Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Морфогенетические особенности уротелиальных опухолей мочевого пузыря 11
1.1.1. Гистологическая характеристика уротелиальных новообразований .. 11
1.1.2. Генетическая характеристика уротелиальных опухолей 14
1.2. Экспрессия белков опухолевого роста в уротелиальных опухолях 17
1.2.1. Рецепторы эпидермальных факторов роста 17
1.2.1.1. Особенности активации РЭФР 17
1.2.1.2. Условия активации с-егЬВ-2 18
1.2.1.3. Мутации внутриклеточного компонента РЭФР в злокачественных новообразованиях 20
1.2.1.4. Мутации РЭФР и эффективность антагонистов РЭФР при РМП.21
1.2.1.5. Структурная взаимосвязь РЭФР и сигнальных белков 22
1.2.1.6. Сигнальный путь Ras/MAPK и белки She, Grb2 23
1.2.1.7. Сигнальные пути JAK/STAT 24
1.2.1.8. Семейство киназ Src 25
1.2.1.9. Фосфолипаза D, фосфолипаза Су и PI3-K 27
1.2.1.10. Прогностическое значение РЭФР при РМП 28
1.2.2. Белки STAT и опухолевая трансформация 30
1.2.3. Экспрессия низкомолекулярного цитокератина 20 32
1.2.4. Экспрессия белка Р53 и онкогенез уротелиальных опухолей 36
1.2.5. Маркер пролиферации Ki-67 .- 39
Глава 2. Материал и методика исследования 42
2.1. Гистологический метод 42
2.2. Иммуногистохимический метод 43
2.3. Статистический метод 46
Глава 3. Собственные исследования 47
3.1. Гистологическая характеристика уротелиальных опухолей 47
3.1.1. Инвертированная уротелиальная папиллома 47
3.1.2. Уротелиальная опухоль низкого злокачественного потенциала 49
3.1.3. Инвазивная уротелиальная карцинома низкой степени злокачественности 51
3.1.4. Инвазивная уротелиальная карцинома высокой степени злокачественности 54
3.1.5. Уротелиальная карцинома с инвазией в мышечную оболочку 58
3.2. Иммуногистохимическая характеристика уротелиальных опухолей 63
3.2.1. Экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста— 1 63
3.22. Экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста - 2 73
3.2.3. Экспрессия STAT1 82
3.2.4. Экспрессия цитокератина 20 88
3.2.5. Экспрессия Р53 92
3.2.6. Экспрессия Кі-67 96
3.2.7. Диагностическое значение иммуногистохимических маркеров 99
3.3. Значение РЭФР, белка STAT1 и регуляторов клеточного цикла в онкогенезе уротелиальных опухолей 101
3.3.1. Влияние факторов STAT1 и Р53 на опорные структуры 101
3.3.2. Влияние РЭФР, белка STAT1 и регуляторов клеточного цикла на пролиферативную активность 103
3.4. Прогностическое значение экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста и регуляторов клеточного цикла 109
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 113
Выводы 124
Практические рекомендации 126
Литература
- Гистологическая характеристика уротелиальных новообразований
- Мутации внутриклеточного компонента РЭФР в злокачественных новообразованиях
- Иммуногистохимический метод
- Инвазивная уротелиальная карцинома низкой степени злокачественности
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время уротелиальные опухоли занимают седьмое — десятое место в структуре злокачественных новообразований (Суринов А.Е., 2006). Темпы прироста заболеваемости уротелиальными опухолями постоянно увеличиваются, составляя 40 — 49% в десятилетнем интервале. Ежегодно в России от рака мочевого пузыря (РМП) умирают 7,4 тысячи человек (Аксель Е.М., 2005). Высокая смертность от РМП свидетельствует о неэффективности терапевтического вмешательства, и диктует необходимость исследования молекулярных механизмов опухолевой прогрессии.
Неопластическая трансформация представляет собой результат разбалан-сировки протоонкогенных рецептор - опосредованных механизмов и функционального состояния системы подавления опухолевого роста (Vogelstein В., KinzlerK. W., 1993).
Известно, что активация системы рецепторов эпидермального фактора роста (РЭФР) может быть связана с прогрессией и неблагоприятным прогнозом мышечноинвазивного уротелиального рака мочевого пузыря (Chow N.H., Chan S. Н. et al., 2001). Рецептор c-erbB-2 для проявления своего онкогенного потенциала должен обязательно активироваться другой рецепторной молекулой, связанной с лигандом (Shankaran Н., Wiley Н. et al., 2008). В отсутствии второй поддерживающей разновидности РЭФР неопластическая трансформация предполагается не высокой. Мало изучена роль одиночной экспрессии с-егЬВ-2 в индукции пролиферации клеток при РМП.
