Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль апоптоза в патогенезе и саногенезе ВЗК (обзор литературы) 11
1.1 Механизмы апоптоза 11
1.2 Цитокины и апоптоз 15
1.3 Апоптоз при аутоиммунных заболеваниях 20
1.4 Апоптоз при воспалительных заболеваниях кишечника 23
1.5 Влияние фармакологических препаратов на апоптоз 30
Глава 2. Клиническая характеристика больных 38
Глава 3. Методы исследования 61
3.1 Выделение чистых популяций мононуклеарных клеток, полиморфноядерных лейкоцитов и их стандартизация 61
3.2 Определение продукции ФНО-а в ПМЯЛ и МНК периферической крови 62
3.3 Определение экспресиии CD-95 и CD-95-L ПМЯЛ и лимфоцитами методом проточной цитометрии 63
3.4. Определение экспрессии Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами методом проточной цитометрии 65
3.5 Статистическая обработка результатов 66
Глава 4. Показатели апоптоза и синтез ФНО-а при ВЗК (собственные данные) 67
4.1 Экспрессия CD-95, CD-95-L и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами у больных язвенным колитом 67
4.2 Синтез ФНО-а in vitro ПМЯЛ и мононуклеарами у больных язвенным колитом 74
4.3 Экспрессия CD-95, CD-95-L и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами у больных болезнью Крона 79
4.4 Синтез ФНО-а in vitro ПМЯЛ и мононуклеарами у больных болезнью Крона 85
4.5 Продукция маркеров апоптоза CD-95, CD-95-L, Вс1-2 в динамике лечения больных ЯК 89
4.6 Динамика синтеза ФНО-а в процессе лечения ЯК 92
4.7 Продукция маркеров апоптоза CD-95, CD-95-L, Вс1-2 в процессе лечения больных БК 98
4.8 Динамика синтеза ФНО-а в процессе лечения БК 101
4.9 Моделирование клинического течения и эффективности терапии ВЗК на основании показателей апоптоза и ФНО-а 107
Глава 5. Заключение 116
Выводы 129
Практические рекомендации 130
Список литературы 131
- Механизмы апоптоза
- Влияние фармакологических препаратов на апоптоз
- Экспрессия CD-95, CD-95-L и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами у больных язвенным колитом
- Моделирование клинического течения и эффективности терапии ВЗК на основании показателей апоптоза и ФНО-а
Введение к работе
Актуальность проблемы. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относятся язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) – одна из серьезных проблем современной гастроэнтерологии. ВЗК характеризуются неспецифическим иммунным воспалением стенки кишки – поверхностным при ЯК и трансмуральным при БК (Белоусова Е.А.. 2010, Можина Т.Л., 2012). Проблема этих заболеваний постоянно привлекает к себе внимание в связи с ростом заболеваемости, поражением лиц преимущественно молодого трудоспособного возраста, наличием серьезных осложнений, приводящие к ранней инвалидизации, что делают эту проблему не только медицинской, но и социальной. Несмотря на значительное число работ, посвящённых изучению этиологии и патогенеза ВЗК, причины этой патологии до сих пор неизвестны, а механизмы развития не до конца ясны (Валуйских Е.Ю., 2009, Халиф И.Л., 2011). В последнее время в литературе активно обсуждается роль апоптоза в патогенезе ВЗК. Дефект в механизмах апоптоза может оказаться ключевым фактором избыточной аккумуляции лейкоцитов в ткани кишечника, значительной продукции ими различных провоспалительных молекул и, как результат, персистенцией воспалительного процесса при ЯК и БК (Ливзан М.А. и соавт., 2010).
Иммунная система слизистой кишечника в норме располагает специальными механизмами контроля за ходом реакций иммунного ответа. Реализация апоптоза происходит через специфические рецепторы, относящийся к семейству ФНО – (Fas) и Bcl-2-генов, в которой выделяют проапоптотические белки – Bax и Bak и антиапоптотические - Bcl-2. Возможная чрезмерная экспрессия проапоптотических или апоптотических факторов, нарушая клеточный гомеостаз, может приводит либо к апоптозу, либо увеличивать резистентность лейкоцитов к апоптозу и повышать их жизнестойкость (Осадчук А.М., 2007, Комаров Ф.И., 2008). Важная роль в индукции апоптоза принадлежит цитокину – ФНО-, избыточная продукция которого иммунокомпетентными клетками приводит к превалированию антиапоптотических и подавлению проапоптотического факторов (Chaparro M., 2012).
Используемые в настоящее время основные группы препаратов для лечения ЯК и БК, видимо, способны оказывать влияние на механизмы апоптоза активированных Т-клеток, уменьшая иммуновоспалительную реакцию в стенке кишечника. В то же время терапия этими препаратами проводится эмпирически и далеко не всегда успешна.
