Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Клинико-морфологическая характеристика БКР 6
1.2. Роль протеинов, регулирующих клеточный цикл, в неопластической трансформации
1.2.1. Апоптоз 11
1.2.2. Семейство протеинов bcl-2 и их роль в канцерогенезе 13
1.2.3. Роль протеинов bcl-2 в патогенезе эпителиальных опухолей кожи 15
1.2.4. Способы оценки пролиферативной активности клеток 17
1.2.5. Пролиферативная активность клеток эпителиальных опухолей 18 кожи
1.2.6. Ген рбЗ и его роль в канцерогенезе 20
1.3. Адгезивные молекулы и их роль в неопластической трансформации тканей
1.3.1. Молекулы клеточной адгезии 23
1.3.2. Кадгерины 25
1.3.3. Е-кадгерин и его роль в злокачественной трансформации клеток 25
1.3.4. Экспрессия Е-кадгерина в эпидермисе и эпителиальных опухолях кожи
1.3.5. Семейство молекул CD44 30
1.3.6. Роль молекул CD44 в канцерогенезе 32
1.3.7. Экспрессия молекул CD44 в эпителиальных опухолях кожи 33
1.4. Современные методы лечения БКР 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Метариалы исследования 41
2.2. Методы исследования 45
2.2.1. Морфологические методы исследования
2.2.1.1. Гистологический метод
2.2.1.2. Иммуногистохимический метод
2.2.2. Системы оценки экспрессии различных ИГХ маркеров
2.2.3. Статистический метод
Глава 3. Клинико-морфологическая характеристика базальноклеточного рака
3.1. Клиническая характеристика БКР 50
3.2. Морфологическая характеристика БКР 77
Глава 4. Протеины, регулирующие клеточный цикл
4.1 .Экспрессия протеинов, регулирующих всех, в базальноклеточном раке
4.2. Пролиферативная активность клеток базальноклеточного рака
4.3. Экспрессия протеина рбЗ в БКР 116
Глава 5. Экспрессия адгезивных молекул в базальноклеточном раке 124
5.1. Экспрессия Е-кадгерина в БКР 124
5.2. Экспрессия CD44H в базальноклеточном раке 135
Глава 6. Лечение базальноклеточного рака кожи 145
Заключение 176
Выводы 189
Список литературы 192
Введение к работе
Изучение злокачественных опухолей кожи является актуальной междисциплинарной задачей клинической дерматологии и онкологии в связи с высоким уровнем и нарастанием первично регистрируемой заболеваемости. В общей структуре онкозаболеваемости населения России злокачественные опухоли кожи занимают 3-е ранговое место (от 10,4% до 12%) [16,32]. Наиболее частой из них является базальноклеточный рак (БКР), доля которого в их общей структуре оценивается в 75-90% [79,92]. Выделяют поверхностную, нодулярную, язвенную и склеродермоподобную формы БКР [17,18,177], которые характеризуются разным течением, прогнозом и требуют дифференцированного подхода к лечению. В то же время патогенетические механизмы формирования той или иной клинической формы БКР изучены недостаточно. Наиболее детально исследованы иммунологические аспекты язвенного и метатипического БКР [52], лишь отдельные авторы изучали морфологические и иммуногистохимические особенности различных клинических форм БКР [4].