По литературным данным роль белков STAT в неопластической трансформации клетки противоречива. С одной стороны, при стимуляции цитокина-ми белки STAT способствуют клеточной дифференцировке и остановке клеточного цикла (Egwuagu СЕ. et al., 2006). С другой стороны, экспрессия STAT приводит к индукции пролиферации и блокированию апоптоза в клетках (Lassmann S. et al., 2007; Wu F. et al., 2008). Факторы STAT1 могут быть акти-
вированы рецепторами эпидермального фактора роста (Park O.K., Schaefer Т. S. et al., 1996; Xia L., Wang L. et al., 2002). В тоже время анализ литературы не выявил экспериментальных свидетельств участия STAT1 в сигналинге РЭФР в уротелиальных новообразованиях. В данное время отсутствуют сведения, связывающие экспрессию белков STAT1 со стадией и степенью злокачественности РМП, представляющих важные гистологические критерии прогрессии уротелиальных опухолей.
Основной проблемой оперативного лечения уротелиальных опухолей мочевого пузыря остается высокая частота рецидивирования. Неинвазивные Та опухоли рецидивируют у 35 - 71% больных (Мартов А.П., Гущин Б. Л. и др., 2004). Пациенты с поверхностными Та-Т1 опухолями для выявления рецидивов вынуждены проходить многократные цистоскопические исследования.
В последнее время ведутся поиски маркеров, позволяющих прогнозировать клиническое течение рака мочевого пузыря у конкретного больного. Подобными молекулярными показателями могут быть рецепторы эпидермального фактора роста, регуляторы клеточного цикла Р53 и Ki-67, поскольку имеются сообщения, что они могут быть связанными с рецидивированием, метастазиро-ванием и низкой выживаемостью (Habuchi Т., Marberger М. et al., 2005). Однако результаты различных исследований противоречат друг другу, прогностическая значимость этих факторов рядом авторов оспаривается (Jimenez R.E., Hussain М. et al., 2001; Peyromaure M., Weibing S. et al., 2002)1
Таким образом, актуальность темы настоящей диссертации обусловлена высокой распространенностью эпителиальных опухолей мочевого пузыря, их частым рецидивированием после оперативного лечения и неопределенностью многих аспектов онкогенеза уротелиальных новообразований.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явился анализ молекулярных механизмов, лежащих в основе злокачественной трансформации неинвазивных и инвазив-ных уротелиальных опухолей мочевого пузыря.
7 Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Изучение особенностей экспрессии РЭФР (EGFR, с-егЬВ-2) и фактора STAT1 в неинвазивных и инвазивных опухолях низкой и высокой степени злокачественности;
Исследование взаимосвязи между экспрессией РЭФР, фактора STAT1 и пролиферативной активностью клеток в новообразованиях мочевого пузыря;
Изучение типоспецифической экспрессии измененного белка Р53 в группах уротелиальных опухолей отличающихся по прогнозу, стадии и степени злокачественности;
Изучение экспрессии цитокератина 20 в неинвазивных и инвазивных уротелиальных опухолях низкой и высокой степени злокачественности и ее зависимость от факторов STAT1 и Р53;
Оценка корреляции клинического течения и экспрессии РЭФР, транскрипционного фактора STAT1, низкомолекулярного цитокератина 20, белка Р53 и пролиферативной активности клеток (по белку Ki-67).
Научная новизна исследования
Впервые проведено комплексное изучение экспрессии рецепторов эпи-дермального фактора роста EGFR, c-erbB-2 и транскрипционного фактора STAT1 в новообразованиях мочевого пузыря. Показано, что интенсивность и локализация экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста положительно коррелируют друг с другом и с пролиферативной активностью опухоли.
Впервые установлено, что транскрипционный фактор STAT1 принимает участие в опухолевой трансформации неинвазивных опухолей и ТІ карцином низкой степени злокачественности за счет индукции пролиферации. Выявлена экспрессия белка STAT1 на плазматической мембране и в цитоплазме опухолевых клеток. Показана роль фактора STAT1 в сигналинге рецептора с-егЬВ-2.