С этих позиций изучение особенностей апоптоза иммунокомпетентных клеток при различных клинических формах ЯК и БК представляет несомненный теоретический и практический интерес. С одной стороны, это позволит уточнить механизмы хронизации иммуновоспалительного процесса в кишечной стенке, с другой – открывает перспективу для разработки дополнительных диагностических и прогностических критериев, позволяющих оптимизировать лечение ЯК и БК и повысить её эффективность.
Цель исследования: определить клинико-диагностическое и прогностическое значения некоторых маркеров апоптоза у больных язвенным колитом и болезнью Крона.
Задачи исследования:
1. У больных с язвенным колитом и Болезнью Крона изучить экспрессию Fas (CD-95), Fas-L (CD-95-L), Bcl-2 и синтез ФНО- лейкоцитами периферической крови в период обострения заболевания.
2. Установить взаимосвязи между уровнем экспрессии маркеров апоптоза иммуноцитами периферической крови больных язвенного колита и болезнью Крона – с одной стороны, и полом, возрастом, стадией, клиническими формами заболевания, синтезом ФНО- лейкоцитами крови – с другой.
3. Проследить динамику экспрессии Fas (CD-95), Fas-L (CD-95-L), Bcl-2 и синтеза ФНО- лейкоцитами периферической крови в ходе лечения больных язвенного колита и болезнью Крона в сопоставлении с его результатами.
4. Определить диагностическую и прогностическую информативность показателей изучаемых маркеров апопотоза при язвенного колита и болезни Крона.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изучение особенностей экспрессии CD-95 (APO-1/Fas), CD-95-L, Bcl-2 ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови во взаимосвязи с показателями синтеза ФНО- лейкоцитами крови у больных с различными клиническими формами язвеннго колита и болезни Крона. Впервые установлен факт повышения уровня нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, экспрессирующих CD-95 (APO-1/Fas), Bcl-2 в период острых клинических проявлений ЯК и БК. Не установлено зависимости уровня изучаемых показателей от половой принадлежности и возраста пациентов с ЯК и БК. Впервые установлена зависимость апоптотической активности ПМЯЛ и лимфоцитов периферической крови от тяжести течения, распространенности, индекса клинической активности воспалительного процесса при ЯК и БК. Показано, что при тяжелом течении ЯК, с тотальным и левосторонним поражением толстой кишки и максимальной степенью активности воспалительно-деструктивного процесса в СОТК готовность ПМЯЛ и лимфоцитов периферической крови к апоптозу наиболее низкая. При активной БК наибольшее количество нейтрофильных лейкоцитов, экспрессирующих CD-95 и Bcl-2 наблюдалось в группе пенетрирующей формой и непрерывным характером течения заболевания, а экспрессия CD-95-L ПМЯЛ была наименьшей. Выявлена положительная корреляционная связь между индексом клинической активности ЯК, БК и уровнем ПМЯЛ и лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих CD-95, Bcl-2, и обратная – с CD-95-L. Установлена прямая зависимость между уровнем экспрессии изучаемых маркеров апоптоза ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови ЯК и БК и способностью ПМЯЛ и МНК к продукции ФНО-. Впервые охарактеризована динамика экспрессии CD-95 (APO-1/Fas), CD-95-L, Bcl-2 иммуноцитами больных ЯК и БК в ходе стационарного этапа лечения и в течение 12 месяцев наблюдения за больными. Проведена оценка влияния основных групп препаратов на экспрессию CD-95, CD-95-L, Bcl-2 и синтез ФНО- иммуноцитами крови. Установлено, что ингибитор ФНО- Инфликсимаб обладает наибольшей проапототической активностью в отношении лейкоцитов крови. Впервые показано, что клинической ремиссии ЯК и БК свойственна нормализация апоптотической активности ПМЯЛ и лимфоцитов. Впервые, с использованием логистического регрессионного анализа определена вероятность эффективности предстоящего лечения больных с ВЗК.
Практическая значимость. Результаты диссертационного исследования имеют существенное значение для клиники внутренних болезней и практического здравоохранения в целом.
Комплексное исследование экспрессии маркеров апоптоза ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови, а также особенностей синтеза ФНО- МНК и ПМЯЛ даёт возможность расширить имеющиеся научные представления о патогенезе язвенного колита и болезни Крона.
