Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Особенности повреждения печени ксенобиотиками 10
1.2. Гепатопротекторные средства 19
1.3. Краткие сведения об исследуемом лекарственном средстве - «Гепатон»
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
Глава 3. Изучение фармакологической активности «Гепатона»
3.1. Изучение мембраностабилизирующего действия «Гепатона»
3.2. Изучение антиоксидантной активности «Гепатона» 49
3.2.1. Сравнительное исследование антиоксидантной активности отваров компонентов исходного сбора и сухих экстрактов, входящих в состав «Гепатона»
3.2.2. Изучение влияния «Гепатона» на активность ферментов антиоксидантной защиты организма
3.2.3. Изучение влияния «Гепатона» на кинетику Fe 2+ -индуцированной хемилюминесценции
3.3. Изучение противовоспалительной активности «Гепатона»
3.3.1. Изучение антиэкссудативной активности «Гепатона»
3.3.2. Изучение влияния «Гепатона» на процессы альтерации и регенерации в очаге воспаления
3.3.3. Изучение влияния «Гепатона» на пролифератив- ную фазу воспалительного процесса
3.3.4. Изучение противовоспалительной активности «Гепатона» при экспериментальном перитоните
3.4. Изучение влияния «Гепатона» на проницаемость сосудов
3.5. Изучение влияния «Гепатона» на функциональное состояние печени у белых крыс
3.6. Изучение антибактериальной активности «Гепатона»
3.7 Изучение иммуномодулирующей активности «Гепатона»
3.8. Изучение влияния «Гепатона» на морфологический состав периферической крови и систему гемостаза
3.9. Изучение влияния «Гепатона» на функциональное состояние мочевыделительной системы
3.10. Изучение влияния «Гепатона» на функциональное состояние центральной нервной системы
3.10.1. Влияние «Гепатона» на поведенческие показатели в тесте «открытое поле» у интактных крыс
3.10.2. Влияние «Гепатона» на выработку условной реакции пассивного избегания у интактных крыс
3.10.3. Оценка противосудорожной активности «Гепатона»
Глава 4. Фармакотерапевтическая эффективность «Гепатона» при экспериментальных повреждениях печени крыс
4.1. Фармакотерапевтическая эффективность «Гепатона» при остром токсическом повреждении печени крыс четыреххлористым углеродом
4.2. Изучение влияния «Гепатона» на течение апоптотического процесса в гепатоцитах при остром токсическом тетрахлорметановом гепатите у крыс
4.3. Изучение антистрессорного действия «Гепатона» 90
Глава 5. Обсуждение результатов 97
Заключение
Выводы 112
Практические рекомендации 113
Литература 114
- Гепатопротекторные средства
- Изучение антиоксидантной активности «Гепатона»
- Изучение влияния «Гепатона» на функциональное состояние печени у белых крыс
- Изучение влияния «Гепатона» на течение апоптотического процесса в гепатоцитах при остром токсическом тетрахлорметановом гепатите у крыс
Введение к работе
Актуальность темы
Значимость изучения проблемы заболеваний печени инфекционной и неинфекционной природы обусловлена их широкой распространенностью, ростом инфицирования лиц молодого возраста (Чередниченко и соавт., 2007), хронизацией, прогрессирующим течением, тяжелыми осложнениями, инва-лидизацией (Подымова, 2005; Bjornsson, Olsson, 2005; Маевская, 2006; Ло-паткина, 2007; Михайлов, 2007). Распространение вирусных гепатитов в мире приобрело угрожающие масштабы. По данным ВОЗ отмечается ежегодный рост заболеваемости населения вирусными гепатитами, охватывающей более миллиарда человек, причем, только носителей антигена вирусного гепатита В насчитывается около 350 миллионов (Зайцев, 2006; Ганина и соавт., 2007; Учайкин и соавт., 2007), а вирусным гепатитом С в настоящее время поражено не менее 180 млн. населения (Ушкалова, 2003; Keefe, 2007; Zignego et. al., 2007). По прогнозам ВОЗ в ближайшие 10-20 лет вполне ощутимыми станут последствия хронического гепатита С: на 60% увеличится количество больных циррозом печени, на 68% - гепатокарциномой (Сологуб и соавт., 2006; Ершова и соавт., 2007; Ильченко, 2007; Малиновская и соавт., 2007; Ghany, Liang, 2007; Lawson et al, 2007).