Впервые получены экспериментальные данные, подтверждающие положительное влияние транскрипционного фактора STAT1 на экспрессию опорно-
8 го цитокератина 20 в уротелиальных опухолях мочевого пузыря. Установлено, что сцепление опухолевых клеток между собой и их инвазивные свойства определяются состоянием цитоскелета низкомолекулярных цитокератинов. Показано, что патологическая экспрессия цитокератина 20 связана со стадией и степенью злокачественности.
Показано, что функциональная недостаточность опухолевого супрессора р53 является важным звеном онкогенеза неинвазивных и инвазивных карцином низкой степени злокачественности. Экспрессия Р53 коррелирует с интенсивностью и локализацией экспрессии с-егЬВ-2, что свидетельствует о сопряженности активации протоонкогенной рецепции эпидермальных факторов роста и подавления систем опухолевой супрессии.
Доказана взаимосвязь иммуногистохимических особенностей уротелиальных опухолей и прогноза заболевания. Установлено, что диффузный тип экспрессии рецептора с-егЬВ-2, патологическая реакция с СК20 и интенсивная экспрессия измененного белка Р53 коррелируют с частотой рецидивирования.
Теоретическая и практическая ценность исследования
В настоящем исследовании показана роль рецепторов эпидермального фактора роста в онкогенезе неинвазивных и инвазивных уротелиальных опухолей мочевого пузыря. Установлено, что в неинвазивных опухолях и ТІ карциномах экспрессируются рецепторы с-егЬВ-2 и транскрипционные факторы STAT.
Полученные результаты обращают внимание на важность дальнейшей иммуноморфологической оценки механизмов сигналинга рецепторов эпидермального фактора роста. Распространенность экспрессии рецепторов с-егЬВ-2, определяемая по интенсивности и локализации, и транскрипционного фактора STAT1 в неинвазивных и инвазивных уротелиальных опухолях достаточно высокая.
При продолжающихся исследованиях эффективности и безопасности применения антагонистов РЭФР и ингибиторов транскрипционных факторов
9 представляется важным применение иммуногистохимической методики для оценки чувствительности новообразования к селективным лекарственным средствам.
В работе показано, что синтез цитокератинов влияет на инвазивные свойства и степень атипии опухолевых клеток. В связи с этим подчеркивается необходимость дальнейшего исследования роли цитоскелета низкомолекулярных цитокератинов в прогрессии уротелиальных новообразований.
Представленный комплексный иммуногистохимический подход к морфологическому исследованию операционного материала уротелиальных опухолей позволяет объективизировать оценку стадии и степени злокачественности новообразования. Описанная типоспецифическая экспрессия с-егЬВ-2, цитокера-тина 20 и белка Р53 могут быть использованы для прогнозирования течения и определения тактики лечения пациентов с неинвазивными опухолями и ТІ карциномами мочевого пузыря.
Положения диссертации, выносимые на защиту
Выявление рецепторов эпидермального фактора роста и белка STAT1 позволяет дать патогенетическую прогностическую оценку различных уротелиальных опухолей мочевого пузыря. Биологическое поведение неинвазивных и инвазивных опухолей также определяется состоянием цитоскелета по экспрессии низкомолекулярных цитокератинов (СК20), пролиферативной активностью клеток (Кі-67) и связано со степенью повреждения системы опухолевой супрессии р53.
Уротелиальные опухоли характеризуются тремя видами --экспрессии EGFR: нормальным, базальным и диффузным. В качестве наиболее информативного показателя следует рассматривать диффузный тип экспрессии EGFR, так как он не встречается в уротелиальных папилломах, слабо выражен в опухоли низкого злокачественного потенциала и преобладает в мышечноинвазив-ных карциномах высокой степени злокачественности. Интенсивная экспрессия EGFR при диффузном типе ее локализации характеризует высокий уровень ре-
10 цидивирования уротелиальных новообразований.
Рецепторы с-егЬВ-2 в уротелиальных опухолях характеризуются тремя видами экспрессии: нормальным, поверхностным и диффузным. Диффузный тип экспрессии с-егЬВ-2 является наиболее информативным показателем. Диффузная экспрессия с-егЬВ-2 преобладает в рецидивных новообразованиях и характеризует неблагоприятный иммунофенотип опухоли. Показатели экспрессии EGFR и с-егЬВ-2 сильно коррелируют друг с другом.
Белок STAT1 характеризуется двумя типами реакции: отрицательной и положительной, в форме цитоплазматического окрашивания. Положительная реакция со STAT1 обратно коррелирует со стадией и степенью злокачественности уротелиальных опухолей и преобладает в неинвазивных Та опухолях и ТІ карциномах низкой степени злокачественности. В Т2 карциномах и РМП высокой степени злокачественности доминирует отрицательная реакция.
