось возрастание содержания окисленной формы глутатиона и белково-связанного глутатиона соответственно в 1,7 и 11,6 раз (р 0,05) по сравнению с аналогичными значениями в нейтрофилах здоровых доноров, составляющими для GSSG - 0,27 (0,25-0,31) нмоль/мг белка, а для белок-SSG — 0,05 (0,03-0,08) нмоль/мг белка. В связи с чем закономерным итогом стало снижение в 6,5 раза (р 0,05) величины соотношения GSH/GSSG относительно его контрольных значений - 18,57 (16,72-19,37). Полученные данные свидетельствуют о том, что при ОС часть восстановленного глутатиона способна расходоваться для защиты SH-групп белковых молекул путем обратимого связывания с ними. Однако это способствует уменьшению восстановительного потенциала системы глутатиона.
Изучаемое нами звено тиолдисульфидной системы является «первой линией» защиты клеток в условиях ОС, следующим уровнем АОЗ являются ферментативные антиоксиданты. В данной работе оценивалась активность глутатионпероксидазы, восстанавливающей гидроперекиси липидов, а также тиоредоксинредуктазы, осуществляющей биорегенерацию окисленного тиоредоксина (табл.7).
Нами выявлено снижение в 1,6 раза активности ГПО (табл. 7) в нейтрофилах, полученных у больных ВП, по сравнению с активностью фермента в клетках здоровых доноров, которая составила 160,60 (132,60-174,20) нмоль/(мин-мг белка) (р 0,05). Это указывает на уменьшение антиоксидантного потенциала данного фермента в эффекторных клетках острого воспаления при развитии ВП. Глутатионпероксидаза является основным ферментом антиперекисной защиты в клетках при ОС, сопровождающем воспаление. Ее оптимальное функционирование по нейтрализации избыточных количеств Н2Ог и гидроперекисей липидов осуществляется в комплексе с другими ферментами, в частности с ТРР. Активность ТРР в нейтрофилах у больных ВП составила 14,74 (11,32-16,20) нмоль/(мин-мг белка) и не имела значимых различий с аналогичным показателем в контрольной группе здоровых доноров, составившим 13,48 (8,0-17,70) нмоль/(мин-мг белка) (р 0,05).
В целом, при ОС в нейтрофилах больных с ВП отмечено активное расходование SH-содержащих неферментативных антиоксидантов и снижение активности основного фермента АОЗ - глутатионпероксидазы. Это можно рассматривать как следствие дизрегуляции механизмов, участвующих в поддержании необходимого уровня восстановленных эквивалентов, усиленно расходуемых в условиях ОС. Учитывая приведенные выше данные о выраженной активации процессов ПОЛ в плазме крови на фоне повышенной продукции АФК нейтрофилами, дисбаланс ТДС вносит весомый вклад в формирование ОС в организме при ВП.
![Патофизиологические аспекты влияния стресса, предшествующего смерти, на активность цитомединов почек и надпочечников [Электронный ресурс]](/i/i/4440/204492.png "Патофизиологические аспекты влияния стресса, предшествующего смерти, на активность цитомединов почек и надпочечников [Электронный ресурс] Кот Михаил Леонидович")