В настоящее время лечение больных с острыми и хроническими заболеваниями печени, несмотря на прогресс современной гепатологии, связанный с внедрением новых методов лабораторной и инструментальной диагностики, изучением этиологии и патогенеза заболеваний печени на клеточном и молекулярном уровне, все еще остается крайне сложным и, в ряде случаев, далеким от удовлетворительного решения проблемы (Корсун, 2006; Нагоев, 2006; Bartholomeusz, Locarnini, 2006; Широкова и соавт., 2007; Ghany, Liang, 2007; Rapti et. al., 2007; Tillmann, 2007).
В связи с этим, актуальным является поиск средств, способных повышать резистентность печени к повреждающему действию токсинов и активизировать
процессы дезинтоксикации в организме (Оковитый, 2006; Родионова, 2007). Перспективными для разработки методов фармакологической коррекции заболеваний печени являются препараты природного происхождения, отличающиеся, как правило, широтой терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения без риска возникновения токсических реакций (Карлович, Ильченко, 2007; Осипова, 2005; Соколов, 2006; Шульпекова, 2006; Pradhan, Girish, 2006).
В Отделе биологически активных веществ разработано гепатопротек-торное средство, условно названное «Гепатон», состоящее из цветков ромашки аптечной {Matricaria recutita L.) - 1 часть, листьев мяты перечной {Mentha piperita L.) - 1 часть, плодов шиповника {Rosa sp.) - 3 части, плодов боярышника {Crataegus sp.) - 2 части, травы зверобоя продырявленного {Hypericum perforatum L.) - 1 часть, корней солодки уральской {Glycyrrhiza uralensis Fisch.) - 1 часть, корневищ и корней девясила высокого {Inula hele-nium L.) - 1 часть.
Целью настоящего исследования явилось определение фармакологических свойств и фармакотерапевтической эффективности комплексного гепа-топротекторного растительного средства при остром токсическом гепатите.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить основные фармакологические свойства гепатопротектор-ного растительного средства;
оценить фармакотерапевтическую эффективность «Гепатона» при повреждении печени четыреххлористым углеродом (CCL4);
выявить основные механизмы гепатопротекторного влияния указанного растительного средства.
Научная новизна
Работа представляет собой фармакологическое исследование много-
7 компонентного растительного средства «Гепатон», предназначенного для лечения и профилактики заболеваний печени. Определены основные фармакологические свойства «Гепатона». Установлено его мембраностабилизирую-щее, антиоксидантное, желчегонное, антитоксическое, противовоспалительное, антибактериальное действие. Дана комплексная оценка гепатопротек-торного влияния «Гепатона» при повреждении печени четыреххлористым углеродом. Установлено, что курсовое назначение данного растительного средства сопровождается ингибированием перекисного окисления липидов, благодаря чему предотвращаются проявления синдрома цитолиза и холеста-за. Наряду с этим, испытуемое средство стимулирует детоксицирующую функцию печени, а также способствует ускорению процессов регенерации.
Практическое значение работы
Материалы по проведенным экспериментальным исследованиям фармакологических свойств и фармакотерапевтической эффективности «Гепатона» включены в заключительный отчет Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по проекту №21.1.3. «Регуляция свободнорадикальных процессов при повреждениях органов пищеварения с использованием биологически активных веществ из арсенала традиционной медицины», утвержденной президиумом СО РАН. Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета Бурятского государственного университета. Поданы заявки на предполагаемые изобретения «Гепатопротекторное средство растительного происхождения» (№ 2006124093/15 (053802)) и на «Способ получения средства, обладающего гепатопротекторной активностью» (№ 2007153671/15(018793)).
Положения, выносимые на защиту
1. Комплексное растительное средство «Гепатон» обладает желчегонной, противовоспалительной, антибактериальной, антистрессорной активно-
8 стью и стимулирует процессы регенерации в печени.