Особенности экспрессии белковых молекул позволяют проводить дифференциальную диагностику новообразований мочевого пузыря, отражают вероятность рецидивирования и могут использоваться в качестве прогностических иммуногистохимических маркеров.
Гистологическая характеристика уротелиальных новообразований
Начальные классификационные системы предполагали разделение РМП в зависимости от доли недифференцированных опухолевых зон, инвазии и тканевого атипизма (Bergkvist A., Ljungqvist A. et al., 1965). Первая международная классификация ВОЗ 1973 г. основывалась на степени клеточной анаплазии.
Согласно классификации ВОЗ 1973 г., уротелиальные опухоли были разделены на 4 категории: папиллома, карциномы 1, 2 и 3 степени злокачественности (Мостофи Ф.К. и др., 1977). Папилломы определялись как экзофитные опухоли состоящие из соединительнотканно-сосудистых сердцевин, покрытых нормальным уротелием с неповрежденными зонтичными клетками и низкой митотиче-ской активностью. Определение степени злокачественности карцином базировалось на оценке степени клеточной анаплазии. Наибольшую анаплазию имели опухоли 3 степени, наименьшую — опухоли 1 степени и промежуточную — карциномы 2 степени. Согласно классификации, анаплазия определялась увеличением клеточности, скучиванием ядер, нарушением клеточной полярности и дифференцировки от основания к поверхности эпителиального пласта, полиморфизмом, неодинаковыми размерами клеток, вариациями формы и структуры ядерного хроматина.
Недостатком классификации ВОЗ 1973 г. было неточное разграничение между тремя.степенями анаплазии. Если определение 1 и 3 степени не вызывает затруднений, то различение опухолей 2 и 3 степени является наиболее проблематичным. По данным Yorukoglu К. и соавт. (2003), вероятность совпадения заключений у двух специалистов варьирует от 87 до 31%.
В связи с необходимостью уточнения критериев и повышения воспроиз водимости, в 1998 г. рабочей группой Международного общества уропатологов была разработана новая система (Epstein J.I., Amin М. В. et al., 1998). В новую классификацию были введены понятие опухоли низкого злокачественного потенциала (ОНЗП) и принцип разграничения опухолей одинаковой степени злокачественности на неинвазивные и инвазивные. В настоящее время действует Классификация ВОЗ 2004 г., основанная на принципах Классификации ВОЗ/Международного общества уропатологов 1998 г.
Уротелиалъная папиллома это доброкачественное новообразование, покрытое морфологически нормальным переходным эпителием. Часто содержат эндофитный компонент. Папилломы МП прогрессируют в ОНЗП лишь в 2% случаев (Cheng L., Darson М. et al.} 1999). Переход в дисплазию, карциному in situ или инвазивный РМП не возможен.
Инвертированная папиллома наиболее часто развивается на фоне существующей гиперплазии с хроническим циститом и гнездами фон Брунна. В отличие от обычных уротелиальных опухолей, центральные зоны инвертированных гнезд содержат более дифференцированные клетки, а базальные слои находятся на периферии. Рецидивные новообразования развиваются менее чем в 1% случаев (Urakami S., Igawa М. et al., 1997). В то же время, согласно отдельным исследованиям возможен переход инвертированной папилломы в неинва-зивный рак низкой степени злокачественности (Broussard J.N., Tan P. Н. et al., 2004). ОНЗП является экзофитной папиллярной уротелиальной опухолью с минимальной ядерной атипией. Пролиферативная активность ОНЗП в сравнении с папилломой повышена, и толщина эпителия превышает 7 клеточных слоев. Клеточная полярность сохранена, фигуры митоза редкие и ограничены базаль-ным слоем (Epstein J.I., Amin М. В. et al., 1998).
Имеются данные о повышенном риске рецидивирования и прогрессии ОНЗП по сравнению с папилломами МП. Рецидивы развиваются у 29% пациентов с ОНЗП, причем с вероятностью 2/3 повторные опухоли являются неинва-зивными карциномами низкой или высокой степени злокачественности (Cheng L., Neumann R. M. et al., 1999). В 4% случаев возможна прогрессия ОНЗП в ин-вазивный РМП низкой степени злокачественности.
