Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время различные аспекты вопроса предоперационной диагностики при различных формах узловых новообразований щитовидной железы далеки от окончательного решения. Широкое применение высокоэффективных диагностических технологий (УЗИ, КТ, МРТ) позволило чаще выявлять объемные образования щитовидной железы [Шулутко А.М. и соавт., 2007; Мельниченко Г.А., 2002] и в итоге привело к увеличению количества первичных операций на данном органе, в том числе и по поводу рака и подозрительных на злокачественность узловых образований щитовидной железы. Особую актуальность приобретает вопрос диагностики злокачественного поражения на дооперационном этапе, с целью определения объема планируемого оперативного вмешательства [Ветшев П.С. и соавт., 1998; Ванушко В.Э., Кузнецов Н.С., 2002].
Единственным инструментом, позволяющим установить окончательный диагноз, остается морфологическая верификация [Mackenzie EJ et al., 2004; Nguyen GK et al., 2005]. На дооперационном этапе ведущим методом диагностики узловых поражений щитовидной железы сегодня является тонкоигольная аспирационная биопсия (ТАБ) [Ветшев П.С. и соавт., 2005; Семиков В.И., 2004; Шулутко А.М. и соавт., 2007]. Однако при использовании ТАБ может быть довольно высокой (до 30%) доля малоинформативных образцов, обусловленная получением недостаточного количества материала [Гринева Е.Н., 2002; Screaton NJ et al., 2003]. Цитологическое исследование также не позволяет четко дифференцировать возможное присутствие злокачественного роста [Ветшев П.С. и соавт., 2005; Nguyen GK et al., 2005; Screaton NJ et al., 2003].
Метод пункционной гистобиопсии щитовидной железы позволяет получить больше материала более высокого качества. Он был предложен С. Kaufman в 1897 г., однако практически не применялся долгое время из-за высокой частоты осложнений. В 90-е годы XX века разработка новых автоматических одноразовых биопсийных игл и проведение ультразвукового контроля во время процедуры позволили снизить частоту осложнений, сохранив преимущества методики. Тем не менее, в настоящее время гистобиопсия щитовидной железы остается малоизученной – в мировой практике имеется всего около 20 исследований, хотя в ряде работ показана ее высокая диагностическая ценность и безопасность [Renshaw AA et al, 2007], [Screaton NJ et al., 2003]. В России пункционная гистобиопсия щитовидной железы практически не применяется, хотя и описана в литературе [Пинский С.Б. и соавт. 1999].
Дифференциальный диагноз ряда новообразований щитовидной железы невозможен даже при проведении гистобиопсии. Это относится, в частности, к фолликулярным опухолям (фолликулярная аденома, фолликулярный рак), когда диагностика злокачественного поражения требует планового гистологического исследования всей массы опухоли, и даже при срочном гистологическом исследовании имеется вероятность ложноотрицательного ответа [Ветшев П.С. и соавт., 2005; Гринева Е.Н., 2002; LiVolsi et al., 2004].
К одному из методов, позволяющих с высокой точностью определить характер опухолевого процесса на предоперационном этапе, относится исследование ткани опухоли на содержание в ней специфических компонентов опухолевой клетки – онкомаркеров, в частности - теломеразы. Ключевая роль данного фермента в поддержании процесса неограниченного деления клетки обусловливает универсальность и высокую чувствительность методов его определения в ткани в диагностике злокачественного поражения [Глухов А.И. и соавт., 2003; Saldanha SN et al., 2003].
В научной литературе опубликованы результаты ряда работ по определению содержания теломеразы в ткани новообразований щитовидной железы [Karayan-Tapon L et al., 2004]. При анализе образцов, полученных при выполнении оперативного вмешательства, показана положительная корреляция между теломеразной активностью в ткани новообразования и наличием злокачественного процесса [Kammori M, 2000].