«Гепатон» обеспечивает выраженную фармакотерапевтическую эффективность при токсическом повреждении печени четыреххлористым углеродом.
Фармакотерапевтическая эффективность «Гепатона» при повреждении печени тетрахлорметаном обусловлена выраженной мембраностабилизирую-щей, антиоксидантной, желчегонной активностью, а также способностью «Гепатона» стимулировать дезинтоксикационную функцию печени.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
IV региональной межвузовской конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2005);
научно- практической конференции «Актуальные вопросы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии», посвященной 85-летию курорта «Аршан» (Иркутск, 2005);
Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан - Удэ, 2006);
научно- практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения д.м.н. Базарона Э.Г (Улан - Удэ, 2006);.
«The Second International Symposium on Chemistry of Herbal Medicine and Mongolian Drug» (Ulaanbaatar, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований,
9 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, списка использованной литературы, включающего 235 источников, из них - 84 зарубежных авторов.
Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 31 таблицей и 7 рисунками.
Гепатопротекторные средства
В целом, ассортимент лекарственных средств, применяемых в комплексной терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей, насчитывает более 1000 наименований. Их действие направлено на восстановление го-меостаза в печени, повышение устойчивости органа к действию патогенных факторов, стимуляцию репаративно-регенераторных процессов в печени (Ушкалова, 2004; Оковитый, 2006; Карлович, Ильченко, 2007). Их применяют для патогенетической терапии острого и хронического гепатитов, цирроза печени токсической, алкогольной и вирусной этиологии (Lindor, 2003; Королева, 2005; Корсун , 2006; Лопаткина, 2007).
К сожалению, на сегодняшний день ни один из использующихся в медицинской практике гепатопротекторов не удовлетворяет в полной мере этим требованиям, хотя в последние годы арсенал современных гепатозащитных средств расширился, как за счет появления синтетических препаратов, так и новых природных средств (Минушкин, 2002; Маев и соавт., 2005; Полунина, 2006). В целом, в настоящее время, преобладающее значение имеют средства растительного происхождения (до 54%), в то время как на фосфолипидные препараты приходится 16%, а на другие средства, в том числе синтетические, органопрепараты и препараты аминокислот - 30% от общего количества "истинных" гепатозащитных препаратов.
Перспективными для разработки методов фармакологической коррекции являются препараты природного происхождения (Белобородова и соавт., 2003), отличающиеся, как правило, широтой терапевтического действия, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения без риска возникновения токсических реакций (Kala, 2002; Осипова, 2005; Степанова, 2005; Соколов, 2006; Шульпекова, 2006; Pradhan, Girish, 2006; Карлович, Ильченко, 2007).
Флавоноиды рассматриваются, в настоящее время, как один из наиболее эффективных модификаторов биологических реакций (Тюкавкина, 2002; Зенков, 2003; Кондакова и соавт, 2004). Флавоноиды реализуют свою антиок-сидантную активность с помощью нескольких механизмов. Прежде всего, они обладают антирадикальной активностью, ингибируя ОН" и 0"2, за счет наличия ОН-группы, присоединенной к ароматическому ядру (Sreejayan, 1996; Тесел-кин,1997; Агога, 1998; Silwa, 1998). Кроме того, антиокислительная активность флавоноидов связана с их способностью образовывать прочные хелатные комплексы с металлами переменной валентности, а также определяется их участием в транспорте электронов и наличием ферментмодулирующей активности (Воп-det, 1998). Внимание к соединениям этой группы обусловлено также их способностью влиять на метаболизм арахидоновой кислоты, регулировать процесс ее биотрансформации как по липооксигеназному, так и по циклооксиге-назному путям и, тем самым, воздействовать на синтез эйкозаноидов, про-стагландинов, тробоксанов - факторов, участвующих в процессе агрегации тромбоцитов и воспалении (Ohigoshi, 1988).
Гепатопротекторы по механизму действия подразделяют на несколько групп (Убеева, 2005): средства, ингибирующие перекисное окисление липидов; препараты, обладающие антигипоксической активностью; фосфолипидные препараты; препараты, усиливающие антитоксическую функцию печени путем повышения активности ее ферментных систем (в том числе цитохрома Р-450 и других микросомальных ферментов); улучшающие метаболические процессы в организме, включая витамины, аминокислоты.