Установленные взаимосвязи и особенности экспрессии изучаемых показателей апоптоза лейкоцитами у больных с ЯК и БК с фазой болезни, локализацией воспалительного процесса, клинической активностью, характером течения заболевания, синтезом ФНО- могут использоваться в качестве дополнительных клинико-диагностических тестов рассматриваемой патологии. Охарактеризована динамика экспрессии маркеров апоптоза ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови больных ЯК и БК на фоне базисной терапии через 4 и 48 недель наблюдения. Установлено, что ингибитор ФНО- - инфликсимаб обладает более выраженным проапоптотическим эффектом в отношении лейкоцитов крови больных ЯК и БК, что сопровождается значительным снижением их способности к продукции CD-95, Bcl-2 и ФНО-. На основании полученных результатов исследования разработана методика выбора оптимального лечебного подхода, определены дополнительные прогностические критерии возможного течения ЯК и БК, а также предложен алгоритм ведения больных ВЗК врачам первичного звена здравоохранения.
Основные положения, выносимые на защиту:
- повышение уровня ПМЯЛ и лимфоцитов, экспрессирующих CD-95 (APO-1/Fas) и Bcl-2 и снижение количества лейкоцитов крови, продуцирующих CD-95-L периферической крови в активной стадии ЯК и БК;
- зависимость уровня иммуноцитов крови, экспрессирующих CD-95 (APO-1/Fas), СD-95-L, Bcl-2 от возраста пациентов, активности воспалительного процесса, локализации, тяжести, характера течения и уровня продукции ФНО- лейкоцитами больных ЯК и БК;
- наличие особенностей экспрессии CD-95, CD-95-L , Bcl-2 и синтеза ФНО- лейкоцитами периферической крови в динамике лечения ЯК и БК различными группами базисных препаратов и при разных его результатах;
- возможность использования показателей экспрессии исследуемых маркеров ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови с целью прогнозирования тяжести течения и результатов лечения ЯК и БК.
Личный вклад автора. Автором лично составлен подробный обзор литературы, охватывающий современные представления о механизмах апоптоза и патогенезе воспалительных заболеваний кишечника. Диссертантом проведено комплексное клиническое обследование, включая особенности экспрессии маркеров апоптоза и синтеза ФНО- в динамике лечения больных ВЗК. Автором лично проанализированы полученные результаты на основе статистической обработки, сделаны объективные выводы и практические рекомендации, построены прогностические модели и предложены алгоритмы введения больных ВЗК для врачей первичного звена здравоохранения.
Практическое использование полученных результатов. Результаты исследования внедрены и используются в практике работы гастроэнтерологического отделения Ставропольского краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи, гастроэнтерологического отделения 2-й городской клинической больницы г. Ставрополя, в учебном процессе кафедр факультетской и госпитальной терапии, пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Минздрава России.
Публикации и апробации работы. Материалы диссертации изложены в 21 научной работе, в том числе в 3-х журналах ремомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Медицинский Вестник Северного Кавказа» 2011, 2012, «Вестник северо-западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова» 2012); на 7-й Научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И. Мечникова (Москва, 2010); на научно-практической конференции, посвященной 50-летию организации Дагестанского научного общества терапевтов и 90-летию его основателя профессора Х.Э. Гаджиева (Махачкала, 2010); на 18-й итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Ставропольской государственной медицинской академии (Ставрополь, 2010); на 5-м Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2010); на научно-практической конференции «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Василенковские чтения) (Москва, 2010); на 12-м международном конгрессе хирургов и гастроэнтерологов (Баку, 2011); на 4-м Санкт-Петербурском Международном научно-медицинском фестивале «Врач-Провизор-Пациент» (Санкт-Петербург, 2011); «Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии» 2010-12; на Международном Славянско-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро – 2011» и «Санкт-Петербург – Гастро – 2012»; на научно-практической конференции «Медицинская реабилитация в колопроктологии» (Ставрополь, 2012).
Апробация работы проведена на заседании кафедр пропедевтики внутренних болезней, госпитальной терапии, терапии с курсом диетологии, клинической фармакологии, аллергологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Минздрава России.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из обзора литературы, 4 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 75 отечественных и 137 иностранных источника. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 28 таблицами, 22 рисунками.
Диссертационное исследование выполнено на кафедре пропедевтики внутренних болезней Ставропольской государственной медицинской академии в соответствии с планом научных исследований. Номер государственной регистрации 01200801277.
Механизмы апоптоза
Проблема исследования молекулярных механизмов запрограммированной гибели клетки стала в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем клиники внутренних болезней. Трудность этой проблемы, очевидна: несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор остаются не исследованными механизмы этого явления, не до конца выяснена регуляция апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме. Актуальность этой проблемы определяется взаимосвязью нарушений регуляции процесса запрограммированной гибели клетки с большинством заболеваний. Выявление конкретных механизмов нарушения регуляции апоптоза, сопровождаемых конкретными заболеваниями, позволит определить этиологию и патогенез данных заболеваний и, как следствие, этого -возможность коррекции нарушений регуляции запрограммированной гибели клетки [7,9, 36, 90].