Неинвазивная папиллярная карцинома низкой степени злокачественности (НСЗ) представляет собой поверхностную карциному с четкой ядерной и тканевой атипией. Ядра увеличены, различия в форме и распределении хроматина умеренные. Могут встречаться ядрышки и митозы во всех слоях, преимущественно в базальных. Неинвазивные карциномы рецидивируют в 48 — 71% случаев с возможным переходом в неинвазивный РМП ВСЗ; 5% опухолей прогрессируют в инвазивный рак (Holmang S., Hedelin Н. et al., 1999).
Неинвазивная папиллярная карцинома высокой степени злокачественности (ВСЗ) это прединвазивная карцинома с выраженным клеточным и тканевым атипизмом. Ядра полиморфные со значительной вариацией размеров и неправильным распределением хроматина. Митозы частые, встречаются в поверхностном слое. Вследствие нарушения клеточного сцепления толщина эпителиального пласта уменьшена, либо не изменена. В 40% случаев встречается прогресссия в инвазивный РМП (Sylvester R. J., Van Der M. A. et al., 2005).
Карцинома in situ представляет плоскую прединвазивную опухоль с высокой степенью анаплазии. Ядра увеличенные, гиперхромные, полиморфные, цитоплазма гиперэозинофильная. Как и в карциноме ВСЗ, межклеточное сцепление ослаблено, в моче появляются атипичные клетки (Brown F.M., 2000).
Таким образом, биологическое поведение различных неинвазивных уро-телиальных опухолей существенно варьирует. Папилломы МП фактически не прогрессируют. ОНЗП и неинвазивный РМП НСЗ могут переходить в неинва-зивную карциному более высокой степени злокачественности, и достаточно редко в инвазивный РМП. Наиболее агрессивными представителями поверхностных опухолей являются неинвазивная карцинома ВСЗ и карцинома in situ.
Мутации внутриклеточного компонента РЭФР в злокачественных новообразованиях
В последнее время существенная роль в онкогенезе ряда новообразований придается соматическим мутациям внутриклеточного компонента РЭФР. В клинических исследованиях ингибиторов тирозин-киназ (ИТК) при немелко-клеточном раке легкого у значительной части больных выявлена высокая чувствительность к низкомолекулярным ИТК, которая коррелировала с наличием соматических мутаций в ТК-домене EGFR (Sharma S.V., Bell D. W. et al., 2007). Точечная мутация в нуклеотид-связывающей петле, или в активирующей петле, а также делеции каталитической С-спирали способствовали высокой чувствительности к ИТК. Riese D. J. и соавт. (2007) показали, что данные мутации активируют ТК-домен EGFR и лиганд-независимый сигналинг, который эффективно блокируется низкомолекулярными ИТК.
Любая мутация ТК EGFR, обнаруженная при немелкоклеточном раке легкого, разрушает неактивную аутоингибированную конформацию ТК-домена EGFR (Zhang X., Gureasko J. et al., 2006). Так, замещение L834R разрывает связь между спиральным витком активационной петли и С-спиралью в неактивной конформации, что способствует обнажению L834R и формированию активного центра.
Таким образом, мутации внутриклеточного компонента РЭФР доказывают, что неактивная конформация EGFR, как и большинства других рецептор-ных ТК поддерживается благодаря аутоингибирующим взаимодействиям (Hubbard S.R., Till J. Н., 2000). Физиологическая активация РЭФР представляет собой лиганд-индуцированную димеризацию внеклеточного компонента, которая сопровождается аллостерической активацией внутриклеточного ТК-домена EGFR. Мутации в злокачественных новообразованиях разрушают аутоингиби-рующие взаимосвязи ТК-домена РЭФР и вызывают конституциональную активацию рецепторов, не зависящую от факторов роста.
По аналогии с немелкоклеточным раком легкого, РМП преобладает у мужчин, и связан с курением. С учетом высокой распространенности мутаций РЭФР в карциномах легкого, выполнялось изучение эффективности низкомолекулярных ИТК при РМП. Исследование уротелиальных опухолей методом одноцепочечных конформационных полиморфизмов выявило мутации в экзо-нах 18 - 21 EGFR лишь у 4% больных РМП (Jacobs М.А., Wotkowicz С. et al., 2007).
В то же время, обработка клеточных линий РМП низкомолекулярным ИТК гефитинибом вызывала снижение синтеза ДНК на 50% и задержку опухолевого роста (Shrader М., Pino М. S. et al., 2007). Даже в отсутствии мутаций ТК-домена эрлотиниб (Тарцева) препятствовал активации РЭФР и вызывал инактивацию киназ МАРК, Akt и факторов STAT (Jacobs М.А., Wotkowicz С. et al., 2007).