Наиболее известными гепатопротекторами, принимаемыми исследователями в качестве эталона при разработке новых препаратов, являются средства, полученные из расторопши пятнистой. Действующим началом препаратов из плодов данного растения являются флаволигнаны силибинин (50%), а также изосилибинин, силихристин и силидианин, имеющие фенилхромановую структуру и обладающие в той или иной степени гепатопротекторной активностью. Близкие по составу и действию препараты производятся в разных странах под различными названиями: Carsil, Legalon, Silibene, Silimarin, Silimarit. Sefasili-marin, Silybin, Apihepar, Hepadestal и др. Силибор (Siliboram) представляет собой сумму флаволигнанов, получаемых из плодов расторопши.
Силимарин, выделенный из расторопши пятнистой уменьшает гепатоток-сичность ксенобиотиков (Мухамадиев,1994; Карлович, 2007): снижает содержание продуктов ПОЛ - диеновых коньюгатов и малонового диальдегида в го-могенатах печени, сердца, почек и легких (Олейник,1985). В эксперименте выявлено три уровня действия силимарина на печень: 1) антиоксидантное - снижение скорости образования свободных радикалов и повышение внутриклеточного содержания восстановленного глутатиона; 2) регулирующее влияние на проницаемость клеточных мембран и повышение стабильности мембран; 3) внутриядерное - повышение синтеза рибосомальной РНК, путем стимуляции ДНК-полимеразы (Valenzuela, 1994).
Изучение антиоксидантной активности «Гепатона»
Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в настоящее время рассматриваются большинством авторов, как часть общего адаптационного механизма поддержания гомеостаза организма (Клебанов и соавт., 1991) и как молекулярная основа патологического процесса (Зенков и соавт., 2001; Шанин, 2003). При различных патологиях наиболее часто наблюдается активация процессов ПОЛ и снижение активности системы эндогенной антиоксидантной защиты, требующие соответствующей терапии средствами, обладающими антиокислительными свойствами (Шишкин, 1994).
Результаты исследования антиоксидантной активности (АОА) отваров и сухих экстрактов семи видов растений, входящих в состав исходного сбора и «Гепатона», полученные по данным ТБК-теста (Клебанов и соавт., 1988), представлены на рис.3.2.1. Установлено, что сухие экстракты мяты перечной (Мр), зверобоя продырявленного (Нр), солодки уральской (Gu), а также «Гепатон» проявляют более выраженную АОА по сравнению с соответствующими отварами, что обусловлено повышенным содержанием в экстрактах веществ фенольной природы. Выраженность АОА сухих экстрактов - компонентов «Гепатона» распределяется в ряду: мята перечная (Мр) зверобой продырявленный (Нр) солодка уральская (Gu) ромашка аптечная (Mr) (шиповник) боярышник кроваво-красный С девясил высокий (Ih).
Эксперименты проведены с использованием модельных биохимических тест-систем, в которых в качестве субстратов использовали: глутатион окисленный, глутатион восстановленный, фосфоенолпируват, гидроксибу-тил, аденозинди- и трифосфаты, Р-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный и Р- никотинамидадениндинуклеотид фосфат (Sigma). Определяли активность глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, каталазы и пиру-ваткиназы (Бродова, 2004). Концентрация ферментов в инкубационной среде составляла 0,3 - 0,5 мкг/мл, испытуемое средство в пробу добавляли в концентрациях 1,0; 5,0; 10,0; 50,0 и 100,0 мкг/мл.