В небольшом количестве работ на наличие теломеразной активности и/или экспрессии гена hTERT исследовались образцы, полученные при ТАБ щитовидной железы [Trulsson LM et al., 2003]. Однако результаты исследований показали довольно низкую чувствительность используемых методов (от 40 до 80%), возможно, из-за низкого качества образцов.
Метод пункционной гистобиопсии щитовидной железы, позволяющий получить достаточное количество материала удовлетворительного качества, не изучался в комбинации с молекулярно-генетическим исследованием, которое потенциально может повысить диагностическую ценность метода.
Цель исследования.
Улучшить результаты лечения больных объемными образованиями щитовидной железы за счет внедрения новых методов комплексной дифференциальной диагностики рака и доброкачественных образований щитовидной железы на дооперационном этапе.
Задачи исследования.
-
Разработать технологию и определить клиническую ценность пункционной гистобиопсии объемных образований щитовидной железы под ультразвуковым контролем, а также оценить возможность использования тканевого материала, получаемого при пункционной гистобиопсии щитовидной железы, для проведения молекулярно-генетического анализа.
-
Определить качественные и количественные показатели теломеразной активности, а также достоверность их различий, для различных гистологических типов ткани узловых образований щитовидной железы.
-
Апробировать технологию определения активности теломеразы в образцах ткани, полученных при пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы.
-
Определить клиническую ценность исследования теломеразной активности в образцах, полученных при пункционной гистобиопсии, для предоперационной дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных образований щитовидной железы.
Научная новизна.
-
Разработана методика пункционной гистобиопсии щитовидной железы под ультразвуковым контролем, адаптированная к получению образцов ткани оптимального качества для последующего проведения молекулярно-генетического исследования; показаны достаточная точность метода при взятии образца и высокое качество получаемого материала, а также более высокие чувствительность и специфичность метода, в сравнении с ТАБ щитовидной железы.
-
Впервые в мировой практике изучена теломеразная активность в образцах, полученных при пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы; при этом также впервые показана возможность максимально точной оценки наличия и уровня теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы уже на дооперационном этапе.
-
Определены клиническая ценность и показания к выполнению пункционной гистобиопсии щитовидной железы в комбинации с исследованием наличия и уровня теломеразной активности при дифференциальной диагностике злокачественного поражения щитовидной железы на дооперационном этапе.
Практическая значимость.
Разработанный метод пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы обладает высокой эффективностью и позволяет получить материал адекватного качества и количества для применения наиболее современных диагностических методик, в том числе молекулярно-генетического анализа
Исследование теломеразной активности в образцах, полученных при пункционной гистобиопсии узловых образований щитовидной железы обладает высокой клинической ценностью и может применяться в качестве дополнительного диагностического инструмента в предоперационной диагностике узловых образований щитовидной железы
Использование комбинации методов пункционной гистобиопсии и исследования теломеразной активности позволяет выделить группу пациентов с высоким риском наличия злокачественного поражения и получить дополнительные диагностические данные для определения показаний к оперативному вмешательству на щитовидной железе и его предполагаемого объема.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработанная технология пункционной гистобиопсии щитовидной железы является безопасным и эффективным методом предоперационной диагностики узловых образований щитовидной железы. Показатели точности этого метода превышают таковые для традиционных методов предоперационной морфологической диагностики (ТАБ), а получаемый тканевой материал по своим количественным и качественным показателям оптимален для проведения молекулярно-генетического анализа, в том числе для анализа теломеразной активности неизотопным методом TRAP.
-
Уровень и частота выявления теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы достоверно выше (p<0,005) при наличии очагов злокачественного роста либо участков лимфоидной инфильтрации в ткани (с образованием лимфоидных фолликулов).
-
Высокий уровень теломеразной активности не характерен для ткани доброкачественных узловых образований щитовидной железы, однако качественные и количественные показатели теломеразной активности возрастают при переходе от группы коллоидного зоба к истинным доброкачественным опухолям, что позволяет предположительно рассматривать теломеразу как маркер, характеризующий пролиферативную активность в ткани узлового образования щитовидной железы.
