Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Влияние стресса на живой организм 12
1.2. Метаболические процессы в пульпе зуба 17
1.3. Реакция пульпы зуба на стресс 21
1.4. Защитные системы пульпы зуба 23
ГЛАВА II. Материалы и методы
2.1. Объект и объём исследования 41
2.1.1. Экспериментальные животные 41
2.1.2. Цитопротекторные препараты 42
2.2. Методы работы с экспериментальными животными 44
2.2.1. Моделирование стресса 44
2.2.2. Введение ингибитора у-бутиробетаингидроксилазы 45
2.2.3. Введение фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера»
2.3. Подготовка материала для исследования 46
2.4. Биохимические методы исследования
2.4.1. Определение активности лактатдегидрогеназы 48
2.4.2. Определение активности малатдегидрогеназы 48
2.4.3. Определение активности супероксиддисмутазы 49
2.4.4. Определение активности глутатионпероксидазы 51
2.4.5. Определение активности щелочной фосфатазы 52
2.4.6. Определение ТБК-активных продуктов перекисного окисления липидов 53
2.4.7. Количественное определение интерлейкина-6 54
2.4.8. Количественное определение интерлейкина-ір 56
2.4.9. Количественное определение эндотелина-1 57
2.4.10. Количественное определение растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия 58 2.4.11. Количественное определение а-дефензинов 59
2.4.12. Количественное определение аннексина V.. 60
2.4.13. Количественное определение фактора некроза опухоли -а 61
2.4.14. Определение содержания кортизола в сыворотке крови крыс 62
2.5. Статистическая обработка результатов эксперимента 63
Результаты собственных исследований
ГЛАВА III. Влияние эмоционально-холодового стресса на метаболические процессы и защитные системы пульпы зубов крыс
3.1. Оценка стресс реакций у крыс, подвергнутых эмоционально холодовому стрессу 64
3.2. Влияние эмоционально-холодового стресса на окислительно-восстановительные процессы в пульпе зубов крыс 69
3.3. Влияние эмоционально-холодового стресса на активность свободно-радикального окисления в пульпе зубов крыс 71
3.4. Исследование содержания цитокинов в пульпе зубов крыс при -эмоционально-холодовом стрессе 73
3.5. Исследование содержания белков сосудистого эндотелия в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе 75
3.6. Исследование в пульпе зубов крыс белков, участвующих в фосфорно-кальциевом обмене 77
ГЛАВА IV. Исследование метаболических процессов при нарушении транспорта жирных кислот в пульпе зубов крыс на фоне эмоционально-холодового стресса
4.1. Оценка стресс реакций у опытных крыс на фоне введения ингибитора у-бутиробетаингидроксилазы 80
4.2. Влияние ингибирования синтеза карнитина на окислительно восстановительные процессы в пульпе зубов крыс, подвергнутых
эмоционально-холодовому стрессу 86
ГЛАВА V. Исследование влияния фитопрепаратов на метаболические процессы в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе
5.1. Оценка стресс реакций у опытных крыс на фоне введения фитопрепарата «Болюсы Хуато» 91
5.2. Влияние фитопрепарата «Болюсы Хуато» на метаболические процессы в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе 95
5.3. Оценка стресс реакций у опытных крыс на фоне введения фитопрепарата «Коронатера» 98
5.4. Влияние фитопрепарата «Коронатера» на метаболические процессы в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе 102
ГЛАВА VI. Обсуждение результатов исследования 106
Заключение. Схема метаболических изменений в пульпе зубов крыс, подвергнутых эмоционально холодовому стрессу выводы 123
Практические рекомендации 124
Список литературы
- Метаболические процессы в пульпе зуба
- Методы работы с экспериментальными животными
- Влияние эмоционально-холодового стресса на окислительно-восстановительные процессы в пульпе зубов крыс
- Оценка стресс реакций у опытных крыс на фоне введения фитопрепарата «Коронатера»
Введение к работе
Актуальность исследования
Большинство стоматологов в своей практике уделяют особое внимание стрессорным воздействиям, которые на сегодняшний день играют центральную роль в патогенезе заболеваний зубочелюстной системы.