Как следует из таблицы, введение в инкубационную среду «Гепатона» в указанных концентрациях сопровождается повышением активности ферментов антиоксидантной защиты: глутатионредуктазы и глутатионперокси-дазы. При этом отмечается дозозависимый эффект: с увеличением концентрации испытуемого средства его эффективность повышается до определенных значений, при дальнейшем повышении концентрации - снижается. Наиболее выраженное повышение активности глутатиопероксидазы отмечается при введении «Гепатона» в инкубационную среду в концентрации 50 мкг/мл (на 31 %) по сравнению с контролем. Установлено, что испытуемое средство в концентрациях, превышающих экспериментально-терапевтические, оказывает ингибирующее действие на каталазную активность. В то же время испытуемое фитосредство в концентрациях 10 и 50 мкг/мл оказывает активирующее влияние на активность пируваткиназы, ускоряя ферментативную реакцию в среднем на 30 % по сравнению с контролем. При этом также отмечается дозозависимый эффект: дальнейшее увеличение концентрации средства, в модельной системе приводит к угнетению активности этого фермента.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что «Гепатон» в концентрациях, соответствующих экспериментально-терапевтическим дозам, повышает активность ферментов антиоксидантной защиты организма, а также активность ключевого фермента энергетического обмена - пируваткиназы, повышая антиоксидантный и энергетический потенциал клеток.
Исследование влияния «Гепатона» на кинетику индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) проведено с использованием 1 % суспензии липосом яичного желтка (Владимиров и соавт., 1991) по общепринятому методу (Клебанов и соавт., 1988). Водный раствор «Гепатона» в инкубационную среду добавляли в концентрациях: 0,05; 0,10 и 0,20 мг/мл. Определяли интенсивность быстрой вспышки (1бв) и скорость ХЛ на начальной экспоненциальной стадии медленной вспышки (5), а также производили расчет антиоксидантной активности «Гепатона» (Владимиров и соавт., 1991).
Как следует из данных, приведенных в таблице 3.2.2., «Гепатон» в исследованных концентрациях оказывает существенное ингибирующее влияние на кинетику Fe2+ - индуцированной хемилюминесценции липосом, о чем свидетельствует уменьшение амплитуды «быстрой вспышки» и снижение скорости ХЛ. При этом выявлен дозозависимый эффект. Так, при внесении в инкубационную среду испытуемого средства в концентрации 0,05 мг/мл отмечается уменьшение показателя 1бВ в 1,7 раза, а также снижение скорости ХЛ на 25,5% по сравнению с аналогичными показателями контрольных проб. При увеличении концентрации фитоэкстракта выраженность ингибирования ХЛ повышается: при внесении «Гепатона» в концентрациях 0,1 и 0,2 мг/мл амплитуда «быстрой вспышки» уменьшается в 1,9 и 2,2 раза по сравнению с контролем. Скорость ХЛ при внесении «Гепатона» в дозе 0,1 мг/мл снижается в полтора раза, а при использовании концентрации, равной 0,2 мг/мл, в 1,8 раза. Расчет антиоксидантной активности (АОА) «Гепатона» показал, что его АОА составляет 18,7 (г/л) "\ что свидетельствует о достаточно выраженной АОА.
Острое асептическое воспаление воспроизводили путем субплантарно-го введения формалина (Стрельников, 1960), декстрана (Лещинский, 1972), гистамина гидрохлорида (Александров, 1986). Животным опытной группы внутрижелудочно профилактически за 1 час до тестирования вводили водный раствор «Гепатона» в дозе 50 мг/кг в объеме 1 мл/100 г. В качестве препарата сравнения использовали калефлон в дозе 100 мг/кг.
Из приведенных в таблице 3.3.1.1. данных следует, что «Гепатон» в дозе 50 мг/кг оказывает антиэкссудативное действие, снижая выраженность формалинового отека на 32 %, декстранового - на 16 %, гистаминового - на 25 % по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. При этом антиэкссудативная активность «Гепатона» превосходит таковую у препарата сравнения - калефлона.
Изучение влияния «Гепатона» на функциональное состояние печени у белых крыс
Исследование проведено на крысах обоего пола линии Wistar массой 180-200 г. Животным опытной группы водный раствор «Гепатона» вводили однократно внутрижелудочно в дозах 25, 50 и 100 мг/кг в виде водного раствора в объеме 1 мл/100 г. Животные контрольной группы получали экви-объемное количество дистиллированной воды. Влияние «Гепатона» на жел-чеобразовательную и желчевыделительную функцию печени оценивали по скорость секреции и общее количество выделенной желчи по методике Н.П. Скакуна и А.Н. Олейник (1967), а также определяли количество выделенных с желчью билирубина по методу Ван-ден-Берга в модификации Н.П. Скакуна (1967), концентрацию в желчи общего холестерина - по методу СМ. Дрого-воз (1971) и суммарную концентрацию в желчи желчных кислот по методу Я.И. Карбача (1961).
