Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Поллинозы и продукты комплекса HLA 11
1.1. Эпидемиология и особенности клинического течения поллинозов 11
1.2. Генетические маркеры и прогнозирование поллинозов 19
1.3. Учение о системе HLA (состояние проблемы) 24
1.3.1. Роль системы HLA в организме человека 27
1.3.2. Связь продуктов HLA с заболеваниями 29
1.3.3. Система HLA и поллинозы 31
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Клиническая характеристика больных поллинозами 37
2.2. Лабораторная диагностика поллинозов 43
2.3. Методика ДНК-типирования генов HLA класса II 44
Глава 3. Аллельный полиморфизм генов HLA при поллинозах 49
3.1. Распределение аллелей HLA класса II у больных поллинозами 50
3.2. Половая рестрикция аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных поллинозами 59
3.3. Возрастная рестрикция аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных поллинозами 76
Глава 4. Сравнительный анализ маркерных специфичностей HLA аллергического ринита и бронхиальной астмы 82
4.1. Особенности полиморфизма аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных аллергическим ринитом 82
4.2. Особенности полиморфизма аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных бронхиальной астмой 94
4.3. Сравнительный анализ маркерных специфичностей HLA аллергического ринита и бронхиальной астмы из числа аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 107
Заключение 113
Выводы 128
Практические рекомендации 130
Литература 131
- Генетические маркеры и прогнозирование поллинозов
- Клиническая характеристика больных поллинозами
- Половая рестрикция аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных поллинозами
- Особенности полиморфизма аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных бронхиальной астмой
Введение к работе
Актуальность проблемы
На рубеже XXI века рост распространенности аллергии в мире стал глобальной медико-социальной проблемой. Сегодня аллергические заболевания занимают ведущее место среди других патологических состояний и оказывают существенное влияние на здоровье и качество жизни населения развивающихся и развитых стран [J. Daniels, 2002; Г.Б. Федосеев с соавт., 2003; M. Masoli et al., 2004; W.J. Fokkens and C.M. Van Drunen, 2006; P.W. Hellings et al., 2006; А.Г. Чучалин с соавт., 2007; А.А. Баранов с соавт., 2008; М.Ю. Гущин с соавт., 2010].
Мировая статистика свидетельствует, что от 10 до 25% городского и сельского населения, проживающего в странах с высокоразвитой экономикой, страдает аллергическими заболеваниями [A.B. Kay, 2001; D.L. Hamilos, 2010]. Согласно данным Европейской белой книги аллергии (European allergy white paper), сегодня каждый третий ребенок в странах Европы страдает аллергией, а каждый десятый - бронхиальной астмой (БА) [С.Ф. Гладков и Н.К. Перевощикова, 2010].
В различных регионах Российской Федерации распространенность аллергических заболеваний колеблется от 15 до 35% [Л.А. Горячкина, 2004; Н.И. Ильина, 2004; Д.А. Безрукова, 2007; М.Ф. Балдуева, 2007; И.В. Маругин с соавт., 2009]. Высокий уровень заболеваемости аллергической патологией во многих странах мира послужил поводом для включения руководством ВОЗ в 1999 году аллергии и БА в число приоритетных медицинских проблем человечества на ближайшие 10 лет.
В настоящее время наследственный фактор рассматривается как основополагающий в формировании поллинозов, а поиск генов, маркирующих предрасположенность к развитию БА, Международный консенсус по бронхиальной астме определяет как одно из приоритетных направлений мировых научных исследований.
Открытие одной из самых полиморфных генетических систем человеческого организма – системы HLA и последующие плодотворные исследования в этой области показали тесную взаимосвязь продуктов HLA с заболеваниями и возможность их использования в качестве генетических маркеров предрасположенности или резистентности к той или иной патологии [L.P. Alekseev, 1999; D.A. Brewerton, 2003; А.А. Баранов с соавт., 2003; Б.Н. Левитан и Е.А. Попов, 2004].
Однако в клинической аллергологии работ, направленных на поиск иммуногенетических маркеров предрасположенности и резистентности к развитию того или иного аллергического заболевания, крайне мало, данные их весьма противоречивы. Актуальным представляется не только выяснение механизма ассоциаций между поллинозами и генами HLA, но и разработка прогностического сценария для данной группы больных. До сих пор остается неизвестным, почему у одних пациентов проявления поллиноза ограничиваются клиникой аллергического ринита (АР), а у других больных развивается БА.
Цель исследования
Усовершенствовать методы диагностики и прогнозирования поллинозов на основе изучения особенностей распределения генов HLA класса II у больных аллергическим ринитом и аллергической формой бронхиальной астмы.