Клинические наблюдения за людьми, работающими в экстремальных условиях или определенных зонах риска, в том числе за полярниками антарктических экспедиций, моряками дальнего плавания, авиаторами и другим контингентом, показали, что кариозные и некариозные поражения зубов, деструктивные изменения в тканях пародонта встречаются у них в два раза чаще по сравнению с людьми, работающими в обычных условиях (Ярошенко А.И., Голубев В.Г, 1973; Manhold J.N., 1979; Viltsek Е., 1978; Сирота Г.И. с соавт., 1989; Федоров Ю.А., Дрожжина В.А., 1997; Тарасенко Л.М., 2002; Hand G.A. et al., 2003; Краснова В.В., 2005; Белоклицкая Г.Ф., 2007; Соловьева - Савоярова Г.Е., 2008).
Установлено, что стрессорные стимулы влияют на устойчивость к болезням путём одновременной активации всех сигналов, исходящих из центральной нервной системы, что осуществляется сетью сложных ответов эндокринной и иммунной систем (Судаков К.В., 1996; Melmed S., 2001). Стресс является, прежде всего, адаптивной реакцией и способствует восстановлению гомеостаза, но при длительном его протекании он может вызывать метаболические изменения во всех тканях организма, активировать свободнорадикальные процессы, что приводит к нарушению структуры и функции клеток (Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988; Девяткина Т.А., 1990; Горецкий О.С. с соавт., 1992; Sternberg Е.М., et al., 1992; McEwen B.S., 1998; ИлюхаВ.А.,2003).
Л j
>1 '
(і
4 Действие стресс-факторов на ткани полости рта исследователи чаще
связывают с изменениями количественного и качественного состава белков
смешанной слюны, что способствует, по их мнению, деминерализации
твердых тканей зубов (Кузнецов П.А., 2000; Кузьмина ЭМ. с соавт., 2001;
Тарасенко Л.М. с соавт., 2002). Однако, причины декальцинации твёрдых
тканей зубов могут быть связаны как с угнетением защитных свойств слюны,
так и с функциональным состоянием клеток пульпы зуба, обеспечивающих
трофику твёрдых тканей.
Влияние эмоционально- Холодовых нагрузок на пульпу зуба не изучено,
поэтому настоящее исследование является актуальным не только для
теоретической, но и практической стоматологии.
Цель настоящего исследования;
Оценить в эксперименте влияние эмоционально-холодового стресса
различной продолжительности на метаболические процессы в пульпе зуба и
выявить реакцию пульпы на применение стресспротекторов растительного
происхождения.
Задачи исследования:
-
Изучить активность ферментов лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и щелочной фосфатазы локализованных в различных органеллах клеток пульпы зубов крыс, определить содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой при остром и хроническом эмоционально-холодовом стрессе.
-
Определить уровень отдельных белков - эндотелина-1, интерлейкинов -1р и -6, аннексина V, растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия, а-дефензинов и фактора некроза опухоли - а в пульпе зубов крыс при эмоционально-холодовом стрессе различной продолжительности.
-
На основании полученных данных охарактеризовать энергетический обмен, состояние системы антиоксидантная защита - перекисное окисление
5 липидов, фосфорно-кальциевый обмен и сосудистую реакцию
пульпы зубов крыс, подвергшихся эмоционально-холодовому стрессу.
-
Сопоставить метаболические изменения в пульпе зубов крыс при краткосрочном и длительном эмоционально-холодовом стрессе.
-
Исследовать изменения в активности ферментов пульпы зубов крыс при стрессе в условиях ингибирования синтеза карнитина.
-
Выявить реакцию пульпы зуба в ответ на введение стресспротекторов при эмоционально-холодовом стрессе.
Научная новизна
Впервые в эксперименте выявлены сдвиги в метаболических процессах в пульпе зубов крыс, находящихся в состоянии острого и хронического стресса.
Впервые в пульпе зубов крыс использованы методы определения аннексина V, а-дефензинов и продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой.
Впервые предложена гипотеза возможного механизма нарушения целостности твёрдых тканей зуба, обусловленного изменением трофики пульпы зуба в ответ на стресс. Впервые для оценки фосфорно-кальциевого обмена в пульпе зуба было применено определение содержания аннексина V.
Впервые исследована реакция пульпы на стресс в условиях введения стресспротекторных фитопрепаратов и показана роль Р-окисления жирных кислот в пульпе зубов в развитии стресс - реакции. Практическая значимость работы
Холодовой психоэмоциональный стресс, которому подвергался организм крыс, вызывает реакцию со стороны клеток пульпы зуба. Экспериментальные исследования показали, что применение фитопрепаратов на длительных сроках стресса оказывает положительный эффект на метаболизм клеток пульпы зубов крыс, а введение ингибитора синтеза карнитина, напротив, негативно сказывается на их течении.
