Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о патогенезе и прогностическом значении тубуло-интерстициального фиброза в течении хронических гломеурлонефритов (обзор литературы)
1.1. Вступление 10
1.2. Клинико-морфологические аспекты патогенеза тубуло- 12 интерстициального фиброза при гломерулопатиях
1.3. Возможности масс-спектрометрии в нефрологии 19
ГЛАВА 2. Материалы и методы клинического исследования 22
2.1. Дизайн исследования 22
2.2. Клиническая характеристика групп 24
2.3. Методы исследования 28
ГЛАВА 3. Клинико-морфологические особенности и протеомный паттерн мочи при IgA-нефропатии и фокально-сегментарном гломерулосклерозе
3.1. Особенности клинико-мофологической картины и 37
молекулярного профиля мочи при IgA-нефропатии и фокально сегментарного гломерулосклерозе
3.2. Белки молекулярного профиля мочи у пациентов с фокально-сегментарным гломерулосклерозом и IgA-нефропатией и их роль в патогенезе нефрита
ГЛАВА 4. Выделение белков-маркеров воспаления тубуло-интерстициальной ткани при IgA-нефропатии и фокально сегментарного гломерулосклерозе
4.1. Особенности клинико-морфологической картины при 55
тубуло-интерстициальном фиброзе у пациентов с IgA-нефропатией и фокально-сегментарным гломерулосклероозом
4.2. Особенности молекулярного профиля мочи при тубуло-интерстициальной фиброзе у пациентов с IgA-нефропатией и фокально-сегментарным гломерулосклероозом
4.3. Анализ молекулярных биомаркеров тубуло- 63
интерстициального фиброза у пациентов с фокальным сегментарным гломерулосклерозом и IgА–нефропатией
Заключение 119
Выводы 131
Практические рекомендации 132
Список сокращений 133
Указатель литературы 135
- Клинико-морфологические аспекты патогенеза тубуло- 12 интерстициального фиброза при гломерулопатиях
- Клиническая характеристика групп
- Белки молекулярного профиля мочи у пациентов с фокально-сегментарным гломерулосклерозом и IgA-нефропатией и их роль в патогенезе нефрита
- Особенности молекулярного профиля мочи при тубуло-интерстициальной фиброзе у пациентов с IgA-нефропатией и фокально-сегментарным гломерулосклероозом
Введение к работе
Актуальность темы
Диагностика и лечение хронического гломерулонефрита является актуальной задачей современной терапевтической клиники. Согласно регистру ERA-EDTA хронический гломерулонефрит в 14% случаев становится причиной хронической почечной недостаточности (ХПН) в странах Европы (K/DOQI, 2012). Причем у большинства пациентов (в 80 % случаев) наблюдается малосимптомное начало заболевания, диагностируемое в ходе исследования мочевого осадка (Шилов, Е.М., 2010).
Формированию новых оригинальных представлений о патогенезе хронического гломерулонефрита способствовали геномные, постгеномные исследования иммунных процессов, изучение ультраструктурных клеточных изменений, тканевого и органного ремоделирова-ния при хроническом гломерулонефрите (Мухин, Н.А. и соавт., 2011; Kawasaki, Y. et al., 2011; Bowling, C.B. et al., 2012). Исследования молекулярных механизмов развития нефрита связаны с открытиями в области генома и протеома, освоением новых технологий, позволяющих выявлять биомаркеры патогенеза болезни.
Одним из наиболее важных факторов риска развития ХПН при нефропатии в целом и хроническом гломерулонефрите в частности является тубуло-интерстициальный фиброз (ТИФ), выявление которого маркирует ремоделирование почечной паренхимы (Kassianos, A.J. et al., 2013; Norman, J.T. et al., 2013; Yang, J. et al., 2013).