Для запрограммированной гибели клетки закрепился термин - апоптоз (от греческого аро - отделение + ptosis - падение). Клетки вступают на стадии жизненного пути, такие как деление, рост, развитие, дифференцировка и, как это выяснилось совсем недавно - на путь гибели клетки. Следует заметить, что проблеме гибели клетки учеными уделялось значительно меньше внимания, чем другим этапам жизненного пути клетки. Первые высказывания о существовании процесса гибели клеток в многоклеточном организме появились еще в конце XIX века [19]. Однако годом признания апоптоза как физиологического явления, считается 1972 год, когда английские исследователи Kerr, Wyllie, Currie представили убедительные морфологические доказательства существования этого явления [14, 176]. Показано, что во взрослом организме апоптоз распространен в различных типах тканей. Он встречается как в медленно пролиферирующей популяции клеток (гепатоциты, клетки эпителия коры надпочечников), так и в быстро пролиферирующих клеточных популяциях. В первом случае он выполняет функцию гомеостатичской регуляции оптимального объема ткани. Во втором случае роль апоптоза, в основном, связана с дифференцировкой клеток [72, 88]. Harmon B.V, Carder A.M. и др. установили, что воздействие радиации вызывает апоптоз в пролиферирующих клетках эпителия кишечника и в непролиферирующих клетках иммунной системы [161].
В полностью сформированном организме запрограммированная гибель клеток регулирует поддержание тканевого гомеостаза, включая слущивание эпителиальных клеток слизистой оболочки ЖКТ [86]. В трудах М.И. Зарайского было отмечено, что в лимфоидной ткани также происходит распад хроматина на отдельные фрагменты [30]. В 1980-х и начале 90-х годов стало очевидно, что апоптоз является важным механизмом регуляции созревания Т-клеток в тимусе. Без этого регуляторного механизма неконтролируемое развитие незрелых Т-клеток привело бы к активизации аутореактивности. В начале 1990-х годов в работах Ярилина А.А. было доказано, что механизмы апоптоза могут быть запущены и в зрелых периферических Т-клетках [75]. Установлено, что, апоптоз играет важную роль в регулировании жизнедеятельности Т-клеток. На ранних этапах развития иммунной системы человека тимоциты, экспрессирующие нефункциональные или аутореактивные Т-клеточные рецепторы, разрушаются посредством механизма запрограммированной гибели клеток. Далее, апоптоз в зрелых Т-клетках приводит к уничтожению избыточного количества Т-эффекторов, возникших в ходе реакций иммунного ответа. Нарушение физиологического апоптоза клеток иммунной системы приводит к развитию аутоиммунных реакций, новообразованиям, а также иммунодефицитным состояниям [4].
Пути реализации программы апоптоза разнообразны, зависят как от индивидуальных особенностей, так и от характера и степени выраженности внешних и внутренних воздействий, вызывающих ее включение. Многое в механизмах осуществления апоптоза остается неясным, сигнальные пути передачи апоптотического сигнала переплетаются с сигнальными путями других программ жизнедеятельности клеток, создавая сложную картину внутри- и межклеточных взаимодействий, лежащих в основе регуляции и саморегуляции клеточного роста и дифференцировки. Однако некоторые механизмы достаточно изучены. Известны две основные пути апоптоза: 1) внутренний путь разрушения клетки, который контролируется семейством Вс12 и в который вовлечены митохондрии, и 2) внешний путь разрушения клетки, связанный с передачей сигнала о том, что клетка должна быть элиминирована, на особые рецепторы апоптоза (их также называют рецепторами разрушения, рецепторами смерти, рецепторами клеточной гибели) [20]. Эти два пути работают во взаимосвязи и нацелены на регулирование процессов созревания и функционирования Т-лимфоцитов. В противоположность этим двум механизмам цитокины и факторы роста способствуют поддержанию жизнеспособности Т-клеток [17,72].