6 Положения, выносимые на защиту:
-
Клетки пульпы зубов крыс реагируют на эмоционально - эмоционально-холодовой стресс различной продолжительности, которому подвергается организм животного, что выражается в изменении их метаболизма.
-
Ингибирование транспорта жирных кислот в матрикс митохондрий при эмоционально-холодовом стрессе негативно влияет на обменные процессы в пульпе зубов крыс и активирует свободно-радикальное окисление.
-
Введение стресспротекторных фитопрепаратов «Болюсы Хуато» и «Коронатера» оказывает положительный эффект на течение метаболических процессов в клетках пульпы зуба при стрессе.
Внедрение результатов исследования
Полученные данные использованы в лекционном курсе кафедр факультетской терапевтической стоматологии, биохимии, нормальной физиологии МГМСУ. Личный вклад
Автором лично выполнена экспериментальная работа на 230 беспородных белых крысах. В ходе сбора и исследования материала соискателем освоены и использованы современные биохимические методы: иммуноферментный анализ и спектрофотометрия. Полученные результаты статистически обработаны и представлены в виде таблиц и графиков. Апробация работы
Результаты исследования докладывались на 54-ой итоговой студенческой научной конференции МГМСУ с международным участием (Москва, 2005), научно-практической конференции МГМСУ «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в ВУЗе», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.И. Фалина (Москва, 2007), на 8-ом Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», РУДН (Москва, 2007), на межкафедральном заседании кафедр факультетской
7
терапевтической стоматологии, нормальной физиологии, биохимии
МГМСУ, октябрь 2008 г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 1 монография и 4 публикации - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Объём и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 237 источников, из них 72 отечественных и 165 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 4 рисунками.
Метаболические процессы в пульпе зуба
Иммуногистохимический анализ иммунокомпетентных клеток пульпы зубов крыс показал, что в крысиной пульпе содержатся молекулы CD4+, CD5+ и CD8+ Т-лимфоцитов и CD8+ Т-клетки незначительно превосходят числом CD4+ Т-клетки (Okiji Т., et al., 1992). Воздействие на пульпу зуба высоких температур приводит к увеличению митотической активности Т-лимфоцитов (Yoshida Н., et al., 1995).
За гуморальный иммунитет отвечают В-лимфоциты, которые способны распознавать и связывать растворимые антигены белковой, полисахаридной и липопротеиновой природы. В-лимфоциты несут часть поверхностных маркеров, общих с другими клетками: это рецепторы для иммуноглобулинов (FcR), компонентов комплемента (CR1) и антигенов гистосовместимости (МНС 1 и 2 классов).
Ряд исследователей пытались идентифицировать В-лимфоциты в интактной пульпе зуба человека с помощью иммуногистохимических методов с использованием антисывороток против иммуноглобулинов (Pulver W.H., et al., 1977; Pekovic D.D., Fillery E.D. 1984) или моноклональных антител против В-лимфоцитов (Jontell М., et al., 1987; Mangkornkarn С, et al., 1991; Sakamoto M., Sanjo D., 1992), но не обнаружили их. Вместе с тем, другие исследователи выявили единичное количество В-лимфоцитов в центральном слое пульпы зуба (Sakurai К., et al., 1996; Hahn C-L., et al., 1989).
Активированные формы В-лимфоцитов - плазматические клетки вырабатывают специфические для данного антигена иммуноглобулины (Sakurai К., et al., 1996). Активация В-лимфоцитов антигеном происходит при участии интерлейкина 4 (IL-4), затем они пролиферируют в ответ на интерлейкин 5 (IL-5) и превращаются в плазматические клетки под действием интерлейкина 6 (IL-6) (Bona С, Bonilla F., 1996).
Макрофаги. Помимо лимфоцитов в пульпе зуба присутствуют макрофаги и их предшественники (моноциты, промоноциты и монобласты), которые образуют систему мононуклеарных фагоцитов, имеющих много общих функций с нейтрофилами. Макрофаги могут иметь различную форму от овальной до дендритоподобной. В состоянии покоя макрофаги приобретают удлинённую форму и располагаются вдоль сосудов и тел одонтобластов, поэтому при микроскопическом исследовании их часто путают с фибробластами. Макрофаги содержат ферменты для расщепления чужеродных полимеров и участвуют в фагоцитозе погибших клеток или компонентов межклеточного вещества. Активированные макрофаги также принимают участие в восстановлении целостности ткани пульпы и её сосудистого русла (Polverini P.I., 1995).