Для выявления ТИФ при гломерулопатиях в единственным методом является пункционная нефробиопсия с последующим гистологическим исследованием. Вместе с тем в последние годы в нефрологии начинают применяться методы постгеномных исследований, направленные на поиск коррелятивных связей выявляемых маркеров и патологических изменений, обнаруживаемых при гистологическом исследовании биоптата. Целью этих исследований является поиск не-инвазивных методов оценки состояния почечной паренхимы. В частности белковые маркеры-кандидаты были определены в исследованиях Гасанова, М.З. с соавт. (2012), Gonzalez, J. с соавт. (2013). Определение таких маркёров в дальнейшем позволит если не отказаться от нефробиопсии полностью, то по крайней мере быть ее альтернативой в случае невозможности ее проведения, а также при мониторинге риска развития почечных повреждений в процессе лечения пациента. В настоящее время масс-спектрометрия считается наиболее востребо-
ванным и чувствительным методом анализа органических молекул (Писарев, Д.И. и соавт., 2012), который позволяет выявлять белки, участвующие в процессах воспаления, фиброза, ремоделирования, межклеточного взаимодействия. Применение масс-спектрометрии при изучении протеомного паттерна разных форм хронических гломеруло-нефритов и патологических изменений в нефробиоптате поможет сформировать представление о маркёрах-кандидатах, определение которых в дальнейшем позволит верифицировать не только форму нефрита, но и особенности гломерулярного и тубулоинтерстициально-го повреждения, расширив возможности неинвазивной диагностики.
Цель исследования: поиск неинвазивных маркеров тубуло-
интерстициального фиброза в моче при IgA-нефропатии и фокально-
сегментарном гломерулосклерозе (ФСГС) с помощью масс-
спектрометрии белков и определение их диагностического и клинико-
патогенетического значения.
Задачи исследования:
1. Выявить особенности белкового спектра мочи в зависимости от
клинических проявлений, а также стадии хронической болезни по
чек при хроническом гломерулонефрите в целом и в группах IgA-
нефропатии и ФСГС.
-
Установить зависимость между показателями протеомного паттерна и признаками ТИФ при IgA-нефропатии и ФСГС, определить чувствительность и специфичность этих маркеров для каждой группы гломерулонефрита.
-
Оценить диагностичесую ценность и возможную патогенетическую роль выявленных белков в развитии ТИФ при IgA-нефропатии и ФСГС.
-
Разработать оригинальные подходы к прогнозированию риска развития ТИФ, а также прогрессирования IgA-нефропатии и ФСГС с использованием выявленных протеомных маркеров.
Научная новизна и практическая значимость работы
В ходе протеомного анализа были выделены функциональные группы белков, составивших молекулярные профили мочи у пациентов с хроническим гломерулонефритом, которые отражают универсальные пути его развития и прогрессирования. Впервые выделен белковый спектр мочи, характеризующий развитие ТИФ при хроническом гломерулонефрите (при IgA-нефропатии выявляются -цепь кол-
лагена и гепаран-сульфат, при ФСГС - тимозин- 4, трансформирую
щий фактор роста (ТФР ), сосудистый белок клеточной адгезии
(СБКА), белок хемоаттракции моноцитов 1 (МСР-1)), оценена степень
участия каждого белка в патогенезе патологического процесса. Впер
вые разработаны пути неинвазивной диагностики тубуло-
интерстициального фиброза у больных с IgA-нефропатией и ФСГС. С
помощью масс-спектрометрии выделены белки, маркирующие про-
грессирование хронической болезни почек (ХБП).
Основываясь на полученных данных, были усовершенствованы подходы к прогнозированию и профилактике развития ТИФ при хроническом гломерулонефрите, включающие в себя регистрацию новых маркеров-кандидатов. Эти подходы рекомендуется применять в качестве альтернативы повторной нефробиопсии, а также при невозможности ее выполнения или необходимости мониторинга прогрессирования почечного повреждения.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Из протеомного паттерна мочи выделены белки-маркеры морфологической формы хронического гломерулонефрита, а также белки, ассоциирующиеся с клиническими проявлениями болезни (с нефритическим или нефротическим синдромами).
-
На разных стадиях ХБП в моче изменяется экспрессия определенных белков, которые могут служить потенциальными маркерами прогнозирования скорости потери функции почек. При 3А высок уровень выявления аннексина А3, ЗБ - –цепи фибриногена и 4 стадиях ХБП - –цепи фибриногена, -1-антитрипсина, СБКА, молекулы поражения почечной ткани 1 (МППТ - 1).