Как известно, значительная роль в неопластической трансформации клеток и течении злокачественных новообразований принадлежит инактивации регуляторных протеинов, контролирующих апоптоз и пролиферацию [153,219,248] и адгезивным молекулам [12,205,235]. Однако, данные литературы об экспрессии в БКР протеинов, регулирующих апоптоз, противоречивы. Одни авторы не выявили экспрессии протеина-индуктора апоптоза ВАХ в клетках БКР [218], другие нашли ее в 80% клеток этой опухоли, что, по их мнению, определяет медленный темп роста новообразования [251], а O.Bozdogan и соавт. [81] отметили, что клетки БКР имели высокую пролифератпвную активность в сочетании с экспрессией ингибитора апоптоза ВсІХ. Нам представляется важным изучение роли протеинов, регулирующих апоптоз и пролиферацию, в развитии различных форм БКР. В последнее время большое внимание уделяется изучению экспрессии рецепторов клеточной адгезии, обеспечивающих контакты клеток между собой и с внеклеточным матриксом. В частности показаны нарушения экспрессии адгезивных молекул (Е-кадгерина, CD44) в клетках аденоидного и морфеаподобного типов БКР
[101,151,157,203]. Однако анализа экспрессии адгезивных молекул в клетках различных клинико-морфологических вариантов этой опухоли не проводилось. Поскольку выбор метода лечения БКР зависит от клинической формы, гистологического типа, размера и локализации опухоли, возраста пациента, а также сопутствующих заболеваний для повышения эффективности терапии прибегают к комбинации различных методов [45,53]. Нам представляется важной разработка нового подхода к лечению БКР на основе использования рекомбинантного интерферона-альфа2Ь и/или криодеструкции с учетом клинической формы, гистологического типа и иммунофенотипических особенностей опухоли.
Цель исследования:
Комплексное изучение клинико-морфологических и
иммунофенотипических особенностей базальноклеточного рака кожи и разработка на этой основе метода его лечения с использованием рекомбинантного интерферона альфа2Ь и/или криодеструкции.
Задачи исследования:
Изучить клинико-морфологические особенности различных форм базальноклеточного рака кожи
Изучить экспрессию протеинов, участвующих в регуляции клеточного цикла клеток базальноклеточного рака кожи (ВАХ, BclX, PCNA)
Изучить экспрессию протеина рбЗ в клетках базальноклеточного рака кожи
Изучить особенности экспресии в клетках базальноклеточного рака кожи адгезивных молекул (Е-кадгерин, CD44H)
5. Разработать на основе полученных данных метод лечения
базальноклеточного рака кожи с использованием рекомбинантного
интерферона альфа2Ь и/или криодеструкции.
6. Оценить эффективность разработанного метода лечения на основе
изучения ближайших и отдаленных результатов
Семейство молекул CD44
Трансмембранные адгезивные молекулы CD44 широко представлены на мембране многих тканей организма. Они экспрессируются в базальном слое эпителиального слоя кожи, пищевода, шейки матки, в железистом эпителии поджелудочной, предстательной, молочной, слюнной, щитовидной железы, в сальных и потовых железах, на нейтрофилах и Т-лимфоцитах [59]. Их физиологической функцией является агрегация, миграция и активация клеток, что обеспечивается адгезивными свойствами этих молекул. Сверхэкспрессия молекул CD44 наблюдается на клетках опухолей, развивающихся из выше упомянутых тканей, но они часто различаются по типу экспрессии и локализации иммунореактивности, что можно использовать для дифференциальной диагностики новообразований [128,129].
Адгезивные молекулы CD44 представляют собой семейство гликонротеидов, которое представлено стандартной изоформой (CD44s) и около 30 вариантными изоформами (CD44v) [70]. Вариабельность структуры и распределения молекул CD44 в различных тканях свидетельствует о многообразии их функций, из которых в настоящее время известны следующие: 1) обеспечение межклеточных связей (адгезии, агрегации и миграции клеток); 2) участие в разрушении экстрацеллюлярного матрикса; 3) активация лимфоцитов; 4) участие в процессах миело- и лимфопоэза; 5) стимуляция ангиогенеза; 6) активация-ингибиция продукции цитокинов различными типами клеток [42,225].
Основной функцией молекул CD44 является обеспечение межклеточных взаимодействий (адгезии) в соответствующем микроокружении. Молекулы участвуют в передаче специфических сигналов через компоненты цитоскелета в клетку и между клетками, что стимулирует увеличесние митотической активности клеток. В ответ на определенные экзо- и эндогенные стимулы происходят изменения в характере экспрессии молекул CD44 и силе межклеточных адгезивных связей.