В развивающемся зубе макрофаги концентрируются в области дифференцировки верхушки зубного сосочка. В зрелой же пульпе большое количество макрофагов локализуется в центральном слое (Быков В.Л., 1999; Avery I.K., 1976; Seltzer S., Bender LB., 1984), и с возрастом их численность уменьшается (Гемонов В.В., Лаврова Э.М., 2002). При патологии пульпы зуба число макрофагов намного меньше по сравнению с количеством активированных дендритных клеток (Inaba К., et al., 1993).
В пульпе зубов человека макрофаги способны индуцировать маркеры зрелых моноцитов (Leu МЗ (CD 14), Leu М5 (CD1 lc), CD68,) лейкоцитарные антигены (HLA-DQ, HLA-DR) и активировать XIII фактор (фибрин-стабилизирующий фактор) (Jontell М., et al., 1987; Okiji Т., et al., 1997). Фактор XIII (фибринстабилизирующий фактор, фибриназа, фактор Лаки — Лоранда) - а2-гликопротеин, с молекулярной массой 300—340 кДа. Помимо пульпы, он определяется в сосудистой стенке, тромбоцитах, эритроцитах, почках, легких, мышцах, плаценте. Фактор XIII под влиянием тромбина превращается в активную форму (ХШа). Образовавшиеся в присутствии фибриназы тромбы очень медленно подвергаются распаду. В том случае, когда активность фактора XIII снижена, фибриновые сгустки очень быстро распадаются, уменьшается адгезия клеток и агрегация тромбоцитов. Напротив, при повышении активности фибриназы агрегационные свойства тромбоцитов повышаются (Jontell М., Bergenholtz G., 1992).
Дендритные клетки в пульпе зуба активируются в ответ на воздействие различных бактериальных токсинов и вирусов. Дендритные клетки не в состоянии различать род антигенов, попадающих в пульпу, однако они активируют Т-лимфоциты, которые организуют другие иммунокомпетентные клетки к действию против чужеродных антигенов. Количество дендритных клеток в интактной пульпе составляет 13 % от общего числа иммунокомпетентных клеток пульпы зуба (Быков В.Л., 1999).
В отличие от других антиген-представляющих клеток, дендритные клетки значительно более активны, чем макрофаги и В-клетки в индукции первичного иммунного ответа. Захват антигена дендритными клетками чаще всего происходит вне лимфоидных органов. После этого они мигрируют в лимфоидные образования, где происходит их контакт с Т-лимфоцитами и развитие дальнейших событий иммунного ответа (Eklof С, et al.,1992). Дендритные клетки обладают антигеном МНС I класса, необходимого для представления антигена CD8+ цитотоксическому Т-лимфоциту. Поэтому они являются также инициаторами цитотоксических реакций.
Зрелые дендритные клетки локализуются в центральной и корневой части пульпы зуба. От их тела отходит множество отростков, а в цитоплазме содержится большое количество лизосом и пиноцитозных пузырьков. Своими разветвлёнными отростками они опутывают одонтобластический слой в виде сети (Jontell М., et al., 1988; Okiji Т., et al., 1992). Отростки этих клеток также связаны с клетками эндотелия сосудов пульпы (Ohshima Н., et al., 1994). Очень похожее взаимодействие дендритных клеток с кровеносными капиллярами обнаружено в кожных покровах, потовых и сальных железах (Sontheimer R.D. 1989; Sontheimer R.D., et al., 1989).
Методы работы с экспериментальными животными
Для определения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) использовались стандартные наборы реактивов фирмы "Human ", Германия. Активность этого фермента в супернатанте пульпы определяли по «модифицированному методу», согласно рекомендациям Скандинавского Комитета по ферментам (SCE) (1972). Метод определения активности лактатдегидрогеназы основан на ее способности катализировать восстановление пирувата до лактата с одновременным окислением НАДН до НАД ". Уменьшение оптической плотности раствора прямо пропорционально активности ЛДГ в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 340 нм.