-
Каждой группе нефрита соответсвуют специфичные белки-маркеры ТИФ, специфичность которых позволяет использовать их в качестве потенциальных маркеров формирования ТИФ при данной патологии. Белками-маркерами ТИФ при IgA-нефропатии являются -цепь коллагена и гепаран-сульфат, при ФСГС - тимо-зин- 4, ТФР , СБКА, МСР - 1.
-
Были выделены функциональные группы белков, составивших молекулярные профили мочи у пациентов с хроническим гломерулонефритом, которые отражают универсальные пути ее возникновения и прогрессирования. Разработаны пути неинвазивной диагностики тубуло-интерстициального фиброза у больных с IgA-нефропатией и фокально-сегментарным гломерулосклерозом,
позволяющие оптимизировать и персонифицировать лечебно-диагностический комплекс мероприятий.
Личное участие автора
Личное участие автора в получении всех новых научных результатов, изложенных в диссертации, осуществлялось на всех этапах работы и включало отбор пациентов, проведение полного клинического обследования, первичную обработку полученного материала, его систематизацию, статистическую обработку и анализ результатов, написание статей в профильных научных журналах, разработку «Способа неинвазивной диагностики тубуло-интерстициального фиброза при IgA-нефропатии» (положительный результат формальной экспертизы № 2014103610/15 (005665) от 19.02.2014г) и «Способ неинвазив-ной диагностики тубуло-интерстициального фиброза при фокально-сегментарном гломерулосклерозе» (положительный результат формальной экспертизы № 2014105030 (008048) от 25.02.2014г), внедрение научного исследования в клиническую практику работы отделения нефрологического клиники ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 журнальные статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, получены положительные результаты формальной экспертизы по двум заявкам на патент.
Апробация результатов исследования
Основные положения диссертации обсуждены на совместном заседании кафедры внутренних болезней с основами физиотерапии № 1 и научно-координационного совета «Научно-организационные основы профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний внутренних органов» ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России (протокол № 12 от 21.03.2014). Материалы диссертации представлены на III Съезде терапевтов Южного федерального округа (Ростов-на-Дону, 2013), III Конгрессе врачей первичного звена здравоохранения Юга России / VIII Конференции врачей общей практики (семейных врачей) Юга России (Ростов-на-Дону, 2013), Южно-региональной научно-практической конференции «Инфекции и воспаление в урологии и нефрологии» (Ростов-на-Дону, 2013), на заседании Ростовского областного общества нефрологов (Ростов-на-Дону, 2013), I научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Воробьёвские чтения» (Ростов-на-Дону, 2014), IX научно-
практической конференции молодых ученых с международным участием «Завадские чтения» (Ростов-на-Дону, 2014).
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах терапевтического профиля ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России, вошли в материалы для чтения лекций врачам-терапевтам на кафедрах ФПК и ППС, внедрены в работу нефрологического отделения клиники ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, иллюстрирована 56 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, состоящих из 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Указатель литературы включает в себя 156 работ, из них 20 отечественных и 136 зарубежных авторов.
Клинико-морфологические аспекты патогенеза тубуло- 12 интерстициального фиброза при гломерулопатиях
В экспериментальных работах N. Marcussen (1990), который применил метод серийного секционного изучения почечной ткани на различных моделях ТИФ, была показана прямая корреляция между снижением скорости клубочковой фильтрации (СКФ) и числом атубулярных клубочков и клубочков, связанных с остатками канальцев (Marcussen, N., 1990; Marcussen, N., 2000).