Задачи исследования
1. Исследовать аллельный полиморфизм генов HLA класса II локусов DR и DQ у больных поллинозами в популяции русских астраханской геногеографической зоны
2. Изучить возможную половую и возрастную рестрикцию аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных поллинозами
3. Установить маркеры повышенного риска развития и предикторы аллергического ринита и аллергической формы бронхиальной астмы из числа аллельных вариантов генов HLA класса II локусов DR и DQ и их гаплотипов
4. Провести сравнительный анализ маркерных специфичностей HLA аллергического ринита и аллергической формы бронхиальной астмы из числа аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1
5. Оценить возможности метода HLA-типирования у пациентов с аллергическим ринитом и аллергической формой бронхиальной астмы для разработки индивидуальных прогностических сценариев характера течения поллиноза
Положения, выносимые на защиту
1. При поллинозах имеются ассоциативные связи с генами HLA класса II, что является прямым доказательством непосредственного участия иммунной системы в формировании предрасположенности и резистентности к аллергическому риниту и аллергической форме бронхиальной астмы
2. Предрасположенность и резистентность к развитию поллинозов генетически детерминированы и маркируются определенным набором аллелей HLA класса II, а также их гаплотипическими сочетаниями
3. Маркерные специфичности поллинозов из числа генов HLA класса II локусов DR и DQ обладают половой и возрастной рестрикцией
4. Особенности HLA-фенотипа больных могут быть использованы в качестве дополнительного критерия для разработки долгосрочного индивидуального прогноза возможных сценариев клинического течения поллинозов
5. Метод молекулярного HLA-типирования может быть использован для оценки степени риска развития аллергической формы бронхиальной астмы у пациентов, страдающих аллергическим ринитом
Научная новизна
Получены новые данные о характере ассоциативных связей генов HLA с риском развития поллинозов на примере русской популяции астраханской геногеографической зоны. Подтвержден факт существования прямого контроля со стороны иммунной системы за развитием и характером клинического течения поллинозов. Впервые установлено наличие половой и возрастной рестрикции иммуногенетических маркеров поллинозов из числа аллелей генов DRB1 и DQB1.
Впервые в отечественной практике с помощью метода полимеразой цепной реакции установлены неизвестные ранее ассоциации аллельных вариантов генов HLA II класса DRB1 и DQB1 с предрасположенностью и резистентностью к развитию поллинозов.
Впервые установлены маркеры повышенного риска развития и маркеры резистентности к развитию аллергического ринита и аллергической формы бронхиальной астмы из числа специфичностей HLA класса II локусов DR, DQ и их гаплотипов в популяции русских астраханской геногеографической зоны.
Разработаны новые дополнительные иммуногенетические критерии для прогнозирования и оценки степени риска развития аллергической формы БА у пациентов, страдающих АР.
Практическая ценность исследования
Результаты исследования расширяют возможности диагностики, дифференциальной диагностики и долгосрочного прогнозирования поллинозов в клинике внутренних болезней и аллергологии, в частности.
Полученные данные могут быть использованы в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска развития поллинозов среди здорового населения, а также групп высокого риска развития аллергической формы БА у больных АР.
Метод молекулярного HLA-типирования целесообразно использовать для разработки сценариев долговременного индивидуального прогноза возможных вариантов течения поллинозов, в частности, для оценки степени риска развития БА у пациентов, страдающих АР.
Внедрение результатов исследования
Полученные при выполнении диссертационного исследования результаты внедрены в практику пульмонологического отделения и консультативной поликлиники ГУЗ «Александро-Мариинская областная клиническая больница» г. Астрахани. Основные положения работы используются в научно-педагогической деятельности кафедры факультетской терапии и профессиональных болезней с курсом последипломного образования и кафедры поликлинического дела и скорой медицинской помощи Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.
Выводы диссертации включены в лекционный материал по темам «Аллергические заболевания» и «Бронхиальная астма», в план семинарских занятий со студентами, интернами, клиническими ординаторами и курсантами на указанных кафедрах АГМА. Материалы работы включены в методические рекомендации и практические руководства для врачей терапевтического профиля.
Апробация диссертации и публикации
Основные положения диссертации были представлены и обсуждены на XIV Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (17-20 октября 2009 г., Тель-Авив, Израиль), на Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (25-26 февраля 2010 г., Москва), на итоговых научно-практических конференциях сотрудников Астраханской государственной медицинской академии (2008, 2009), научных конференциях молодых ученых Астраханской государственной медицинской академии (2007, 2009), на заседаниях Астраханского областного научного общества терапевтов (2008, 2009).
Работа апробирована на межкафедральной конференции с участием кафедр АГМА и врачей АМОКБ г. Астрахани. По материалам диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 7 публикаций в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора, 4 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 305 работ. Список литературы включает в себя 134 отечественных и 171 зарубежный первоисточник. Работа иллюстрирована 24 таблицами, 6 рисунками и 8 клиническими примерами. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Астраханской государственной медицинской академии.
Генетические маркеры и прогнозирование поллинозов
Факторами, способствующими развитию у человека поллиноза, являются:
I. Генетические факторы:
1. Отягощенная наследственность
2. Высокий уровень в крови общего и специфического иммуноглобулина Е
3. Мужской пол
4. Низкий вес при рождении у детей П. Внешнесредовые факторы:
1. Табакокурение
2. Высокая концентрация аэроаллергенов (пыльцевых аллергенов)
3. Частые респираторно-вирусные инфекции
4. Паразитарные инфекции
5. Промышленные и бытовые поллютанты (окись, азота, диоксид серы, озон, твердые частицы и др.) [36, 84, 145,223].
На показатели распространенности поллинозов существенное влияние оказывают природно-климатические и экологические факторы, этнографические особенности, социально-экономический статус семьи, а также критерии лабораторной диагностики и методология эпидемиологических популяционных исследований. Внешние факторы модифицируют вероятность развития, поллинозов у предрасположенных к. этому людей, в результате чего происходит сенсибилизация организма и развитие заболевания [36, 39, 69, 78, 80, 117, 199].