Активация клеток, вызываемая молекулами адгезии CD44, подробно описана для Т-лимфоцитов [59]. На покоящихся Т-лимфоцитах CD44 присутствует в неактивной форме. Активация клеток увеличивает экспрессию CD44 и его аффинность к гиалуронату. Связывание CD44 со специфическими протеогликанами включает в лейкоците сложные процессы, приводящие к миграции клетки в направлении очага воспаления. Адгезия Т-лимфоцитов к эндотелию осуществляется при кластеризации молекул CD44 на поверхности лимфоцита, прилежащей к эндотелию. Эта кластеризация рецептора приводит к усилению экспрессии LFA-1, что способствует контакту со специфическими молекулами межклеточной адгезии, появляющимися на активированных клетках эндотелия [59]. Таким образом, CD44 наряду с IL-8, признается первичным медиатором адгезии лейкоцитов (лимфоцитов и нейтрофилов), их хемотаксиса и способности к миграции в межклеточном матриксе.
С тех пор, как в 1991 году Gunthert и соавторы показали, что интенсивность экспрессии CD44 коррелирует с метастатическим потенциалом карцином у крыс, началось изучение роли CD44 в различных опухолях человека.
Распространение метастазов обеспечивается длинной цепью межклеточных взаимодействий, при этом метастазирующие клетки опухоли используют некоторые механизмы, функционирующие при физиологической миграции клеток в норме [129]. Клетки опухоли, экспрессирующие CD44, с помощью лигандов к гиалуронату, сульфату хондроитина, фибронектину, ламшшну и коллагенам прикрепляются к соответствующим компонентам экстрацеллюлярного матрикса. Это позволяет им вторгаться в окружающие ткани, утилизировать и разрушать гиалуроиат экстрацеллюлярного матрикса [47]. С другой стороны взаимодействие между молекулами CD44 и его лигандами стимулирует выработку клетками опухоли аутокринных факторов роста и протеаз, способствующих васкуляризации опухоли. Сверхэкспрессия CD44 усиливает связывание клеток с гиалуронатом и, уменьшая их адгезивные свойства, увеличивает их подвижность
Методы исследования
Для ИГХ исследований ткани фиксировали в 10%-ном забуфференном формалине (рН 7,2), проводили по батарее спиртов и ксилолов, заливали в парафин по стандартной методике. Использовали парафин с температурой плавления 54 С (Германия).
Затем с помощью одноразовых лезвий марки R35 готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм и наносили их на стекла с адгезивным покрытием (полилизиновые), депарафинировали по стандартному протоколу.
Далее срезы по 5 минут промывали в деионизированной дистиллированной воде и фосфатном буфере (рН 7,4). (Все использованные в ИГХ реакции растворы готовили только на деионизированной воде).
Исследование проводили в соответствии с методикой Taylor С. R., Cote R. [247] и Stemberger L.A. [239]. Применяли метод восстановления антигенных детерминант ткани по методике Shi S.R. и соавт. [229] с помощью предварительной обработки срезов, погруженных в цитратный буфер (рН 6,0) в микроволновой печи при мощности 690 Вт 2 раза но 5 минут.
Затем срезы охлаждались 20 минут при комнатной температуре, аккуратно подсушивались и на них наносились первичные антитела.
Антитела применяли в рабочих разведениях, а для усиления специфической реакции в соответствии с модификацией Л.Е.Гуревич и соавт. [13] применялась более длительная инкубация с первичными антителами: 30 минут при комнатной температуре, затем 14-18 часов при 4С. Использовались соответствующие позитивные и негативные контроли — иммунные и не иммунные сыворотки.
Срезы тщательно отмывались в буфере, подсушивались, затем на них наносили EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) или универсальный Novostain Super ABC kit (фирмы Novocastra, Великобритания).