Лактат+ НАД+ Пируват + НАДН лактатдегидрогеназа Реакцию проводили в термостатируемых кюветах фотометра при температуре 37С. В инкубационную смесь, состоящую из 1000 мкл 50 мМ трис-HCl буфера, рН 7,4, содержащего 1,5 ммоль/л пирувата, добавляли по 10 мкл образца. В пробы добавляли по 250 мкл буфера, содержащего 0,8 ммоль/л НАДН, тщательно их перемешивали и измеряли поглощение проб при 340 нм ровно через 1 минуту. Затем повторяли измерения 3 раза с интервалом в 1 минуту. Вычисляли среднее значение изменения оптической плотности за 1 минуту (АА/мин) и рассчитывали активность ЛДГ по формуле:
Активность ЛДГ = 20000 АА34о/мин Активность ЛДГ рассчитывали в единицах на 1 г ткани (ммоль/ минт ткани)
Активность малатдегидрогеназы (МДГ, КФ. 1.1.1.37) определяли спектрофотометрически по изменению поглощения при 340 нм при образовании НАДН. Реакцию проводили в термостатируемых кюветах фотометра, начиная ее добавлением раствора НАД1" и регистрируя изменение поглощения в течение 3 минут после начала реакции. В контрольную кювету вместо раствора кофермента добавляли равный объем буфера (Кочетов Г.А., 1980).
Реакционная смесь для определения активности МДГ включала следующие компоненты: 2,7 мл 0,088 М глицинового буфера (рН=10,0), 0,1мл 0,085 М раствора малата натрия в буфере, 0,1мл 0,025 М раствора НАД4" в буфере и 0,1 мл гомогената пульпы. Определение общей активности МДГ производили по формуле: ДА34о х V Е= , где t х 6,22 А Аз4о - изменение поглощения при 340 нм, V - объем кюветы, t- время реакции, 6,22 - коэффициент молярной экстинкции НАД.
За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое катализирует образование 1 ммоль НАДН в 1 мин. Активность МДГ рассчитывали в единицах на 1 г ткани (ммоль/ минт ткани).
Определение активности супероксиддисмутазы Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1.) использовались стандартные наборы реактивов RANSOD фирмы "Randox", Великобритания.
Активность этого фермента в супернатанте пульпы определяли по методу Beauchamp С, Fridovich I. (1981). Метод определения активности СОД основан на ее способности превращать супероксидный анион-радикал
(О]), образующийся в ксантиноксидазной реакции. В ходе ксантиноксидазной реакции супероксидный анион-радикал окисляет краситель хлорид 2-(4-иодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия (нитросиний тетразолий, НСТ) до диформазана, окрашивающего реакционную смесь в розовый цвет. Степень поглощения окрашенного раствора при 505 нм прямо пропорциональна количеству образовавшегося супероксида и измеряется фотометрически. Под действием СОД количество супероксида уменьшается, следовательно, снижается количество диформазана и поглощение окрашенного раствора. За единицу активности СОД принимают такое ее количество, которое ингибирует образование диформазана на 50%.
Инкубационная смесь состояла из 850 мкл 50 мМ карбонатно-фосфатного буфера (рН= 10,2), содержащего 80 Е/мл ЭДТА, 0,05 ммоль/л ксантина, 0,025 ммоль/л НСТ, и 25 мкл разведенного образца. Реакцию начинали добавлением 125 мкл раствора ксантиноксидазы (80 Е/л) при температуре 37С в термостатируемой кювете фотометра LabSystems. Изменение оптической плотности регистрировали против воздуха при 505 нм через 30 секунд (Ai), затем через 3 минуты (А2).
Для определения активности СОД строили калибровочную кривую. Для этого стандартный раствор СОД разбавляли дистиллированной водой в соответствии со следующей таблицей 2.4.:
В кюветы вносили 850 мкл смешанного субстрата, добавляли по 25 мкл растворов стандартов и образцов, и тщательно перемешивали. Затем в каждую кювету приливали по 125 мкл раствора ксантиноксидазы. Через 30 секунд измеряли начальное поглощение пробы при 505 нм, а еще через 3 минуты - окончательное. Для расчета использовали изменение поглощения пробы за 1 минуту: АА=(А2-А]):3, где А] - начальное поглощение, Аг -поглощение, измеренное через 3 минуты. Затем для стандартов и образца рассчитывали процент ингибирования (%ИНг):
По результатам расчетов строили калибровочную кривую, откладывая на оси абсцисс процент ингибирования, на оси ординат - десятичного логарифма активности СОД в стандартах. По калибровочной кривой определяли активность СОД в образце. Процент ингибирования образцом реакции окисления НСТ должен был составлять 30 - 60% (линейность метода). Для получения окончательного результата активность СОД в пробе умножали на коэффициент разведения. Активность СОД рассчитывали в единицах на 1 г ткани (мкмоль/минт ткани). 2.4.4. Определение активности глутатионпероксидазы Для определения активности глутатионпероксидазы (ГПО, КФ 1.11.1.9) использовались стандартные наборы реактивов RANSEL фирмы "Randox", Великобритания. Активность этого фермента в супернатанте пульпы определяли по методу Paglia, Valentine (1983). В основе этого метода лежит регистрация окисления НАДФН в реакции, катализируемой глутатионредуктазой (ГР). Под действием ГПО происходит окисление глутатиона перекисью кумина. Окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой в присутствии восстановленного НАДФН. Фотометрически регистрируемое уменьшение оптической плотности при 340 нм, обусловленное окислением НАДФН, прямо пропорционально активности ГПО.