Наследственная отягощенность при аллергических заболеваниях выявляется у 48-68,8% больных. Так, если оба родителя ребенка болеют БА, то вероятность развития у него астмы превышает 60%о [113]. По данным В. Lundback (1998), взрослые, имеющие наследственную предрасположенность к Б А или АР, обладают 3-4-х кратным риском по астме и 2-6-ти кратным риском по риниту по сравнению с пациентами, не имеющими такой наследственности [232].
Несмотря на значительные усилия, предпринятые учеными за последние 25-30 лет в исследовании наследственности при поллинозах, четкого представления о генетике АР и БА пока еще не выработано. Вместе с тем, получены результаты, достаточно хорошо ассоциированные с современными взглядами на механизмы развития поллинозов: С позиций генетики, в настоящее время БА рассматривается как мультифакториальное полигенное заболевание, передача которого потомству осуществляется группой генов [153].
Последние научные данные свидетельствуют о том, что уровень специфического IgE, уровень общего IgE и наличие гиперреактивности бронхов (ГРБ) при астме наследуются независимо друг от друга. Исследование механизмов их наследования выявило несколько основных классов генов, связанных с атопией. Их можно разделить на 3 группы: 1-я группа - гены, ассоциированные с выработкой специфических IgE антител по отношению к различным, конкретным аллергенам; 2-я группа - гены, определяющие продукцию общего IgE (базаль-ный уровень IgE) и 3-я группа - гены, связанные с конкретным аллергическим заболеванием (ринитом, астмой, атопическим дерматитом и т.д.) [15].
В 80 - 90-х годах XX века были проведены многочисленные исследования с использованием метода ПЦР в целях позиционного клонирования и изучения генов-кандидатов. Позиционное клонирование представляет собой исследование сцепления фенотипа болезни с известными маркерами в геноме человека: При изучении генов-кандидатов выбирают ген, чей продукт вовлечен в патогенез заболевания, и изучают сцепление его различных аллелей с фенотипом заболевания. Так, при изучении фенотипа БА основными характеристиками являются атопия, ГРБ, эозинофилия и увеличение уровня IgE, как результат взаимодействия множественных генных вариант [75].
В результате проведенных полногеномных исследований в репрезентативных выборках пациентов, страдающих различными формами атопии, были определены следующие кандидатные участки хромосом: 1р31, 1р32, 1р36, 2ql4, 2q21-31, 3q32, Зр24.2-22, 4q35, 5р12, 5q23-33, 6р21.3-23, 7р14-15, 7q, ПрІЗ, llql3, llql5, llq21-23, 12ql3-24, 13q31, 14q, 16q21, 16q23, 17pll.1-11.2, 17ql2-21, 19ql3, 20ql3, 21q21 [171, 194, 267]. Исследования последних лет показали, что при формировании БА генетические факторы оказывают наибольшее влияние на синтез общего и специфических IgE, продукцию противовоспалительных цитокинов, развитие ГРБ, экспрессию рецепторов- IgE на иммунокомпе-тентных клетках, а также на р2-адренорецепторный полиморфизм [75].
Многочисленными работами D.G. Marsh et al. (1995-2003) доказано; что продукция специфических IgE-антител контролируется классическими генами иммунного ответа - Ir-генами. Генетический контроль базального уровня общего IgE осуществляется кластером генов, локализованных на длинном плече 5-ой хромосомы. В работах последних лет показана ассоциация уровня общего IgE с полиморфными маркерами области 5q31.1, в том числе с маркерами, локализо-ванными.внутри гена интерлейкина-4 (IL-4) и рядом с ним. При этом маркеры вне региона 5q31.1 не выявляют ассоциации с уровнем общего IgE. Кроме того, в регионе 5q31.1 находится еще несколько генов, имеющих отношение к механизмам развития аллергии и астмы. Это гены IL-13, IL-5, IRFI (ген фактора регуляции интерферона 1), CSF2 (ген, кодирующий грануло-моноцитарный коло-ниестимулирующий фактор) и IL-3 [155, 213, 236, 237, 239, 241].
Бронхиальная гиперреактивность связана с генетическими маркерами сегмента 5 хромосомы 5q31.1-q33, что указывает на возможность сочетанного наследования предрасположенности к ней и к повышенному уровню общего IgE при БА. Ген, ответственный за ГРБ, локализован вблизи главного локуса регуляции общего уровня IgE. Кроме того, на достаточно ограниченном участке 5q31.1-q33 (кроме упомянутого выше кластера генов IL-4) расположены следующие гены: ген IL-9, который активирует тучные клетки, и ген ADRB2, кодирующий р2-адренорецептор. Высказывается предположение о роли в развитии БА генного локуса, кодирующего р2-адренорецептор. Кроме того, доказано, что предрасположенность к ГРБ и атопии наследуются независимо друг от друга, однако при их сочетании резко увеличивается риск развития БА [75].
В качестве генетических маркеров высокого риска развития поллинозов у негров - жителей острова Барбадоса (Карибы) К.С. Barnes et al. (1999) постулируют гены IFNG (маркер БА) и IFNGCA и D12S313 (маркеры АР), расположенные в регионе 12-q23.3 на хромосоме 12q [152].
К активному поиску генетических маркеров поллинозов и разработке на их основе прогностических сценариев за последние 10 лет активно подключились и отечественные ученые [7, 105, 111, 123, 130,277].