1. При использовании одноступенчатой системы EnVision реактив наносился на срезы на 30-40 минут;
2. При использовании двухступенчатого универсального авидин-стрептовидинового ABC-комплекса на срезы на 30 минут наносились вторичные антитела, которые затем промывались забуфференным физраствором и просушивались, а затем еще на 30 минут пероксидазный комплекс.
После каждой инкубации срезы тщательно отмывали, подсушивали вокруг, затем, для визуализации реакции, на них наносили DAB+ (3, Зг_ диаминобензидин), что позволяло получать специфическую коричневую окраску.
Интенсивность ИГХ реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: после достижения необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, а затем в течение 2-5 минут докрашивали гематоксилином Майера.
Затем их снова промывали и погружали в проточную воду, в которую, для получения щелочной среды, добавляли несколько капель нашатырного спирта.
После того, как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекались, обезвоживались в батарее спиртов и ксилолов по стандартной схеме, заключались в бальзам и исследовались под микроскопом 2.2.2. Системы оценки экспрессии различных ИГХмаркеров
1. Экспрессия BAX/BclX наблюдалась в цитоплазме клеток, отличалась по интенсивности окрашивания и соответственно оценивалась в баллах:
0 - реакция отсутствует;
1 - слабая экспрессия;
2 - реакция умеренная;
3 - реакция интенсивная
2. Определение пролиферации, а также экспрессии протеина рбЗ оценивалась с помощью индекса, который вычислялся как среднее от числа меченных ядер на 100 учтенных ядер (при учете 500-1000 опухолевых клеток). Подсчет меченных ядер проводился в репрезентативных полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо.
Клетки на периферии срезов, где чаще всего наблюдается фоновое окрашивание, не учитывались.
3. Оценка экспрессии адгезивных молекул проводилась по системе, разработанной Л.Е.Гуревич [12].
Экспрессия Е-кадгерина:
мембранный, или нормальный тип экспрессии - равномерное распределение иммунореактивности по всей клеточной мембране;
мембранно-редуцированный тип экспрессии - распределение иммунореактивности только на отдельных участках клеточной мембраны;
смешанный мембрашю-цитоплазматический тип экспрессии -равномерная цитоплазматическая экспрессии в сочетании с мембранной;
мелко - и крупно-гранулярный цитоплазматический — экспрессия Е-кадхерина в виде гранул, рассеянных в цитоплазме клеток;
комковатый - экспрессия в цитоплазме клеток виде хаотично локализованных крупных комочков и конгломератов иммунореактивного материала;
отсутствие иммунореактивности. Для оценки прогностического значения описанных типов экспрессии Е-кадгерина в клетках БКР использовалась следующая шкала (предложена Л.Е.Гуревич [12]):
мембранный тип экспрессии - 1 балл;
мембранно-редуцированный - 2 балла;
мембранно-цитоплазматический - 3 балла;
мелко- и крупногранулярный цитоплазматический - 4 балла;
отсутствие иммунореактивности - 4 балла. Экспрессия CD44H:
мембранный тип экспрессии - равномерное распределение иммунореактивности по всей клеточной мембране;
мембранно-редуцированный тип экспрессии - распределение иммунореактивности только на отдельных участках клеточной мембраны;
цитоплазматический диффузный тип экспрессии - равномерная цитоплазматическая экспрессия
цитоплазматический мелкогранулярный тип экспрессии экспрессия CD44H в виде мелких гранул, рассеянных в цитоплазме клеток;
Интенсивность окрашивания оценивалась в баллах:
0 - реакция отсутствует;
1 - слабая экспрессия;
2 - реакция умеренная;
3 - реакция высокая;
4 - реакция интенсивная
2.2.3. Статистический метод
Для статистической обработки данных использовались методы:
1. t-Стьюдента с поправкой для множественных сравнений;
2. хи-квадрат
3. точный критерий Фишера с построением четырехпольных таблиц Расчеты проводились при помощи программы BIOSTAT. Полученные различия считались достоверными при значениях р 0,05. Глава 3. Клинико-морфологическая характеристика базалыюклеточного рака
В данном разделе представлены результаты анализа клинической картины поверхностной, нодулярной и язвенной форм БКР кожи, который был выполнен на основании изучения медицинской документации (истории болезней, амбулаторные карты) 2130 больных первичным солитарным БКР.