Влияние эмоционально-холодового стресса на окислительно-восстановительные процессы в пульпе зубов крыс
Под влиянием острого стресса, который вызывали однократным погружением на 10 минут крыс в холодную воду происходило повышение количества ИЛ-10, однако это повышение недостоверно, а выявлялась только тенденция (р 0,05). Также при остром стрессе выявлялось незначительное повышение содержания ИЛ-6 (р 0,5).
К 4-му дню эксперимента наблюдалась тенденция к снижению количества ИЛ-lp по сравнению с значениями острого стресса (р 0,05), но не выявлено отличий по отношению к контрольной группе животных (р 0,5).
При значительном стрессорном воздействии сохранялось некоторое понижение в содержании ИЛ-1 (3 в пульпе зуба, но оно было недостоверно по отношению как к значениям в контрольной группе (р 0,5), так и стресса, продолжающегося 4 дня (р 0,1) и достоверно было снижено по сравнению с острым стрессом (р 0,05).
Если длительный эмоционально-холодовой стресс в течение 4 и 30 дней сопровождался некоторым, в среднем на 10-15% снижением количества ИЛ-1(3, то содержание другого цитокина ИЛ-6 достоверно увеличивалось. При 4-х дневном стрессе количество ИЛ-6 росло почти в 3 раза (р 0,05), а при стрессе, продолжительность которого составляла 30 дней в 2 раза (р 0,05). Вместе с тем, отмечаемое снижение количества ИЛ-6 на 30 день было недостоверным по сравнению с данными 4-х дневного эксперимента и содержание этого цитокина было достоверно выше по отношению к данным, полученным при остром стрессе (р 0,05).
Определение количества фактора некроза опухоли - а выявило, что как при остром стрессе, так и при хроническом, то есть во все сроки эксперимента содержание этого цитокина достоверно снижалось (р 0,05) по отношению к данным контрольной группы и это снижение не зависело от продолжительности опыта.
Таким образом, холодовое воздействие на организм крыс, приводящее к развитию стресса, сопровождается количественными изменениями в содержании цитокинов. При остром стрессе имеется тенденция к увеличению количества ИЛ-ір и снижение количества ФНО-а. При более длительном стрессорном воздействии в пульпе зубов достоверно растёт количество ИЛ-6 и снижается содержание ФНО-а..
О реакции сосудистого эндотелия на стресс мы судили по количественному содержанию эндотелина (ЭТ-1) и растворимой формы белка адгезии сосудистого эндотелия (sVCAM-1). В наших исследованиях не было выявлено содержания sVCAM-І, как в пульпе зубов интактных крыс, так и у опытных животных. Данные о содержании ЭТ-1 во все сроки эксперимента представлены в таблице 3.9.
Содержание ЭТ-1 в пульпе зубов крыс, подвергнутых острому стрессу, имело тенденцию к повышению по отношению к значениям контрольной группы. На 4-ый день эксперимента содержание ЭТ-1 также несколько повышено (р 0,1), но не отличалось достоверно от показателей контрольной группы. На фоне длительного стресса отмечено достоверное (р 0,05) снижение этого белка, не только по сравнению с интактными крысами, но и при сопоставлении с более короткими сроками стрессорного воздействия.
Реакция эндотелия тесно связана с миграцией лейкоцитов. Исследователями отмечено, что на фоне стресса возрастает лейкоцитарная активность (O Connor Т.М., et al., 2000) , поэтому исследование содержания белков, отражающих накопление этих клеток в сосудистом русле, может являться важным прогностическим критерием реакционной способности сосудов пульпы зуба в ответ на стресс. Такими белками являются а-дефензины. Данные о содержании а-дефензинов представлены в таблице 3.10.
При исследовании содержания а-дефензинов, которые синтезируются нейтрофилами, нами был отмечено увеличение на 10% содержания этого белка на фоне острого стресса, но это повышение было недостоверным (р 0,5).