Так, по данным Б.А. Федосеева с соавт. (2003), важным наследственным фактором предрасположенности к атопии (в частности, к БА) является полиморфизм цитокиновых генов IL5 (аллель -703Т), IL4 (аллель -590Т), IL4RA (аллель 576R) и TNFA (аллель -308А). Кроме того, факторами повышенного риска развития БА могут быть определенные аллели генов NO-синтаз (NOS3 и NOS1), а также их сочетания с некоторыми аллелями гена каталазы (CAT). Авторами предложен алгоритм генетического тестирования наследственной предрасположенности к БА у новорожденных в семьях высокого риска [114, 116] .
В качестве одного из главных генов-кандидатов, маркирующих характер течения и степень тяжести БА, некоторыми авторами рассматривается позици-онно-клонированный ген ADAM33 (A Disintegrin and Metalloprotease 33) [217].
Для оценки риска развития астмы B.C. Баранов с соавт. (2000) и предложили использовать исследование полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и GSTT1. Делеция (носительство «нулевых» аллелей) в одном из этих генов обнаружена более чем у 90% больных БА, причем частота гомозигот по «нулевым» аллелям двух генов (GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0) в группе больных БА составляет около 60%, тогда как в контроле - 9%. Определение делеций генов GSTM1 и GSTT1 авторы рекомендуют для определения риска развития астмы, в первую очередь, у родственников больных БА и лиц, профессионально связанных с повышенной антигенной нагрузкой [15].
Клиническая характеристика больных поллинозами
Для решения вопроса о возможном влиянии генетических факторов, связанных с системой HLA, на восприимчивость или резистентность к развитию поллинозов за период с 2004 по 2009 г.г. нами проведено исследование иммуногенетического статуса у 61 человека в популяции русских астраханской геногеографической зоны, находившихся за указанный период времени на обследовании и лечении в пульмонологическом отделении ГУЗ «Александро-Мариинская областная клиническая больница» с диагнозом аллергического ринита (АР) или аллергической формы бронхиальной астмы (АФБА).
Исследование проводилось с соблюдением принципов добровольного согласия пациентов и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 №2288). Проведение настоящего клинического исследования одобрено Этическим комитетом ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ (заседание Этического комитета АГМА от 23.03.2011, протокол №5).
На каждого больного поллинозом заполнялась тематическая карта обследования, которая включала следующие разделы:
- паспортная часть;
- развернутый клинический диагноз основного заболевания;
- сопутствующие заболевания;
- наследственность;
- аллергологический анамнез;
- история настоящего заболевания;
- история жизни пациента;
- жалобы (с использованием клинического опросника);
- данные объективного осмотра по органам и системам;
- результаты лабораторных и инструментальных исследований;
-лечение в динамике заболевания.
Клинико-лабораторное обследование пациентов проводилось как в период обострения основного заболевания в условиях пульмонологического отделения ГУЗ АМОКБ, так и в период ремиссии поллиноза в амбулаторных условиях на базе консультативной поликлиники ГУЗ АМОКБ. Аллергологическое обследование (проведение скарификационных кожных тестов с аллергенами и определение уровня общего IgE) осуществлялось только в период ремиссии поллиноза в амбулаторных условиях силами сотрудников кафедры факультетской терапии и профессиональных болезней с курсом последипломного образования.
Развернутый клинический диагноз заболевания ставился на основании жалобу анамнеза, физикальных данных, результатов лабораторных и инструментальных методов обследования, в частности, результатов скарификационных кожных тестов. Анализировалась также медицинская документация- (клинические истории, болезни, листы назначения, амбулаторные карты и т.д.);
При постановке заключительного клинического диагноза использованы общепринятые в настоящее время в клинической аллергологии классификации аллергического ринита.(ARIA, 2001) и бронхиальной, астмы (GINA, 2006) [36 77, 78 141]. Стандартные формулировки: диагноза отдельных клинических ва-т риантов поллинозов представлены ниже:
1. Аллергический ринит, интермиттирующая форма, средней степени тяжести. Аллергический конъюнктивит. Пыльцевая аллергия. Сенсибилизация к аллергенам из пыльцы.конопли и лебеды.
2. Бронхиальная астма, аллергическая.форма, легкое персистирующее течение; Аллергический ринит, персистирующая форма, средней степени тяжести. Аллергический конъюнктивит. Пыльцевая аллергия, перекрестная пищевая аллергия. Сенсибилизация к аллергенам из пыльцы полыни, подсолнечника, лебеды, циклахены.
3. Бронхиальная астма, аллергическая форма, средней степени тяжести, интермиттирующее течение. Аллергический ринит, персисистируїощая форма, средней степени тяжести. Аллергический конъюнктивит. Пыльцевая аллергия, перекрестная пищевая аллергия. Сенсибилизация к аллергенам из пыльцы тимофеевки. Контактный.дерматит на металлы.
Диагноз БА пациентам выставлялся на основании критериев GINA, с учетом рекомендаций материалов «Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы» под редакцией А.Г. Чучалина (2007) [36]. Учитывались жалобы (частота приступов удушья, кашель, одышка), данные анамнеза, а также результаты двукратной спирографии (при поступлении и перед выпиской) и пикфлоуметрии, проводившейся больным два раза в день.