Внешний путь, связанный с сигнальной трансдукцией, запускается при условии взаимодействия рецепторов апоптоза с соответствующими лигандами (например, FAS, также называемый CD95, связывается с лигандом FASL, рецептор фактора некроза опухоли-1 (OHOR1) связывается с ФНО, и т.д.) [7,123]. Как только произошло взаимодействие между рецептором и лигандом, внутриклеточный участок (домен) рецептора апоптоза начинает притягивать молекулы вещества-адаптера — Fas-ассоцированного домена разрушения (FADD). Адаптеры притягивают каспазы 8 и 10, происходит их активация и формирование сигнального комплекса индукции апоптоза (DISC)[9, 17, 127]. В другом случае для передачи и усиления сигнала о необходимой элиминации клетки требуется подключение митохондриального пути (клетки 2 типа). В этой ситауции каспазы 8 и 10 активируют Вс12-взаимодействующий домен (BID), который перемещается в митохондрию и индуцирует высвобождение цитохрома С. Цитохром С, в свою очередь, взаимодействует с апоптотическим фактором активации протеаз-1 (APAF1) и неактивной формой каспазы 9; эти три фактора вместе формируют так называемую апоптосому [99]. В апоптосоме происходит активация каспазы 9 (за счет отщепления неактивного фрагмента по аденозинтрифосфат-зависимому пути). После этого происходит активация эффекторных каспаз 3, 6и7(рис.1) [14,20, 83].
Внутренний путь обычно опосредуется митохондриями. Проапоптотические сигналы вызывают перестройку митохондриальной мембраны с последующим выходом цитохрома С в цитоплазму. Активация внутреннего апоптотического пути зависит от баланса между проапоптотическими факторами, такими как ВАХ или ВАК, и ингибирующими факторами, такими как Вс12 и BclXL. Чрезмерная экспрессия проапоптотических или апоптотических факторов нарушает клеточный гомеостаз и приводит либо к апоптозу, либо к повышенной жизнестойкости. Важной регуляторной молекулой является также р53, которое отвечает за сохранение в организме только нормальных клеток [19, 188]. В случае геномного повреждения ДНК или значительного стресса, пережитого клеткой, р53 перемещается из цитоплазмы в ядро и запускает транскрипцию проапоптотических факторов, приводящих к элиминации клетки [30,36].
Влияние фармакологических препаратов на апоптоз
В клинике открываются огромные перспективы перед модуляцией процессов программируемой клеточной смерти в качестве терапевтической стратегии при многих аутоиммунных заболеваниях.
Одним из этих направлений является блокада или активация молекул, участвующих в процессах апоптоза. Блокада отдельных генов с помощью РНК-технологий или модифицирование белков сигнальных путей становится доступным методом для модуляции апоптоза в отдельных тканях в определенные моменты времени. Ингибиторы каспаз, а также ингибиторы высвобождения цитохрома сегодня проходят клинические исследования при ревматоидном артрите и рассеянном склерозе [231].
Следующим направлением является усиление элиминации апоптотических клеток фагоцитами. Сегодня доказана возможность фармакологического воздействия на макрофаги для усиления очищения тканей от апоптотических клеток. Одним из таких классов лекарственных препаратов являются ГКС. Центральное место в исследовании апоптогенного действия гормонов принадлежит изучению влияния глюкокортикоидов (ГК) на лимфоидные клетки [14]. Чувствительность незрелых тимоцитов к ГК-индуцированному апоптозу характерна для многих биологических видов, в том числе для человека, грызунов и птиц. Чувствительность Т-клеток к ГК зависит от стадии развития лимфоцитов. Пре-Т-клетки костного мозга и незрелые Т-клетки тимуса чувствительны к физиологическим дозам ГК. Ранее считалось, что зрелые медулярные тимоциты и периферические лимфоциты резистентны к ГК. Однако недавно было показано, что определенные субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов (натуральные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты) претерпевают апоптоз под действием ГК. В-клетки также чувствительны к ГК в зависимости от стадии своего развития. Пре-В-клстки и незрелые В-клетки гибнут путем апоптоза под действием ГК. Зрелые В-лимфоциты нечувствительны к ГК. Действие гормонов опосредовано внутриклеточными специфическими рецепторами. Рецептор, связывая лиганд, регулирует транскрипцию гормоно-чувствительных генов. Это могут быть гены, продукты которых регулируют продвижение клетки по клеточному циклу или апоптоз-специфические гены [16 ].
Глюкокртикостероиды через свои рецепторы активируют эту функцию макрофагов вследствие перепрограммирования дифференцировки макрофагов в клетки с фагоцитарным фенотипом, усиленным образованием ламелиподии и увеличением размеров клеток. Важным является то, что усиление фагоцитарных функций макрофагов под воздействием глюкокортикостероидов происходит без увеличения секреции провоспалительных цитокинов.
Азатиоприн известен как достаточно эффективный препарат, позволяющий поддерживать состояние ремиссии при ВЗК. В работах Tiede I с соавторами терапевтический эффект азатиоприна объясняется проапоптотическим действием его метаболита 6-тиогуанина, который подвергается фосфорилированию [230]. Конечный продукт 6-тиогуанозинтрифосфат является ингибитором Rac 1; он может связываться с Rac 1 вместо замещения валентности гуанозинтрифосфатом. Так как Rac 1 вовлекается в активацию каскада МАРК и сигнальных путей NFk[3 и Вс12, то ингибирование Rac 1 приводит к снижению активации антиапоптотических факторов, что влияет на баланс процессов митохондриально-опосредованного апоптоза [230].