Результаты эксперимента приведены в таблице З.5.1., из которых следует, что наиболее выраженная желчегонная активность отмечалась у крыс, получавших «Гепатон» в дозе 50 мг/кг. Так, скорость секреции желчи через 1-2 часа после введения испытуемого средства в указанной дозе возрастала на 42 и 32 % по сравнению с аналогичными данными в контрольной группе. Хо-леретическая реакция сохранялась на высоком уровне в течение 5 часов. При этом «Гепатон» стимулировал выделение желчных кислот с желчью, суммарная концентрация которых превышала таковую у крыс контрольной группы на 42 %. Кроме этого, испытуемое средство заметно повышало выделение с желчью билирубина и холестерина. Введение фитоэкстракта животным в дозах 25 и 100 мг/кг оказывало однонаправленный менее выраженный эффект.
Таким образом, «Гепатон» при однократном введении лабораторным животным в экспериментально-терапевтической дозе оказывает умеренное, желчегонное действие, а также благоприятно влияет на желчеобразователь-ную функцию печени лабораторных животных. Наряду с этим «Гепатон» повышает скорость холереза и концентрацию желчных кислот в сецернируемои желчи. В соответствии с классификацией желчегонных средств «Гепатон» можно отнести к истинным холесекретикам.
Оценку антимикробной активности «Гепатона» проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой среде (Першин, 1971). В качестве тест-объектов использовали музейные штаммы следующих видов микроорганизмов: Staphylococcus aureus 209 р, Proteus vulgaris Н50, Escherichia coli - 408, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa. Антибактериальную активность гепатона оценивали при его добавлении в питательную среду в концентрациях от 50 до 1,56 мг/мл. Культуры бактерий с исследуемым фитоэкстрактом в указанных концентрациях термостатировали при 37 С в течение 20 часов. Контролем служили культуры бактерий без добавления «Гепатона».
«Гепатон» проявляет наиболее выраженную антибактериальную активность по отношению к золотистому стафилококку и вульгарному протею, оказывая бактерицидное действие в концентрации 25 мг/мл и бактериостатическое в остальных разведениях. По отношению к кишечной палочке фитоэкстракт оказывает бактерицидное действие в максимальной концентрации и бактериостатическое в концентрации 12,5 мг/мл, не влияя на рост указанной культуры в более низких разведениях. Испытуемое средство задерживает рост фекального стрептококка в различной степени выраженности во всех концентрациях. Наименьшую антибактериальную активность «Гепатон» проявляет по отношению к синегнойной палочке. 3.7. Изучение иммуномодулирующей активности «Гепатона»
Эксперименты проведены на мышах-самцах линий СВА и Fj (СВАхС57В1/6) массой 18-20 г. Действие испытуемого фитоэкстракта на показатели иммунитета было изучено на интактных животных, а также животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной азатиоприном (Лазарева, Алехин, 1985). Животным опытной группы внутрижелудочно вводили «Гепатон» в дозе 50 мг/кг в течение 14 дней 1 раз в сутки. Действие «Гепатона» на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Петров и соавт., 1987), гуморального звена - по количеству антителообразующих клеток (Cunningham, 1965).
При оценке влияния «Гепатона» на клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ установлено, что испытуемое средство восстанавливает индекс реакции ГЗТ (ИР ГЗТ) в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Введение азати-оприна приводит к снижению ИР ГЗТ на 36 % по сравнению с тем же показателем в интактной группе (табл. З.7.1.).
Контрольная (азатиоприн+дист. вода) (п=7) 14,2±1,27 Опытная (азатиоприн + «Гепатон») (п=7) 19,4±1,87 Опытная («Гепатон») (п=7) 17,9±1,60 При курсовом введении испытуемого средства на фоне иммунодепрес-сии наблюдается увеличение ИР ГЗТ в 1,4 раза по сравнению с контролем, а при введении «Гепатона» интактным животным установлено, что данное средство не изменяет показатели клеточного иммунитета у интактных животных.