Достоверность различий Р.-2 0,5Р3.4 0,05Р5-б 0,01 Р2-4 0,05Р4-б 0,001Р2-б 0,001 К 4-му дню эксперимента определялась тенденция к увеличению содержание а-дефензинов, как по сравнению с острым стрессом, так по отношению к значениям контрольной группы. Однако, на 30-ый день опыта содержание а-дефензинов растёт в 2,5 раза по сравнению со значениями интактных животных и в 1,5 раза по сравнению со значениями у животных, подвергнутых острому и 4-х дневному стрессу (р 0,01).
Состояние клеток и трофическая функция пульпы зуба определяется белками, участвующими в накоплении ионов кальция и фосфора, поэтому, мы исследовали содержание кальций-связывающего белка аннексина V (AHV) И щелочной фосфатазы. Данные представлены в таблицах 3.11. и 3.12.
Согласно нашим данным краткосрочное стрессорное воздействие вызывало достоверное повышение (р 0,05) содержания AHV В пульпе зубов крыс, которое сохранялось и при 4-х дневном воздействии (р 0,05). На фоне длительного стресса содержание AHV было достоверно (р 0,05) ниже по сравнению со значениями контрольных животных, а также достоверно (р 0,05) ниже по отношению к показателям опытных крыс острого и 4-х дневного стресса.
Процессы минерализации происходят не только при накоплении кальция, но и неорганического фосфата. Щелочная фосфатаза отщепляет фосфатные группы от других белков, благодаря чему увеличивается локальная концентрация фосфатов (Пикалюк B.C., Мостовой CO., 2006). Данные об активности ЩФ представлены в таблице 3.12.
В пульпе зуба достаточно активна щелочная фосфатаза, синтез которой считается одним из самых характерных свойств одонтобластов. Значительное увеличение количества ЩФ наблюдается при развитии зуба и связано с высокой интенсивностью дентиногенеза.
Активность щелочной фосфатазы (мкмоль/минт ткани) в пульпе зубов крыс, подвергнутых эмоционально-холодовому стрессу различной продолжительности (М±т) Вариант опыта п Группы Контрольная Опытная Острый стресс 10 892±34,6 (1) 978±53,5 (2) 4 дня 10 950±119(3) 350±65,1 (4) 30 дней 10 955±87,2 (5) 286±80,0 (6) Достоверность различий Pl-2 0,1Р3-4 0,001Р5-б 0,001 Р2-4 0,001Р4-б 0,1Р2-б 0,001 Наши данные показали, что активность щелочной фосфатазы в пульпе зубов крыс при остром стрессе слегка повышается, но практически не отличается от данных в контрольной группе (р 0,1), а к 4-му и 30-му дню отмечено снижение активности исследованного фермента в 2-3 раза по сравнению с интактными животными и показателями острого стресса.
На фоне длительного 30-ти дневного стресса происходит ещё большее понижение активности этого фермента в 3,3 раза по отношению к контролю (р 0,001) и в 1,2 раза к показателям 4-х дневного стресса (р 0Д).
Таким образом, стрессорные воздействия оказывают значительное влияние на метаболические процессы в пульпе зубов крыс, что отражается изменениями в количественном содержании исследованных белков.
Оценка стресс реакций у опытных крыс на фоне введения фитопрепарата «Коронатера»
Аннексии V (calphobindin I) кальций-зависимый мембранный белок с молекулярной массой 34 кД. В его структуре имеются 10 кальций-связывающих участков, в которых находятся остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот. Являясь гидрофильным белком Аннексии V обратимо связывается с отрицательно заряженными фосфолипидами, в частности с фосфатидилсерином. В структуре молекулы аннексина V имеется центральная пора и при внутриклеточном окислении и гиперполяризации клеточной мембраны этот белок способен встраивается в гидрофобный слой клеточной мембраны (Brisson A, et al., 1991). Аннексии V, блокируя кальциевые каналы, он обеспечивает накопление Са2+ внутри клетки (Berendes R., et al., 1993). Кроме того, аннексии V, прикрепляясь к поверхности клеточной мембраны, может задерживать апоптоз клеток.
Нами было установлено повышение содержания аннексина V на фоне острого и 4-х дневного стресса, тогда как к 30 дню эксперимента количество этого белка снижалось. Активация этого белка отмечена при наличии большого числа гидроперекисей во внутриклеточном пространстве (Concha N.O., et al., 1993), что может наблюдаться при высокой активности СОД и отсутствии активности ГПО в пульпе зуба.