Более перспективным иммунодепрессантом в терапии язвенного колита является циклоспорин. После поступления в клетки-мишени он связывается с циклофиллином, инактивирует кальциневрин и препятствует ядерному фактору активированных Т-клеток, индуцирующего транскрипцию РНК, ответственного за синтез Ил-2 и его рецептора [40].
Doring и др. исследовали индуцированный сульфасалазином апоптоз Т-клеток собственной пластинки слизистой и периферических Т-клеток, выделенных от пациентов с БК, ЯК и контрольной группы [118]. Апоптотический эффект сульфасалазина осуществлялся по FAS-независимому пути, но при этом вовлекался митохондриальный путь апоптоза. Анализ проапоптотических и антиапоптотических факторов не выявил никаких изменений в экспрессии В АХ и ВАК при применении 5-АСК, но значительно снизилось количество антиапоптотических молекул Вс12 и BclXL. Авторы пролагают, что такой дисбаланс вызывает активацию каспазы 9 с последующей индукцией апоптоза Т-клеток. Следует также отметить способность салицилатов ингибировать NF-kB и тем самым оказывать противоопухолевый эффект [18]. Кроме указанных механизмов, апоптоз Т-клеток при ВЗК могут вызывать и другие иммуносупрессоры, например, микофенолат мофетил [93].
Таким образом, многие известные иммуносупрессоры оказывают то или иное влияние на процессы индукции апоптоза Т-клеток у больных ВЗК, а селективная антиапоптотическая терапия представляет собой новый и перспективный подход к лечению ВЗК.
Последние исследования на животных показали, какую важную роль в индукции апоптоза Т-клеток собственной пластинки играют антитела к противовоспалительным цитокинам (анти-ИЛ-12, анти-ФНО-а) или к их рецепторам (анти-ИЛ-бЯ) [23]. ФНО-а является точкой приложения в терапевтических разработках, проходящих сейчас клинические испытания; блокада активности ФНО-а — это новый подход в терапии ВЗК. В первом, неконтролируемом пилотном исследовании, проведенном на 10 пациентах с рефрактерной БК, был получен выраженный ответ уже после однократного введения человеческих-мышиных химерных ФНО-а-нейтрализующих антител — инфликсимаба. Эффект от лечения наступал быстро (в течение нескольких дней), сопровождался повышением уровней С-реактивного белка в сыворотке, тогда как концентрация секретируемой фосфолипазы А2 (sPLA2) быстро снижалась; у всех пациентов наблюдалось заживление язвенных дефектов слизистой оболочки [197].
В последних исследованиях ряд авторов сконцентрировали свое внимание на роли индуцированного инфликсимабом апоптоза Т-лимфоцитов. Как уже упоменалось, Т-клетки собственной пластинки слизистой при БК оказываются резистентными к апоптозу. Для них характерно повышенное соотношение Bcl-2/Bax. Исследователями было изучение влияние инфликсимаба на апоптоз СБЗ/СВ28-стимулированных Т-лимфоцитов и отмечено значительное повышение соотношения Вах (проапоптотического фактора) и Вс1-2 (антиапоптотического фактора). Как и ожидалось, это привело к повышению уровня апоптоза Т-клеток, на которые воздействовали инфликсимабом, но только в том случае, если клетки были предварительно активированы. Хотя детали механизма индукции апоптоза еще не выяснены, полученные данные позволяют предположить, что инфликсимаб, помимо противовоспалительного действия, действует также в роли «иммунотоксина», специфически нацеленного на активированные Т-лимфоциты. У пациентов с активной БК, получавших инфликсимаб, авторы обнаружили быстрое (в течение 24 часов после введения) повышение числа апоптотических CD3+ Т-клеток собственной пластинки, при этом не наблюдалось никаких видимых изменений со стороны пула Т-лимфоцитов периферической крови, а также со стороны маркеров апоптоза [184].
Экспрессия CD-95, CD-95-L и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами у больных язвенным колитом
Количество иммуноцитов крови, экспрессирующих CD-95, CD-95-L и Вс1-2 определяли у 80 больных активным ЯК (37 мужчин и 43 женщин). Средний возраст больных составил 41,4 лет. Контрольную группу составили 20 здоровых добровольцев, сопоставимых по возрасту.
Сравнительная характеристика экспрессии CD-95, CD-95-L и Вс1-2 у больных активным ЯК и здоровых представлена на рисунке 4.1.