Поверхностная форма БКР Среди больных поверхностной формой БКР кожи были 319 женщин и 183 мужчины в возрасте от 25 до 92 лет (средний возраст 61,06+11,23 лет). Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 3.1.1, 1а. Как видно из таблиц, среди больных поверхностной базалиомой женщин было в 1,7 раза больше, чем мужчин. Преобладали лица в возрасте 60-69 лет, несколько меньше было пациентов в возрасте 50-59 и 70-79 лет. Подавляющее большинство пациентов поверхностным БКР (84,1%) были в возрасте от 50 лет и старше. Аналогичная возрастная тенденция отмечается как среди женщин, так и среди мужчин. В тоже время среди пациентов молодого возраста (20-29 и 30-39 лет) женщин было в 2 раза больше, чем мужчин.
Клиническая характеристика БКР
Нодулярная форма БКР Распределение больных нодулярной формой БКР по полу и возрасту представлено в таблицах 3.1.2, 2а. С нодулярной формой БКР было 273 женщины и 164 мужчины в возрасте от 28 до 86 лет (средний возраст составил 62,86±11,28). Женщин было больше в 1,6 раза. Чаще всего нодулярная форма БКР встречалась среди больных в возрасте 60-69, 50-59 и 70-79 лет. При этом больные в возрасте от 50 лет и старше составили 87,7%. Подавляющее большинство пациентов в возрасте старше 50 лет отмечено также как среди женщин, так и мужчин. Хотя среди больных молодого возраста (20-49 лет) мужчин было в 1,5 раза больше, чем женщин. В возрастной группе старше 80 лет мужчин было больше в 2,3 раза.Данные о длительности заболевания при нодулярном БКР на момент обследования представлены в таблице 3.1.26. Средняя продолжительность заболевания при нодулярной форме БКР составляла 2,5+2,2 года. У 53,1% пациентов опухоль существовала от 1 года до 3 лет, в сроки до года к врачу обратилось 24,4% пациентов. Давность заболевания равная 4-Ю годам была у 19,9% больных. Следует отметить, что в сроки до года к нам обратилось в 1,5 раза больше мужчин, чем женщин. В тоже время среди пациентов с самыми длительными сроками заболевания (11-20 лет) женщин было в 1,6 раза больше.
Данные о локализации очагов нодулярной формы БКР представлены в таблице 3.1.2в. В 86% случаев нодулярная форма БКР локализовалась в области головы и шеи, при этом 73,6%) - на коже лица, 12,4% - на волосистой части головы, периаурикулярной зоне и шее. При этом на лице наиболее часто поражалась кожа носа (25,6%), щек (14,2%), периорбитальная область и веки (11,4%). У женщин наиболее частой локализацией была кожа носа, она отмечалась практически у трети больных (31,4%). У мужчин опухоли распределялись более равномерно, чаще всего на носу - 15,8% и на щеке -14,6%. На туловище и конечностях располагалось только 14% нодулярной формы БКР, при этом на закрытых участках кожи (туловище) только 9,4% от всех случаев.
Как видно из таблицы 3.1.2г, в которой представлены данные о размере очагов поражения при нодулярной форме БКР, подавляющее большинство новообразований (88,3%) имела диаметр до 2 см и относилась к ТІ. Диаметр опухоли более 2 см имели 16,2% больных, в 1,4 раза чаще мужчины.