-
Принципиально возможно точное определение теломеразной активности в ткани узловых образований щитовидной железы уже на дооперационном этапе. Использование для этой цели образцов, полученных при пункционной гистобиопсии щитовидной железы, позволяет производить оценку данного показателя с не меньшей достоверностью, чем при анализе образцов, полученных интраоперационно, и позволяет в целом повысить точность предоперационной дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы.
Внедрение: Полученные результаты внедрены, используются и развиваются в Клинике Факультетской Хирургии им. Н.Н.Бурденко ММА им. И.М.Сеченова.
Апробация диссертации.
Основные положения диссертации доложены:
На XVIII Российском симпозиуме с международным участием «Современные аспекты хирургической эндокринологии» (Ижевск, 9-11 сентября 2009 года).
На научной конференции кафедры факультетской хирургии №1 лечебного факультета и Клиники факультетской хирургии им. Н.Н.Бурденко Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова 28 сентября 2009г.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 4 в центральной медицинской печати, 1 в зарубежной медицинской печати
Объем и структура: Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 12 рисунками, 7 диаграммами. Список литературы содержит 50 отечественных источников и 101 иностранный источник.
В исследование вошло 53 пациента с диагнозом узлового или многоузлового эутиреоидого зоба, находившихся на обследовании и лечении в Факультетской хирургической клинике ММА им. И.М. Сеченова с декабря 2005 по ноябрь 2009 года. Среди пациентов, включенных в исследование, было 8 мужчин (29-54 года, средний возраст 39 лет), 45 женщин (24-74 лет, средний возраст 49 лет).
Всем пациентам был проведен стандартный набор диагностических процедур, включавших: клинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, электрокардиографию, исследование уровня гормонов щитовидной железы (уровень Т3, Т4, ТТГ, АТ к ТПО), ультразвуковое исследование (УЗИ) щитовидной железы, пункционную тонкоигольную аспирационную биопсию (ТАБ) узлового образования (образований) щитовидной железы под контролем УЗИ, при необходимости – сцинтиграфию щитовидной железы.
Всем пациентам, включенным в исследование, было выполнено оперативное вмешательство на щитовидной железе. Во всех случаях вмешательство выполнялось по стандартной методике. Объем вмешательства (резекция доли железы, гемитиреоидэктомия, тиреоидэктомия) определялся в соответствии с данными предоперационного обследования и, при необходимости, с интраоперационной картиной.
При получении результатов послеоперационного патогистологического исследования ткани узла щитовидной железы, определявшего окончательный диагноз, были выделены группы пациентов, в зависимости от вариантов гистологического строения узла. Были выделены группы злокачественного поражения щитовидной железы (9 пациентов) и доброкачественных вариантов строения узлов (46 человек) (табл. 1)
Таблица №1
Распределение пациентов по вариантам гистологического строения узловых образований щитовидной железы
29 пациентам, включенным в исследование, на дооперационном этапе была выполнена пункционная гистобиопсия узлового образования (образований) щитовидной железы под контролем УЗИ.
Для выполнения манипуляции использовали биопсийные иглы системы QuickCore (COOK Medical ApS, Дания). Для осуществления визуального ультразвукового контроля за проведением биопсии использовали цифровой ультразвуковой сканер (рис. 5.) Mindray DP-3300 (Mindray, Китай), с линейным датчиком (длина датчика 4,5 см, частота 10 МГц, В-режим).
Для выполнения гистобиопсии щитовидной железы использовали иглы со следующими параметрами: длина рабочей части – 6 см, размер биопсийной камеры – 10 мм, толщина иглы – 18 Gauge или 20 Gauge. Для узлов малого диаметра (до 15-20 мм), с целью уменьшения возможности их смещения и облегчения проведения манипуляции, преимущественно применяли иглы с диаметром 20 Gauge. Более толстые иглы 18 Gauge применяли для узлов более 15-20 мм в диаметре.