Установлено, что в период обострения ЯК количество лейкоцитов крови, экспрессирующих CD-95 и Вс1-2 повышено, a CD-95-L - снижено (рис. 4.1) Количество нейтрофилов, экспрессирущих CD-95 составило 74,3±4,7%, а лимфоцитов - 83,8±6,4% (Р 0,005 с контролем). Уровень иммуноцитов, экспрессирующих Вс1-2 значительно превышало таковую у здоровых лиц (77,45±5,5% и 69±6,7%, Р 0,001). Количество ПМЯЛ, продуцирующих CD-95-L составило 7,05±2,3% и лимфоцитов - 2,6±2,7% ((Р 0,005 с контролем).
Уровень иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих маркеров апоптоза был проанализирован с учетом тендерных различий больных. При этом не было установлено достоверной разницы в продукции CD-95, CD-95-L и Вс1-2 в зависимости от пола (рис. 4.2)
Были исследованы особенности экспрессии маркеров апоптоза лейкоцитами крови, с учетом возраста больных ЯК. Согласно данным, не выявлено различий в количестве иммуноцитов крови, продуцирующих CD-95, CD-95-L и Bcl-2 в различных возрастных группах пациентов с ЯК
Установлено, что в период выраженных клинических проявлений ЯК количество нейтофилов и лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих CD-95 и Вс1-2, было повышено пропорционально тяжести заболевания, a CD-95-L находилось в обратной зависимости от клинических проявлений ЯК, что, видимо, отражает определенную зависимость тяжести течения ЯК от апоптотической готовности ПМЯЛ и лимфоцитов.
Нами был проведен корреляционный анализ между количеством лейкоцитов крови, продукцирующих CD-95, CD-95-L и Вс1-2 и клиническим индексом активности ЯК (индекс Рахмилевича) с использованием непараметрического метода ранговой корреляции Спирмена (табл. 4.2). Выявлена прямая достоверная зависимость между индексом клинической активности и уровнем иммуноцитов крови, экспрессирующих CD-95 и Bcl-2, и обратная - с CD-95-L.
Учитывая тот факт, что тяжесть течения ЯК определяется выраженностью воспалительно-деструктивного процесса в толстой кишке (СОТК), нами проведен анализ количества лейкоцитов крови, продукцирующих CD-95, CD-95-L и Bcl-2 в зависимости от обсуждаемого критерия (рис.4.4).
Установлено (рис. 4.4), что количество ПМЯЛ и Лф, продукцирующих CD-95 и Bcl-2 в период активного ЯК находилось в прямой зависимости от степени активности воспалительного процесса в толстой кишке. Наиболее высокие показатели уровня иммуноцитов крови, экспрессирующих CD-95 и Bcl-2 наблюдались при 2-й и, особенно 3-й степени (2-я и 3-я группы) активности воспалительно-деструктивного процесса в СОТК. При этом уровень нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов, синтезирующих CD-95-L возрастал обратно пропорционально степени воспалительного процесса в СОТК.
Представлял определенный интерес изучение уровня лейкоцитов крови, экспрессирующих CD-95, CD-95-L и Всі-2 в зависимости от характера (формы) течения ЯК. Во всех группах количество полиморфноядерных нейтрофилов, продукцирующих CD-95 и Bcl-2 было повышено. У больных 3-й группы значительно превышала показатели в 1-й и 2-й группах пациентов. Следовательно, наиболее высокая продукция изучаемых маркеров наблюдалась у больных непрерывной формой ЯК. Не выявлено достоверных различий количества лимфоцитов крови, экспрессирующих CD-95 и Bcl-2 от формы заболевания. В то же время, в группе больных с первой атакой ЯК уровень ПМЯЛ и лимфоцитов, экспрессирующих CD-95-L был наиболее высокий в сравнении со 2-й и 3-й группами, а в количестве иммуноцитов крови, экспрессирующих CD-95-L между 2 и 3 группами достоверных различий не выявлено (табл.4.3).
Моделирование клинического течения и эффективности терапии ВЗК на основании показателей апоптоза и ФНО-а
Прогностические модели клинического течения ЯК и БК построены с помощью пошаговой множественной регрессии. В качестве переменных нами были избраны степень активности воспаления по Рехмилевичу (в группе больных ЯК); индекс Беста (в группе пациентов с БК); эндоскопическая картина заболевания (индекс Мейо); уровень маркеров апоптоза (CD-95, CD-95-L, BcL-2 и ФНО-а).