Распределение больных, вошедших в анализируемую выборку, с учетом характера и тяжести течения АР и БА представлено в таблице 1.
В группе больных АР интермиттирующее течение диагностировано у 6 человек (19,4% ), персистиругощее - у 25 человек (80,6%). У 9 больных (29,0%) АР в период обострения протекал в легкой форме, у 19 пациентов (61,3%) установлен АР средней степени тяжести. У 3-х больных АР диагностировано тяжелое течение персистирующей формы заболевания.
У 11 из 30 больных аллергической формой БА (33,3%) отмечалось интер-миттирующее течение патологического процесса, у 15 человек - легкое перси-стирующее течение и у 4 человек - течение средней тяжести астмы.
В общую анализируемую выборку «поллинозы» вошли 23 мужчины (37,7%) и 38 женщин (62,3%). Соотношение лиц мужского и женского пола в исследуемой группе пациентов составило 1: 1,65.
Возраст больных на момент включения их в исследование колебался от 18 лет до 71 года: у мужчин - от 19 лет до 71 года, у женщин - от 18 до 65 лет. Средний возраст пациентов на момент включения их в группу наблюдения составил 34,52 ± 0,72 года: у мужчин - 35,18 ± 1,43 года, у женщин - 33,43 ± 1,38 года и, таким образом, практически не имел тендерных отличий.
Возраст пациентов в общей группе «поллинозы» на момент появления первых клинических признаков заболевания колебался от 1 года-до 64 лет: у мужчин - от 5 лет до 64 лет, у женщин - от 1 года до 33 лет. Средний возраст пациентов в дебюте заболевания составил 17,36 ± 1,24 года: у мужчин - 18,04 ± 1,35 года, у женщин - 16,95 ±1,19 года. Таким образом, сроки начала заболевания в выборке практически не зависели от пола.
Длительность заболевания от появления первых клинических признаков респираторной аллергии до включения больных в группу наблюдения, колебалась от 3 до 48 лет: у мужчин - от 3 до 30 лет, у женщин - от 4 до 48 лет. Средний стаж заболевания пациентов в общей выборке «поллинозы» составил 16,67 ± 1,28 года: у мужчин - 14,96 ±1,18 года, у женщин - 17,71 ± 1,21 года. Таким образом, средняя длительность заболевания имела минимальные тендерные отличия и была статистически недостоверной (17,71 14,96; р 0,05).
Из 61 больного поллинозом ранее обращались к врачу 20 человек (32,8%): обследовались у аллерголога 11 пациентов (18,0%), у терапевта - 9 пациентов (14,8%). Примечательно, что 41 человек (67,2%) ранее не обращался к врачу с симптомами поллиноза. Из них самолечением занимались 37 человек (60,7%); 12 больных (19,7%) лечились, следуя советам родственников и знакомых.
У 16 из 30 больных БА (53,3%) диагноз был установлен впервые после обследования у аллерголога в рамках выполнения настоящего исследования.
С целью реализации одной из поставленных задач исследования (изучить возможную половую и возрастную рестрикцию аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных поллинозами) все вошедшие в исследование больные были разделены на две анализируемые выборки в зависимости от клинического варианта поллиноза. В 1-ую группу был объединен 31 больной с диагнозом аллергического ринита. Во 2-ую группу вошли 30 пациентов, у которых по результатам клинико-лабораторного обследования была диагностирована АФБА.
Распределение больных по полу и возрасту в дебюте заболевания в зависимости от клинического варианта поллиноза представлено в таблице 2.
Половая рестрикция аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных поллинозами
По данным мировой научной литературы, характер ассоциативных связей между продуктами комплекса HLA и болезнями может зависеть не только от однородности исследуемых популяционных групп населения по конкретной нозологической форме или клиническому варианту полиэтиологического заболевания, но и от популяционных характеристик анализируемой выборки: этнической принадлежности пациентов, их пола, возраста в дебюте заболевания и т.д. [25, 74, 94, 103].
В силу вышеизложенного, нами было решено провести поиск иммуногене-тических маркеров поллинозов в зависимости от пола, вошедших в анализируемую выбору больных. На первом этапе распределение генов HLA локусов DR и DQ определялось у 23 больных поллинозами мужчин (таблица 7).
Уровень регистрации ряда специфичностей HLA локусов DR и DQ в группе мужчин, страдающих поллинозами, практически не отличался от аналогичных показателей как в контроле-1, так и в контроле-2 (DRB1 04; DRB 1 10; DQB1 0303; DQB1 0304). Для большинства специфичностей HLA эти частотные изменения между выборками были незначительными и составили не более 3-6% (DRB1 01; DRB 1 15(02); DRB1 17(03); DRB1 09; DQB1 0302).
Вместе с тем, в группе мужчин с поллинозами, для некоторых аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 нами установлены значимые изменения частотных характеристик как в сторону их увеличения, так и в сторону их снижения как по сравнению с аналогичными показателями в обеих группах контроля, так и по сравнению с одним из контролен.
Так, в группе мужчин, больных поллинозами, зафиксировано значительное повышение уровня типирования следующих аллелей HLA локусов DR и DQ:
- группы аллелей DRB1 08 до 26,1% против 3,3% в контроле-1 и 4,3% в кон-троле-2;
- аллеля DQB1 0401/02 до 17,4% против 3,3% в контроле-1 и 4,3% в контроле-2;
- аллеля DQB1 05 до 43,5% против 22,3% в контроле-2;
- гомозиготного носительства аллелей HLA гена DQB1 (DQBl x) до 43,5% против 21,3% в контроле-1.