При исследовании влияния «Гепатона» на состояние гуморального звена иммунного ответа установлено, что исследуемое средство уменьшает выраженность азатиоприновой иммуносупрессии, о чем свидетельствует увеличение абсолютного и относительного количества АОК соответственно в 1,9 и 1,8 раза по сравнению с контролем (табл. 3.7.2.). Показано также, что испытуемый фитоэкстракт не оказывает влияния на показатели гуморального звена иммунного статуса у интактных животных.
Как следует из данных, приведенных в таблице 3.7.2., курсовое введение «Гепатона» на фоне азатиоприновой иммуносупрессии стимулирует функциональную активность макрофагов, что выражается в увеличении активности и интенсивности фагоцитоза в 1,4 раза по сравнению с таковыми в контрольной группе. При введении «Гепатона» интактным животным уста 67 новлено, что данное средство не изменяет показатели макрофагального иммунитета у интактных животных.
Полученные данные свидетельствуют, что курсовое введение «Гепа-тона» в дозе 50 мг/кг на фоне азатиоприновой иммуносупрессии сопровождается повышением активности клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа. При этом испытуемый фитоэкстракт не оказывает влияния на иммунный статус организма интактных животных.
Изучение влияния «Гепатона» на течение апоптотического процесса в гепатоцитах при остром токсическом тетрахлорметановом гепатите у крыс
Опыты проведены на крысах обоего пола линии Wistar массой 180-200 г. Интоксикацию вызывали путем однократного внутрижелудочного введения четыреххлористого углерода в дозе 1,25 мл/кг. Животные опытной группы дважды получали водный раствор «Гепатона» внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в объеме 10 мл/кг профилактически за 1 и 12 и 24 часа до введения четыреххлористого углерода. Крысы контрольной группы получали эквиобьемное количество дистиллированной воды. Исходными показателями служили данные у интактных животных. Активность каспазы-3 определяли в гомогенате печени колориметрическим методом с использованием набора реактивов «Caspase 3 Assay Kit» (Sigma). Из таблицы следует, что через 12 и 24 часов после введения четыреххлористого углерода активность каспазы-3 в клетках печени контрольной группы животных увеличивается по сравнению с показателями у интактных животных в 2,3 раза, а через 1 час активность фермента не отличается от данных у животных интактной группы. «Гепатон» оказывает выраженное ин-гибирующее действие на активность каспазы-3, сравнимое с действием специфического для этого фермента ингибитора (Ac-DEVD-CHO): через 1 после интоксикации активность фермента снижается на 52 и 41 % соответственно. Через 12 и 24 часа активность каспазы-3 в контрольной и опытной группах животных находится на одном уровне, тогда как специфический ингибитор снижает ее на 43 и 39 % соответственно. Таким образом, установлено ингибирующее влияние комплексного растительного средства «Гепатон» на активность каспазы-3 при остром токсическом поражении печени.
Опыты проведены на белых крысах-самцах линии Wistar массой 160-180 г. Стресс-реакцию вызывали путем иммобилизации крыс на спине в течение 24 часов. Водный раствор «Гепатона» в дозе 50 мг/кг в объеме 1 мл/100 г вводили внутрижелудочно за 30 минут до иммобилизации крыс. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды. Через 24 часа после иммобилизации определяли выраженность стрессорных повреждений: степень гипертрофии надпочечников и инволюции тимуса, появление язвенных поражений в слизистой оболочке желудка. Для оценки состояния слизистой желудка подсчитывали число деструкции, которые подразделяли на точечные кровоизлияния, эрозии и полосо-видные язвы. Для каждого вида повреждений слизистой оболочки желудка рассчитывали «язвенный индекс» Паулса (ИП). При патоморфологическом исследовании печень фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Структуру печени изучали с помощью световой микроскопии с применением морфометри ческих методов исследований (Автандилов, 1990). Определяли процентное соотношение клеток печени без видимых повреждений, с признаками дистрофии и некроза. Гликоген печени выявляли ШИК - реакцией. Содержание гликогена в гепатоцитах оценивали в баллах (0, 1, 2, 3). Цитохимический индекс содержания гликогена вычисляли по формуле: ЦХИ= (0 nl+1 п2+2 пЗ+3 n4) / (nl+n2+n3+n4), где nl, п2, пЗ, п4 - количество гепатоцитов (Луппа, 1980). Полученные данные представлены в таблицах 4.3.1. - 4.3.2.