В глиобластомах головного мозга описаны мутации доменов I и П внеклеточного компонента РЭФР, которые способствовали лиганд-независимой активации рецептора (Lee J.C., Vivanco I. et al., 2006). Имеют ли место подобные изменения в уротелиальных опухолях в настоящее время неясно.
Клинические испытания показали безопасность и эффективность при РМП препаратов второй группы антагонистов РЭФР (Hussain М.Н., MacVicar G. R. et al., 2007). Моноклональные антитела к РЭФР (цетуксимаб, трастузумаб) конкурируют с лигандами, связываясь с внеклеточным компонентом EGFR, блокируют лиганд-индуцированную.димеризацию рецептора и последующую активацию ТК (Hynes N.E., Lane Н. А., 2005). Кроме того, данные иммуноглобулины вызывают противоопухолевый иммунный ответ, содействуя антитело-зависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов (Normanno N., Bianco С. et al., 2003). Моноклональные антитела к РЭФР индуцируют отшнуровку участков плазматической мембраны, содержащих РЭФР, что приводит к распаду рецептора (Li S., Schmitz К. R. et al., 2005).
Анализ литературы показывает, что данные о мутациях внутриклеточного и внеклеточного компонента РЭФР в уротелиальных опухолях достаточно ограничены. Отсутствуют сведения о коммерчески доступных специфических моноклональных антителах к мутантным РЭФР, которые позволили бы имму-ногистохимически верифицировать молекулярные повреждения, способствующие опухолевом росту. Неизвестно, способствуют ли мутации РЭФР гиперэкспрессии белка, либо гиперэкспрессия имеет самостоятельное значение в онко-генезе уротелиальных опухолей.
Первым критическим этапом в передаче сигнала от РЭФР является активирование цитоплазматических ферментов, вызывающих ростовые эффекты и индукцию пролиферации. Тем не менее, прямые исследования с целью точного определения субстратов ТК EGFR затруднены вследствие склонности EGFR к образованию гетеродимеров, и последующей активации другими членами семейства РЭФР (Daly R.J., 1999). Для многих белков, участвующих в сигналинге РЭФР, вопрос прямой или косвенной активации остается спорным.
Структурная взаимосвязь РЭФР и сигнальных белков значительно повышает эффективность активации ключевых регуляторов клеточного цикла и способствует сборке многокомпонентных сигнальных комплексов. Фосфорилиро-вание С — концевой последовательности внутриклеточного компонента РЭФР формирует стыковочные сайты для доменов SH2 или РТВ внутриклеточных сигнальных молекул и адаптеров, что приводит к их совмещению и сборке в многокомпонентные сигнальные частицы. Подобным прямым путем РЭФР активируют следующие сигнальные белки: GRB-2, Nek, Crk, She, Dok-R, PLC-y, P120RasGAP, PTB-1B, SHP-1, Src, Abl. Различия С-концевой последовательности в семействе РЭФР позволяют различным сигнальным белкам предпочтительно связываться с определенными гетеродимерными комплексами, что значительно увеличивает сложность сигналинга. Так, по сравнению с EGFR, субъединица р85 PI3-K имеет большее сродство к С-концевой последовательности c-erbB-3 (Hellyer N.J., Cheng К. et al., 1998). В тоже время, неясно, имеет ли место подобная взаимосвязь между РЭФР и факторами STAT.
Прямая или косвенная связь внутриклеточных сигнальных белков с РЭФР, является индуцибельной и зависит от состояния активации/инактивации РЭФР. Тем не менее, цинк - связывающий белок ZPR-1 и транскрипционные факторы STAT связаны с нефосфорилированным (неактивным) EGFR, и при связывании лиганда с РЭФР активируются или перемещаются в другие области клетки (Xia L., Wang L. et al., 2002).
Иммуногистохимический метод
Иммуногистохимическое исследование проводилось в соответствии со стандартным протоколом. Ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7,4), после проводки на гистопроцессоре заливали в парафин. Использован парафин с температурой плавления +54С.
Затем с помощью одноразовых лезвий марки R35 нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и наклеивали на альбуминизированные стекла. Депарафи-низация выполнена в термостате при температуре +60С в течение 1 часа. По еле погружения в ксилол срезы регидрировались проводкой по спиртам в убывающей концентрации в течение 15 минут.