Кроме того, в группе больных поллинозами мужчин установлено значительное снижение частоты регистрации следующих специфичностей HLA:
- группы аллелей DRB 1 16(02) до 4,3% против 12,7% в контроле-1;
- группы аллелей DRB1 13(06) до 8,7% против 25,7% в контроле-1 и 38,3% в контроле-2;
- группы аллелей DRB1 07 до 13,0% против 26,0% в контроле-1 и 31,9% в контроле-2;
- аллеля DQB 1 0201 до 21,7% против 33,7% в контроле-1 и 41,5% в контроле-2;
- аллеля DQB1 0301 до 17,4% против 39,3% в контроле-1 и 52,1% в контроле-2;
- аллеля DQB 1 0302 до 8,7% против 15,7% в контроле-1 и 12,8% в контроле-2.
Для анализа силы и направленности изменений для каждого аллеля HLA, уровень которого у больных поллинозами мужчин отличался от такового в кон-тролях, определялись степень достоверности х2 и показатели относительного риска (RR), этиологической (EF) и превентивной (PF) фракции (таблица 8).
В группе мужчин, больных поллинозами, зарегистрировано статистически значимое повышение уровня регистрации группы аллелей HLA-DRB1 08 до 26,1% против 3,3% в контроле-1 (х2=18,906; р 0,0005; рс 0,025) и 4,3% в контроле-2 (%2=8,648; р 0,005; рс 0,05). Высокие цифры относительного риска (RRi=10,28 и RR2=7,47) и весьма значимые показатели этиологической фракции (EF]=0,24 и EF2=0,23) указывают на первичный характер установленных ассоциаций между наличием в HLA-фенотипе индивидуума группы аллелей HLA-DRB1 08 и фактом наличия у мужчин такого заболевания, как поллиноз.
Статистически достоверным у мужчин, больных поллинозами, явилось снижение уровня регистрации группы аллелей HLA-DRB 1 13(06) до 8,7% случаев против 25,7%о контроле-1 (х2=4,312; р 0,05) и 38,3% в контроле-2 (Х2=8,798; р 0,005; рс 0,05). Установленные изменения сопровождались достаточно значимыми показателями риска отношений (RR]=0,34 и RR2=0,19) и, особенно, превентивной фракции (PF[=0,22 и PF2=0,28), что указывает на первичный характер установленной ассоциации.
Кроме того, зафиксированное в группе мужчин с поллинозами снижение до 13,0% частоты HLA-DRB1 07 было статистически значимым лишь при сравнении с астраханским контролем (13,0% 31,9%; х2=4,248; р 0,05), и характеризовалось умеренными количественными показателями силы и направленности установленной ассоциации: RR2=0,36 и PF2=0,16.
Таким образом, по результатам HLA-типирования нами установлена прямая положительная ассоциация риска развития поллинозов у мужчин с группой аллелей HLA-DRB1 08 и отрицательная - с HLA-DRB1 13(06).
На втором этапе в анализируемой выборке мужчин, больных поллинозами, изучался характер изменений частотных характеристик аллелей гена DQB1 и их статистическая значимость. Уровень регистрации аллельных вариантов гена DQB1 и основные показатели силы и направленности установленных ассоциаций представлены в таблице 9.
Анализ аллельного полморфизма гена DQB1 в группе мужчин, больных поллинозами, показал достоверное повышение частоты HLA-DQB 1 0401/02 до 17,4% как против 3,3% в контроле-1 (j2=7,973; рс 0,05), так и против 4,3% в контроле-2 (% =4,156; р 0,05). Высокие показатели относительного риска (RRi=6,38 и RR2=4,64) и достаточно значимые уровни этиологической фракции (EF]=0,16 и EF2=0,14) указывают на первичный характер установленных ассоциаций между наличием в HLA-фенотипе мужчины аллельного варианта DQBl 0401/02 и фактом наличия у него поллиноза.
Кроме того, в анализируемой группе зафиксировано высокодостоверное повышение удельного веса мужчин - гомозиготных носителей аллельных вариантов-гена DQB1 до 43,5% по сравнению с 21,3% в контроле-1 (х2=9,925; рс 0,05). Выявленные изменения характеризовались умеренным показателем относительного риска (RRj=4,26) и высоким показателем популяционного атрибутивного риска (EFi=0,33).
Статистически значимое снижение уровня регистрации аллеля HLA в группе больных поллинозами мужчин зарегистрировано для HLA-DQB 1 0301 до 17,4% против 39,3% в контроле-1 (xf=5,359; р 0,05) и 52,1% в контроле-2 (%2=Ю,455; р 0,0025; рс 0,05). Низкие цифры относительного риска (RRi=0,36 и RR2=0,21) и высокие показатели превентивной фракции (PF]=0,24 и PF2=0,39) указывают на первичный характер установленных ассоциативных связей между отсутствием в фенотипе мужчины аллельного варианта HLA- DQB1 0301 и фактом наличия у него такого заболевания как поллиноз.