В результате суточной иммобилизации у крыс контрольной группы развиваются дистрофические изменения внутренних органов, характерные для стрессорной реакции: гипертрофия надпочечников, инволюция тимуса и появление деструктивных поражений слизистой оболочки желудка в виде точечных кровоизлияний, эрозий и полосовидных язв. Профилактическое введение «Гепатона» в дозе 50 мг/кг не оказывало влияния на массу надпочечников при стрессе, вместе с тем способствовало уменьшению степени инволюции тимуса на 35 % по сравнению с показателями у животных контрольной группы (табл. 4.3.1.)
В то же время, при введении «Гепатона» в исследуемой дозе точечные кровоизлияния наблюдались в 83% случаев. При этом у крыс опытной группы отмечалась тенденция к снижению среднего числа точечных кровоизлияний на 1 животное, а также существенное уменьшение индекса Паулса. Эрозии обнаруживались в контроле у 100 % животных, тогда как у крыс, получавших «Гепатон», лишь в 67 % случаев. Уменьшалось среднее число эрозий на 1 животное по сравнению с показателями у крыс в контроле. В то же время, у крыс опытной группы отмечалось существенное, почти в 2 раза, сниже 93 ние индекса Паулса по сравнению с контролем. Полосовидные язвы, являющиеся наиболее крупными поражениями слизистой оболочки желудка, отмечались в контроле у 50 % животных, а при введении «Гепатона» - в 33 % случаев. Соответственно этому на фоне введения испытуемого фитосредства более чем в 2 раза уменьшалось среднее число полосовидных язв на 1 животное и более чем в 3 раза снижался язвенный индекс Паулса.
При микроскопическом исследовании установлено, что иммобилиза-ционный стресс сопровождается развитием структурных нарушений печени (рис. 4.3.1.).
94 В частности, на 4 сутки на гистологических срезах печени животных контрольной группы выявляются нарушения микроциркуляции, венозное полнокровие и расширение внутридольковых синусоидных капилляров, в просвете которых обнаруживается стаз эритроцитов; гепатоциты с признаками дистрофии и некроза в большей мере имеют локализацию в периферических отделах печени, в центролобулярных отделах.
Установлено, что курсовое введение «Гепатона» животным на фоне иммобилизационного стресса способствовало улучшению микроциркуляции в ткани печени и тем самым предупреждало развитие дистрофических изменений и некроза гепатоцитов. Нормальные гепатоциты, % 90,3±3,6 66,6±3,4 78,5±1,6 75,7±0,9 92,2+0,6 Дистрофические гепатоциты, % 8,6±3,1 20,0±1,5 11,6+0,8 18,8±0,9 4,8±0,3 Некротические гепатоциты, % 1,0+0,5 13,3±1,7 9,8+1,2 5,5+0,5 2,8+0,6 ЦХИ 2,9±0,04 0,6±0,02 1,2+0,02 0,9+0,03 1,7±0,12
Важная роль в реализации гепатотоксичности ксенобиотиков принадлежит их биотрансформации в печени, причем печень подвергается воздействию в значительно более высокой степени, чем другие органы (Andrade et al., 2005; Kirn, 2005). Независимо от действующего фактора формируется ограниченное количество патологических реакций, среди которых важнейшие: стеатоз, некроз, холестаз, фиброз, канцерогенез (Moseley, 2003; Федоров, 2004; Яковенко и соавт., 2005). Гибель клеток может являться следствием реализации регулируемых биологических механизмов (контролируемая клеточная смерть - апоптоз), который может быть существенно усилен при действии ряда экзогенных факторов, таких как, оксидативныи стресс, аноксия, ионизирующее излучение, токсиканты (Стоян, 2004; Алеева, Журавлева; 2005; Мойбенко и соавт., 2005).