Восстановление антигенной активности осуществлялось методом теплового демаскирования в 0,01М цитратном буфере в микроволновой печи при мощности 300 Вт в течение 20 минут.
Блокирование эндогенной пероксидазной активности выполнено с помощью 3% перекиси водорода в течение 10 минут. В работе использованы следующие антитела к антигенам человека: 1. Поликлональные мышиные антитела к EGFR (BioGenex, prediluted antibody) 2. Поликлональные кроличьи антитела к с-егЬВ-2 (Dako, 1:200) 3. Поликлональные кроличьи антитела к STAT1 (Santa Cruz Biotechnology Inc, 1:500) 4. Моноклональные мышиные антитела к СК20 (Ks 20.8, Dako, 1:100) 5. Моноклональные мышиные антитела к Р53 (DO-7, ready to use) 6. Моноклональные мышиные антитела к Ki-67 (ММ1, Diagnostic Biosysems, 1:200)
После нанесения перекиси водорода на срезы наносились 50 мкл разведенной первичной сыворотки. Срезы инкубировались при 37 С в течении 30 минут.
Визуализация иммунных комплексов осуществлялась иммуноперокси-дазным методом с помощью системы детекции LSAB+ (Dako).
После каждой инкубации срезы тщательно отмывали в фосфатно-солевом буфере, подсушивали-вокруг, затем для визуализации реакции на них наносили ДАБ (3,3-диаминобензидин), что позволяло получать специфическую коричневую окраску. Интенсивность иммуногистохимической реакции в каждом препарате контролировалась под микроскопом: после достижения необходимой интенсивности окрашивания срезы отмывали в дистиллированной воде, а затем в течение 2 минут докрашивали гематоксилином Майера.
Стекла со срезами снова промывали и погружали в проточную воду, в ко торую для получения щелочной среды добавляли несколько капель раствора аммиака.
После того, как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекали, обезвоживали в батарее спиртов в восходящей концентрации, заключали в канадский бальзам и исследовали под микроскопом.
Системы оценки экспрессии иммуногистохимических маркеров
Оценку интенсивности иммуногистохимической реакции с рецепторами EGFR и с-егЬВ-2 осуществляли согласно порядковой шкале: О - мембранное окрашивание отсутствует, 1+ - слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более чем в 10% клеток, 2+ - окрашивание мембран средней интенсивности по всему периметру выявляется более чем в 10% клеток, 3+ - интенсивное окрашивание мембран по всему периметру выявляется более чем в 10% клеток. Кроме того, выполнялась регистрация локализации (типа) экспрессии рецепторов EGFR и с-егЬВ-2:
1. Базальный (нормальный) тип экспрессии EGFR - при окрашивании базального слоя уротелия,
2. Поверхностный (нормальный) тип экспрессии с-егЬВ-2 — при окрашивании поверхностного слоя зонтичных клеток. Нормальный тип отмечался также и при отсутствии мембранной реакции на оба рецептора,
3. Диффузный (патологический) тип экспрессии EGFR и с-егЬВ-2 - при иммунной реактивности всех клеточных слоев, в том числе зон инвазии карцином.
Иммуногистохимическая реакция на белок STAT1 оценивалась по интенсивности цитоплазматического окрашивания: 1. Отрицательная реакция, отсутствие цитоплазматического окрашивания; 2. Положительная реакция, интенсивность окрашивания цитоплазмы 1 балл; 3. Положительная реакция, интенсивность 2 балла.
Инвазивная уротелиальная карцинома низкой степени злокачественности
Рецепторы эпидермалъного фактора роста представляют собой трансмембранные белки, передающие сигналы из внеклеточного окружения через систему вторичных посредников в ядро. Экспрессия РЭФР ограничена мембраной клеток. Плазматическая мембрана является основной структурой опосредующей нормальное функционирование системы РЭФР. Однако, учитывая явление везикулярного транспорта рецепторных комплексов, в ходе которого происходит отшнуровка и последующая лизосомальная деградация мембранных пузырьков, возможно выявление небольших количеств РЭФР и в цитоплазме. В связи с этим обнаруживается невысокая цитоплазматическая иммунореактив 64 ность. РЭФР в отличие от стероидных рецепторов в ядро не проникают и не принимают участия в непосредственной активации генов - мишеней.