Также достоверно реже в анализируемой выборке типировался аллельный вариант HLA-DQB 1 0201 по сравнению с контролем-2 (21,7% 41,5%; х2=3,971; р 0,05). Значимое отношение рисков (RR2=0,42) сопровождалось высоким показателем превентивной фракции (PF2=0,23), что указывает на первичных характер установленной ассоциации. Снижение уровня регистрации аллеля HLA-DQB1 0201 у мужчин с поллинозами по сравнению с контролем-1 было статистически недостоверным (21,7% 33,7%; RR,=0,58; х2=1,973; р 0,05).
Таким образом, нами установлена положительная ассоциация поллинозов у мужчин с аллельным вариантом HLA-DQBl 0401/02 и отрицательная - с аллелями DQB1 0301 и DQB1 0201.
Далее нами проведен иммуногенетический анализ возможной ассоциативной связи между риском развития поллинозов у мужчин и определенными дву-локусными гаплотипами генов HLA класса II локусов DR и DQ.
Так, у мужчин, больных поллинозами, зафиксировано статистически значимое повышение частоты следующих двулокусных гаплотипов HLA:
- DRB1 08/DQB1 0401/02 (6,76% 1,67%; RR=5,34; EF=0,09; x2=5,233; p 0,05);
- DRB1 08/DQB1 05 (9,14% 2,33%; RR=6,08; EF-0,11; x2=7,544; pc 0,05).
Кроме того, в выборке зарегистрировано достоверное снижение частоты следующих двулокусных гаплотипов HLA:
- DRB1 13/DQB1 0301 (3,37% 21,0%; RR=0,27; PF=0,16; х2=5,П2; p 0,05);
- DRB1 13/DQB1 06 (7,21% 29,7%; RR=0,28; PF=0,18; x2=7,233; pc 0,05).
Особенности полиморфизма аллельных вариантов генов DRB1 и DQB1 у больных бронхиальной астмой
С целью поиска ассоциативных связей между продуктами, генов HLA и риском развития аллергической формы БА нами проведен анализ аллельного полиморфизма у 30 пациентов с клинически оформленной астмой (таблица 19).
Частота регистрации большей части групп аллелей гена DRB1 и аллелей гена DQB1 в анализируемой выборке больных БА фактически не отличалась от таковой как в контроле-1, так и в контроле-2. Так, практически с одинаковой частотой во всех группах типировались группы аллелей HLA-DRB1 15(02). (25,0% в контроле-1; 28,7% в контроле-2; 26,7% в группе больных АФБА), DRB1 12(05) (5,0%; 3,2% и 3,3% соответственно) и DRB1 07 (26,0%; 31,9% и 26,7% соответственно), аллель DQB 1 0303 (6,7%; 7,5% и 3,3% соответственно).
Для ряда специфичностей HLA эти частотные изменения между выборками были незначительными и колебались, в среднем не более, чем на 3-6% (DRB1 01; DRB1 16(02); DRB1 17(03); DRB1 11(05); DQB1 0201).
Изменения частотных характеристик групп аллелей HLA-DRB1 в группе больных аллергической формой БА, а также статистические показатели силы и направленности этих изменении представлены в таблице 20.
В выборке больных аллергической формой БА зарегистрировано достоверное повышение уровня регистрации группы аллелей HLA-DRB 1 08 по сравнению с контролем-1 (13,3% 3,3%; у=4,АП; р 0,05) и приближающееся к таковому по сравнению с контролем-2 (13,3% 4,3%; %2=2,783; р 0,05). Достаточно высокие цифры относительного риска (RRi=4,70 и RR2= 3,42) и-умеренные показатели атрибутивного риска (EFi=0,10 и EF2= 0,09) указывают на первичный и прямой характер выявленных иммуногенетических закономерностей между наличием в фенотипе больного АФБА группы аллелей HLA-DRB 1 08 и фактом наличия у него такого заболевания, как астма.
Трехкратное повышение в выборке больных АФБА частоты типирования группы аллелей DRB1 16(02) по сравнению с астраханским контролем (13,3% 4,3%; RR2=2,76; EF2=0,05) было статистически недостоверным (х2= 1,143; р 0,05). С контролем-1 разницы частот не отмечалось (13,3% 12,7%).
Кроме того, в анализируемой группе установлено статистически значимое снижение уровня регистрации аллеля HLA-DRB 1 13(06) до 16,7% против 38,3% в контроле-2 (х2=5,835; р 0,05). Низкие цифры отношения рисков (RR.2=0,35) и достаточно значимые показатели превентивной фракции (PF2= 0,24) указывают на первичный характер установленных ассоциаций между отсутствием в фенотипе индивидуума группы аллелей HLA-DRB 1 13(06) и фактом наличия у него АФБА. При, сравнении полученных данных с контролем-1 снижение частоты HLA-DRB 1 13(06) также зафиксировано (16,7% 25,7%), но эта разница была статистически недостоверной (х2=2,714; р 0,05).
Таким образом, нами установлена прямая положительная ассоциация факта наличия у пациента аллергической формы БА с присутствием в его фенотипе группы аллелей HLA-DRB1 08 и отрицательная - с аллелем HLA-DRB 1 13(06).
Более интересные данные получены при анализе изменения частотных характеристик аллелей гена DQB1 и их статистическая значимость. Уровень регистрации аллельных вариантов гена DQB1 и основные показатели силы и направленности установленных ассоциаций представлены в таблице 21.