Язвенная форма БКР Среди больных этой формой БКР было 693 женщины и 481 мужчина в возрасте от 26 до 90 лет (средний возраст составил 62,8±11,38). Данные о возрастно-половом соотношении представлены в таблице 3.1.3, За. Среди больных язвенной формой БКР женщин было в 1,4 раза больше, чем мужчин. Чаще всего опухоль встречалась в возрасте 60-69, 70-79 и 50-59 лет. Пациенты в возрасте старше 50 лет составили 86,6% больных язвенной формой. Среди женщин и мужчин возрастные соотношения были примерно одинаковые и соответствовали общегрупповым показателям. Отличалась только возрастная группа 20-29 лет, в которой мужчин было в 5 раз больше, чем женщин.
Данные о локализации очагов поражения при язвенной форме БКР представлены в таблице 3.1.Зв. Локализация процесса в области головы и шеи отмечена в 91,1% случаев, при этом в области лица располагалось 79,9% очагов, в области волосистой части головы, периаурикулярнои зоне и шее - 11,2%. Чаще всего опухоль локализовалась в области носа - 29,3%, щеки - 16,3%, периорбитальной области и век - 10,9%, виска - 10,6%. Самой частой локализацией как у женщин, так и у мужчин также были нос (32,5% и 24,6% соответственно) и щека (15,8% и 17,1% соответственно). Следует отметить, что локализация на коже лба в 1,7 раза чаще встречалась у женщин, тогда каклокализация на коже ушной раковины и в периаурикулярнои зоне в 2,3 раза чаще отмечена у мужчин. В области туловища, верхних и нижних конечностей располагалось только 8,9% язвенных базалиом.
Размер очагов поражения при язвенной форме БКР представлен в таблице 3.1.3г. 93,1% опухолей были отнесены к ТІ, т.е. имели размер до 2 см. Свыше 2 см имели размер 6,9% БКР. Как у женщин, так и у мужчин подавляющее большинство опухолей отнесены к ТІ. В тоже время гигантские язвенные базалиомы (свыше 5 см) у мужчин диагностированы в 2 раза чаще, чем у женщин. Склеродермоподобный БКР Среди больных склеродермоподобной формой БКР были 13 женщин и 4 мужчины в возрасте от 42 до 75 лет (средний возраст 62,2±8,11 лет). Средняя продолжительность заболевания составила 2,6±2,2 года. У большинства больных (60,9%) новообразование существовало от 1 года до 3 лет. У 88,2% пациентов очаг локализовался в области головы и шеи. Чаще всего склеродермоподобная форма отмечалась на коже носа (41,1%), реже в носогубном треугольнике (23,5%) и на коже щеки (17,6). В единичных случаях отмечена локализация на коже лба, шеи, верхних конечностей и туловища. При анализе размеров очагов поражения склеродермоподобной формы БКР было отмечено, что подавляющее большинство опухолей (70,7%) имели диаметр до 2-х сантиметров и относились к категории T1N0M0 по международной классификации опухолей, к T2N0M0 - 29,3% новообразований.
Гигантская разновидность БКР К гигансткой разновидности БКР кожи относят новообразования диаметром свыше 5 см, или ТЗ по международной классификации опухолей. Среди 2130 больных у 20 (0,9%) первичный солитарный БКР кожи имел диаметр более 5 см. Из них было 9 женщин и 11 мужчин в возрасте от 41 года до 84 лет (средний возраст 62,6±12,1 года). Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 3.1.4, 4а. Как видно из представленных таблиц, среди больных гигантской разновидности БКР преобладали мужчины, их было в 1,2 раза больше, чем женщин. Чаще всего опухоль отмечена в возрастной группе 50-59 лет. Количество пациентов в возрастных группах до 60 и старше 60 лет было одинаковым. У молодых пациентов в возрасте до 40 лет гигантская разновидность БКР не встречалась.