В случае многоузлового поражения, при необходимости проводили биопсию каждого отдельного узла (при условии, что минимальные размеры узла удовлетворяли критериям необходимого размера). При этом в учетной электронной карте пациента фиксировали местоположение каждого узла, из которого была взята биопсия, с указанием доли, ее участка, а также, при необходимости, взаиморасположение других узлов.
Полученный образец ткани разделяли на 2 части, одну из которых направляли для выполнения морфологического исследования (цитологическое исследование мазков-отпечатков), а другую использовали для определения активности теломеразы в ткани.
При оценке клинической ценности пункционной гистобиопсии при ее сравнении с ТАБ щитовидной железы определялась безопасность методики, сравнение чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предиктивной оценки (на наличие злокачественного процесса) методов гистобиопсии и ТАБ, вычисленных по стандартным методикам.
При проведении оперативного вмешательства у пациентов, также выполняли забор части узлового образования для последующего определения теломеразной активности. Общий объем получаемой ткани из одного узла составлял 20-30 мкл. В случае многоузлового поражения, образец ткани иссекали из узлов, подвергнутых ранее биопсии, в соответствии с данными в электронной учетной карте пациента. В случае, когда гистобиопсия пациенту не проводилась, выполняли забор ткани из каждого узла. В последующем все участки забора ткани маркировали для возможности их идентификации патоморфологом и получения максимально точного патогистологического заключения.
Полученные образцы ткани (биопсийные и интраоперационные) помещали в отдельные для каждого образца промаркированные криопробирки Greiner BioOne объемом 2 мл (Greiner, USA) и немедленно замораживали в жидком азоте при температуре -170 С, где хранили их до обработки.
В работе использовали метод определения теломеразной активности TRAP (telomeric repeat amplification protocol) [Kim NW et al,, 1994]. Применяли модифицированный вариант метода, с неизотопной детекцией продуктов реакции [А.И. Глухов и соавт., 1998]
Полученные данные о наличии теломеразной активности оценивали качественно (в градации положительный-отрицательный) и полуколичественно, с использованием пакета программного обеспечения ImageJ версии 1.35I. При качественной оценке определяли наличие или отсутствие специфической «лестницы» продуктов TRAP в геле. Положительным считали результат, когда в геле четко визуализировались первые 4-5 полос, соответствующих продуктам с длиной, кратной 6. (рис.11). В случаях, если визуализировалась только первая полоса, либо определялись «пропуски» в нормальном ходе следования полос (неспецифическая картина), а также при полном отсутствии продуктов реакции результат реакции считали отрицательным (рис. 1)
Рис.№1. Картина электрофореза ПЦР-продуктов TRAP-анализа. (дорожки соответствуют: 1 – неспецифическая картина, отсутствие четких последовательных полос (расценивается, как отрицательный результат анализа), 2 – отрицательный результат, 3 – положительный результат. Электрофорез в полиакриламидном геле. Окраска SYBR-GOLD)
Статистические методы изучения достоверности результатов. Накопление и корректировка полученных данных проводились с помощью стандартного пакета программ Microsoft Office Access 2003 for Windows. После группировки пациентов по вариантам гистологического строения узлов щитовидной железы, проводили расчет чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предиктивной оценки (на выявление злокачественного новообразования) изучаемых методик (гистобиопсия щитовидной железы, определение теломеразной активности), а также выполняли сравнение указанных показателей с таковыми, вычисленными для стандартных диагностических методов (ТАБ щитовидной железы).
При получении результатов полуколичественного определения уровня теломеразной активности, выполняли расчет статистических показателей в программной среде Statistica версии 7.0 (StatSoft), с использованием непараметрического U-критерия (тест Mann-Whitney). Критический уровень показателя Р при вычислении достоверности различий принимали менее 0,005.
Отдельно выполняли сравнение наличия и уровня теломеразной активности в парах «биопсийный образец-интраоперационный образец», полученных от каждого отдельного пациента, для определения возможной степени точности предоперационной оценки уровня теломеразной активности в ткани узла щитовидной железы.