Аннексии V активируется на клеточной мембране только при рН 4,0 -4,6., при нейтральной рН среды его активация не происходит (Beermann В., et al., 1998). Закисление среды в клетке при стрессе возможно связано с накоплением органических кислот, в частности, лактата. Об этом свидетельствует выявленная нами высокая активность гликолитического фермента ЛДГ.
Наши данные подтверждаются результатами, полученными при исследовании содержания аннексина V на клеточных культурах эндотелия сосудов, эпителия, подвергшихся гипоксическому, гипероксидативному и термическому стрессу. Установлено, что стресс приводит к повышению содержания этого белка, который участвует в урегулировании сдвигов в окислительно-восстановительных процессах внутри клетки (Denko N., et al., 2000).
Процессы минерализации происходят при участии щелочной фосфатазы. В пульпе зуба достаточно активна щелочная фосфатаза, синтез которой считается одним из самых характерных свойств одонтобластов. Значительное увеличение количества ЩФ наблюдается при развитии зуба и связано с высокой интенсивностью дентиногенеза. Наши данные показали, что активность щелочной фосфатазы в пульпе зубов крыс при остром стрессе фактически не меняется, а к 4-му и 30-му дню отмечено снижение активности исследованного фермента в 2 -3 раза.
На основании полученных данных об активности щелочной фосфатазы и содержании аннексина V можно предположить, что на фоне стресса может снижаться локальное содержание кальция и фосфора, что приведёт к ингибированию образования вторичного дентина, а в дальнейшем к патологии твёрдых тканей зуба.
О реакции сосудистого эндотелия на стресс мы судили по количественному содержанию эндотелина (ЭТ-1) и растворимого белка адгезии сосудистого эндотелия (sVCAM-1). В наших исследованиях не было выявлено содержания sVCAM-І не только в пульпе зубов интактных крыс, но и опытных животных. То есть, стресс не вызывает активацию sVCAM-1, который содержится в эндотелиальных клетках в неактивной форме и активируется только при их стимуляции.
Сосудистый эндотелий активно участвует в формировании системных гемодинамических реакций и регулирует местный сосудистый тонус. Функциональная перестройка эндотелия при воздействии стрессорных факторов заключается в изменении сбалансированной секреции веществ, регулирующих тонус сосудов (Лупинская З.А., 2003). К таким веществам относят эндотелии-1, который является самым мощным из известных вазоактивных эндотелиальных факторов с констрикторными свойствами (Патарая С.А., 2000, Гомазков О.А., 2001).
Основными активаторами синтеза эндотелина-1 в организме являются гипоксия, ишемия, острый стресс (Willey К.Е. Davenport А.Р., 2001). Эти факторы активируют транскрипцию иРНК, синтез предшественников эндотелина, превращение их в эндотелии-1 и его секрецию за несколько минут (Патарая С.А.. с соавт., 2000). Экспрессию препроЕТ-1 и высвобождение активного пептида стимулируют различные гуморальные (ангиотензин II, интерлейкин-1, адреналин, норадреналин, ФНО-а, вазопрессин, тромбин, ионы кальция и др.) и физические (гипоксия, стресс) факторы (Rothermund L., et al., 2000). Существуют доказательства, что ЕТ-1 играет важную роль в процессах апоптоза клеток (Stefanec Т., 2000). Физиологическим антагонистом ЕТ-1 является оксид азота (Vatter Н., et al., 2005).
В условиях острого стресса наблюдалось тенденция к увеличению уровня эндотелина-1. Увеличение уровня эндотелина-1 при остром стрессе свидетельствует об его участии в повышении периферического сосудистого тонуса (Курицын С.Н., 2007). Это, возможно, связано со снижением концентрации активных эндотелиновых рецепторов в эндотелии кровеносных сосудов при их блокаде в ответ на стресс, что приводит к увеличению концентрации соответствующего агониста (Seneri G.G., et al., 2000). Через 4 дня эксперимента содержание ЕТ-1 в пульпе зубов крыс остаётся повышенным, но оно несколько ниже, чем в первый срок эксперимента и практически не отличается от значений в контрольной группе. К 30 дню опыта наблюдается достоверное снижение этого пептида. Доказано, что в низких концентрациях ЕТ-1 оказывает вазодилатирующее влияние, а в высоких - опосредует вазоконстрикторное действие, а также проявляет митогенный эффект в отношении фибробластов и гладко-мышечных клеток