Для изучения особенностей течения ВЗК посредством анализа канонических корреляций оценивали взаимосвязь между двумя группами показателей. Первую группу образуют зависимые признаки или признаки-результаты. Вторую группу образуют независимые или причинные признаки. Нами исследовались следующие группы параметров:
- первая комбинация признаков (ЯК) - индекс Рехмилевича (ИР).: эндоскопическая ремиссия (ЭР: наличие признака - 1, отсутствие - 0) и показатели апоптоза (CD-95, CD-95-L, BcL-2 и ФНО-а);
- вторая комбинация признаков (БК) - индекс Беста (ИБ), эндоскопическая ремиссия (наличие признака - 1, отсутствие - 0) и показатели апоптоза (CD 95, CD-95-L, BcL-2 и ФНО-а).
Коэффициент корреляции первых канонических линейных комбинаций маркеров апоптоза, индекса клинической активности по Рахмилевичу и эндоскопической ремиссии у пациентов с ЯК составляет 0,512 при уровне значимости 0,002 (табл. 4.23).
Коэффициент корреляции канонических линейных комбинаций маркеров апоптоза, индекса Беста (ИБ) и эндоскопических показателей у больных БК составляет 0,462 при уровне значимости 0,032 (табл. 4.24).
Таким образом, использование канонического корреляционного анализа позволило найти максимальные связи между показателями, характеризующими активность течения заболевания, маркерами апоптоза и наличием эндоскопических признаков ремиссии.
В каждой группе найдены линейные комбинации исходных признаков, имеющих максимальные корреляции. Количественно выражена связь между показателями активности, маркерами апоптоза и эндоскопическими признаками ремиссии. Для выявленных комбинаций факторов построены статистически достоверные линейные модели: ИР + 0,624 ФНО-а , где У\ - функция для определения характера течения и исхода ЯК, ИР - индекс Рехмилевича от 1 до 3, ЭР эндоскопическая ремиссия (при наличии ЭР - 1 балл, при отсутствии - 0 баллов), CD-95, CD-95-L, BcL-2 и ФНО-а - маркеры апоптоза (при значениях выше нормы - 1 балл, при нормальном уровне - 0 баллов) Y2 = 2,5 ЭР - 0,324 CD-95 + 0,260 CD-95-L + 0,246 BcL-2 + 0,463 ИБ + 0,568 ФНО-а , где Y2 - функция для определения характера течения и исхода БК, ИБ - индекс Беста от 1 до 4, ЭР - эндоскопическая ремиссия (при наличии ЭР - 1 балл, при отсутствии - 0 баллов), CD-95, CD 95-L, BcL-2 и ФНО-а - маркеры апоптоза (при значениях выше нормы - 1 балл, при нормальном уровне - 0 баллов)
Градации полученных значений: 2,0-2,5 балла - ремиссия, 1,5-2,0 балла - низкая активность заболевания (благоприятное течение), 1,0-1,5 балла - средняя степень активности (прогноз сомнительный), 0,5-1,0 балла -высокая активность (неблагоприятное течение, необходима коррекция терапии), 0,5 баллов - крайне тяжелое течение (показания к оперативному лечению).
Учитывая данные корреляционного, дисперсионного и регрессионного анализа, можно предложить алгоритм прогнозирования клинического течения ВЗК. Алгоритм отличается от существующих анализом не только традиционных клинических, инструментальных и лабораторных данных, но и маркеров апоптоза (рис. 4.18).
Прогнозирование эффективности терапии больных ВЗК на основании показателей маркеров апоптоза
Влияние лечения на эффективность различных схем терапии у больных ВЗК оценивали с использованием аппарата дискриминантного анализа. В качестве классифицирующего фактора была выбрана группа больных (1 -пациенты, получавшие стандартную терапию, 2 - больные, получающие лечение с использованием биологических агентов), в качестве независимых переменных исследовались уровни маркеров апоптоза (CD-95, CD-95-L, BcL-2 и ФНО-а). В таблице 4.25 приведены результаты дискриминантного анализа.
На основании величин стандартизированных коэффициентов канонической дискриминантной функции, наибольший вклад в дискриминацию межгруппового фактора «лечение» внесли уровень ФНО-а и CD-95-L, затем - уровень CD-95 и BcL-2. Исходя из знаков коэффициентов этих переменных, вклады маркеров апоптоза в дискриминацию больных ВЗК по подходам к лечению были однонаправленными.
Таким образом, факторы апоптоза внесли совместный вклад в дискриминацию больных по виду терапии, при этом их уровень был достоверно выше у лиц с высокой активностью иммунного воспаления.
Рисунок 4.19 иллюстрирует влияние вида терапии на уровень ФНО-а, CD-95 и BcL-2. В левом нижнем углу трехмерной диаграммы рассеивания находятся пациенты, получавшие терапию биологическими агентами, которые имеют более низкие значения маркеров апоптоза, а объекты, символизирующие лиц с традиционной терапией, находятся в правом верхнем углу, они характеризуются высокими уровнями этих маркеров.