Статистический анализ аллельного полморфизма гена DQB1 в группе больных АФБА показал достоверное повышение частоты регистрации гена HLA-DQB1 05 до 50;0% против 22,3% в контроле-2 (RR2=3,42; EF2=0,30; Х2=7,155; рс 0,05). При сравнении с контролем-1 увеличение уровня.DQB1 05 было статистически недостоверным (50,0% 37,7%; RRi=l,65; х2-1,266; р 0,05).
Кроме того, повышенный уровень частоты по сравнению с контролем-1 зафиксирован для специфичности HLA-DQB 1 0401/02 (16,7% 3,3%; RRi=5,97; EF]=0,14; %2=8,313; рс 0,05). При сравнении с контролем-2 увеличение уровня DQB 1 0401/02 было статистически недостоверным, но приближалось к таковому (16,7% 4,3%; RR2=4,34; EF2=0,08; х2=3,524; р 0,05).
Весьма интересен факт высокодостоверного возрастания среди больных АФБА удельного веса гомозиготных носителей аллелей гена DQB1 до 43,3% против 21,3% в контроле-1 (RR,=4,22; EF,=0,33; х2=12,718; рс 0,025).
Снижение частоты молекулярного типирования зафиксировано в анализируемой выборке для следующих аллельных вариантов гена-DQBl:
- HLA-DQB 1 0301 по сравнению с астраханской контрольной группой (30,0% 52,1%; RR,=0,41; РР,=0,30; х2=5,406; р 0,05);
- HLA-DQB1 06 по сравнению с контролем-1 (23,3% 42,0%; RRi=0,44; PFi= 0,23; х2=4,764; р 0,05) и, особенно, по сравнению с контролем-2 (23,3% 56,4%; RR2=0,25; PF2=0,41; х2=П,314; р 0,001; рс 0,05).
Кроме того, ни у одного из пациентов с АФБА группе не типировался аллель HLA-DQB1 0302. Эти изменения были статистически достоверными (RR,= 0,21; х2=б,838; р 0,05 и RR2=0,25; х2=5,826; р 0,05) и сопровождались весьма умеренными показателями превентивной фракции (PFi=0,ll; PF2=0,08).
Таким образом, нами установлена первичная положительная ассоциация аллергической формы БА со специфичностью HLA-DQB1 05 и отрицательная -cHLA-DQBl 0301,DQBl 0302,DQBl 06.
Из числа двулокусных гаплотипов HLA у больных АФБА зарегистрировано статистически значимое повышение следующих сочетаний:
- DRB1 11(05)/DQB1 05 (20,0% 4,3%; RR=5,65; EF=0,16; =9,618; pc 0,05);
- DRB 1 16(02)/DQB 1 05 (13,3% 3,0%; RR=5,17; EF=0,11; x2=5,148; p 0,05).
В состав этих двулокусных гаплотипов входит «маркерная» специфичность - группа аллелей HLA-DQB1 05, для которой ранее уже была установлена положительная ассоциация с аллергической формой БА.
Кроме того, в анализируемой выборке установлено достоверное снижение частоты следующих двулокусных гаплотипов HLA:
- DRB1 12(06)/DQB1 06 (6,7% 26,0%; RR=0,25; PF=0,17; x2=6,653; p 0,05);
- DRB1 13(06)/DQB 1 06 (3,3% 9,7%; RR=0,22; PF=0,11; j( =5,625; p 0,05);
- DRB 1 07/DQB 1 0201 (10,0% 29,3%; RR=0,31; PF=0,19; x2=6,H8; p 0,05).
В состав этих протекторных двулокусных гаплотипов входит «маркерная» специфичность FILA-DQB1 06, для которой выше была зарегистрирована отрицательная ассоциация с риском развития аллергической формы БА.
Таким образом, можно сделать заключение, что повышенный риск развития аллергической формы БА в популяции русских астраханской геногеографической зоны маркируется группой аллелей HLA-DRB1 08, аллелем DQB1 05 и гаплотипами DRB1 11(05)/DQB1 05 и DRB1 16(02)/DQB1 05.
Резистентность к развитию аллергической формы БА ассоциирована с наличием в фенотипе индивидуума специфичностей HLA-DRB 1 13(06), DQB1 0301, DQB1 0302, DQB1 06 и гаплотипов DRB1 12(06)/DQB1 06, DRB1 13(06)/DQB1 06,DRB1 07/DQB1 0201.
Выявленные в процессе настоящего исследования ассоциации между но-сительством определенного набора аллелей генов DRB1 и DQB1 и риском развития АФБА находят свое подтверждение в следующих клинических примерах:
Пример 5. Больная К, 1977 г.р., русская. Обратилась на прием к аллергологу консультативной поликлиники ГУЗ «Александро-Мариинская областная клиническая больница» г. Астрахани 13.09.2006 г. с жалобами на выделения из носа, чиханье, нарушение носового дыхания, отечность глаз, зуд носа, неба и глаз, слезотечение, чувство «заложенности» и стеснения в грудной клетке, приступообразный кашель с выделением прозрачной скудной мокроты, одышку с периодическими приступами удушья в летне-осенний период (начиная с середины июля). В период обострения заболевания беспокоят также выраженная общая слабость, потливость, быстрая утомляемость и снижение работоспособности, плохой сон и отсутствие аппетита.