Известно, что в поляризованных эпителиальных выстилках трансформирующий фактор роста-а синтезируется и секретируется в апикальном клеточном компартменте, диффундирует через межклеточные соединения и связывается с EGFR, который экспрессируется на базо-латеральной мембране (Du J. et al., 1995). В связи с этим, базальная экспрессия EGFR является индикатором нормального либо повышенного функционирования естественного механизма поддержания тканевой жизнеспособности уротелия.
Согласно теории дефекта поля, онкогенной трансформации подвергаются любые группы клеток, независимо от уровня. Активация РЭФР наблюдается во всей толще новообразования, что морфологически выражается в виде гомогенной диффузной экспрессии РЭФР. В связи с этим не исключено, что базальная и диффузная экспрессия EGFR могут характеризовать различные варианты клинического течения опухолевого процесса.
В настоящих исследованиях в неизмененном уротелии экспрессия рецепторов EGFR наблюдается только на поверхности клеток, расположенных вдоль базальной мембраны. Тестирование контрольной группы не выявило ни одного случая диффузного окрашивания уротелия. Интенсивность иммуногистохими-ческой реакции оценена по порядковой шкале в 0 баллов.
Иммуноморфологическое исследование уротелиальных новообразований позволило выделить следующие типы экспрессии EGFR (Рис. 13, 14, 15): 1. Нормальная экспрессия EGFR, нормальный тип, интенсивность реакции О баллов. 2. Нормальная экспрессия EGFR, базальный тип, интенсивность реакции 1-2 балла. 3. Патологическая экспрессия EGFR, диффузный тип, интенсивность реакции 1-3 балла.
Мышечноинвазивный РМП высокой степени злокачественности. Цитоплазматическая реакция с EGFR слабая. Все клеточные слои демонстрируют мембранную экспрессию EGFR высокой интенсивности, соответствующую 3 баллам. Диффузная экспрессия EGFR, патологический тип. ДАБ - гематоксилин (х400).
Анализ соответствий интенсивности и локализации экспрессии EGFR выявил сильную общую корреляцию (Vc=0,838, р=0,002). Из Таблицы 1 видно, что преобладала нормальная экспрессия EGFR (69/83, 83%), соответствующая отсутствию мембранного окрашивания и базальной локализации с интенсивностью реакции 1-2 балла. Обращает внимание на себя зависимость интенсивности реакции от типа экспрессии. В опухолях с базальным типом экспрессии EGFR доминировало слабое окрашивание неполного периметра мембран, соот ветствующее интенсивности реакции 1 балл. В опухолях с диффузным типом экспрессии EGFR преобладала мембранная реакция средней интенсивности, соответствующая 2 баллам.
Особенности экспрессии EGFR в различных уротелиальных опухолях приведены в Таблице 2. Преобладающими типами экспрессии являются нормальный и базальный, они встречаются в 28,9% и 54,2% всех новообразований соответственно, в то время как на диффузный тип приходится 16,9% уротелиальных опухолей. Нормальный тип экспрессии EGFR встречается во всех уротелиальных папилломах, 40,9% ОНЗП и в 21,8% инвазивных карцином, причем преимущественно стадии ТІ и НСЗ. Базальный тип экспрессии EGFR выявляется в 50% ОНЗП, практически во всех неинвазивных карциномах, и 56% инвазивных карцином.
Анализ параметров экспрессии EGFR в инвазивных карциномах МП выявил взаимосвязь активации EGFR с мышечной инвазией и высокой степенью злокачественности (Рис. 16, Табл. 3). В ТІ опухолях диффузный тип экспрессии EGFR отмечен с частотой 7/48 (14,6%), тогда как в мышечноинвазивном РМП этот показатель составил 5/7 (71,4%, Vc = 0,639, р 0,001). Поскольку локализация и тип экспрессии EGFR взаимосвязаны, иммунореактивность 2 и более балла встретилась в 13/48 (27,1%) случаев ТІ опухолей и в 7/7 (100%) Т2 карцином (Vc = 0,465, р=0,003). По сравнению с РМП НСЗ, более половины карцином ВСЗ показали иммунореактивность с EGFR интенсивностью 2 или 3 балла (Vc = 0,484, р=0,005).
Похожие диссертации на Особенности экспрессии рецепторов эпидермального фактора и белка STATI в уротелиальных опухолях мочевого пузыря
![Морфофункциональные особенности поражения мочевого пузыря опухолевого и неопухолевого генеза [Электронный ресурс]](/i/i/4393/183937.png "Морфофункциональные особенности поражения мочевого пузыря опухолевого и неопухолевого генеза [Электронный ресурс] Кунин Игорь Семенович")