Так же было показано, что любое повреждение (иммунные комплексы, токсины, гипоксия, механическое воздействие и т.д.) клеток паренхимы почек запускает продукцию ими медиаторов воспаления (провоспалительных цитокинов и факторов роста), которые в свою очередь обеспечивают миграцию мононуклеарных клеток в область повреждения, тем самым формируя воспалительную инфильтрацию (Anders, H.J. et al., 2003). В основном инфильтрат состоит из моноцитов/макрофагов и лимфоцитов, преимущественно Т-лимфоцитов. Макрофаги являются ключевыми клетками в очаге воспаления, принимающими эстафету повреждения через генерацию большого количества кислородных радикалов и липидных медиаторов, которые вызывают локальное повреждение, являясь источником цитокинов и факторов роста: интерлейкина-1 (ИЛ-1), фактора некроза опухоли- (ФНО ), трансформирующего фактора роста- (ТФР-), фактора роста фибробластов (ФРФ), эпителиального фактора роста (ЭФР) и тромбоцитарного фактора роста (ТцФР) (Галишон, П. и соавт., 2013; Eddy, A.A., 2004). Одну из главных ролей наравне с макрофагами и моноцитами в процессе формирования ТИФ играют тубулярные эпителиальные клетки, которые подвергаются воздействию первичных (гипоксия) или вторичных повреждающих факторов, происходящих в том числе из гломерулярного ультрафильтрата (факторы протеинурии, компоненты активированного комплемента, хемокины и цитокины, высвобождающиеся из клеток воспаления в клубочках, липиды) (Strutz F. et al., 2003). Наиболее значимым из них является высокая протеинурия, которая часто сопровождает первичные гломерулярные заболевания. В настоящее время наиболее признанной среди различных гипотез о нефротоксических эффектах протеинурии является гипотеза, согласно которой вызванное компонентами протеинурии экстрагломерулярное повреждение, которое заканчивается ТИФ, реализуется через интерстициальное воспаление (Наточин, Ю.В., 2012; Чеботарева, Н.В. с соавт., 2013). И, несмотря на то, что не все клеточно молекулярные механизмы его развития понятны, имеется достаточное количество экспериментальных и клинических данных, подтверждающих существование патогенетической связи между протеинурией, интерстициальным воспалением и фиброзом (Meyer, T.W., 2003; Wen, Q. et al., 2013).
В 1995 г A.B. Magil впервые выявил связь между уровнем протеинурии и морфологическими признаками тубулоинтерстициального повреждения (Magil, A.B., 1995). При дальнейшем исследовании пациентов с различными морфологическими формами нефрита (IgA-нефропатией, мембранозным и мезангиокапиллярным гломерулонефритом, ФСГС) была выявлена прямая связь между выраженностью инфильтрации интерстиция моноцитами и Т-лимфоцитами и уровнем протеинурии (Ikezumi, Y., 2011; Silva, G.E. et al., 2012).
В 1986 г. T. Bertani с соавт. предположили, что обструкция канальцев цилиндрами при массивной протеинурии приводит к повреждению канальцев. Было показано, что хроническая обструкция проксимальных канальцев белковыми цилиндрами приводит к атрофии не только вышележащих, но и расположенных дистально отделов нефрона (Bertani, T., 1986). А W. Kriz предложил иной механизм образования атубулярных клубочков при гломерулопатиях с высокой протеинурией, который заключался в накоплении плазменных компонентов, проникающих в перигломерулярную область через места адгезии сосудистого пучка к боуменовой капсуле, что постепенно приводило к внешнему сдавлению области тубулогломерулярного соединения и образованию атубулярных клубочков (Kriz, W., 2001).
Однако в последние годы наибольшее признание получила гипотеза тубулоинтерстициального воспаления и ишемии, развивающегося вследствие воздействия на тубулярный эпителий профильтровавшихся белков и связанных с ними макромолекул (Eddy, A.A., 2004). О том, что избыточное количество белка, профильтрованного через гломерулярные капилляры, может обладать «внутренней нефротоксичностью» и способствовать ухудшению почечной функции впервые предположили T. Bertani и G. Remuzzi еще в 1986 г. (Bertani, T., 1986). В последнее время появилась возможность определения в моче и ткани почек больных гломерулонефритом отдельных хемокинов методом ELISA и иммуногистохимическими методами, что помогло выявить моноцитарный хемотаксический протеин-1 (MCP-1) и RANTES - факторы, регулирующие активацию нормальной Т клеточной экспрессии и секреции (Wada, T., 2000). С помощью иммуногистохимических методов и гибридизации in situ было показано, что в ткани почки человека МСР-1 экспрессируется тубулярными эпителиальными клетками, мононуклеарными клетками инфильтрата в зонах интерстициального воспаления и эндотелиальными клетками сосудов (Nishihara, K., 2013). Согласно большинству исследований, которые проводились при заболеваниях почек, МСР-1 играет важную роль в прогрессировании гломерулонефрита и развитии почечной недостаточности, за счет формирования тубулоинтерстициального повреждения.
Клиническая характеристика групп
У каждого пациента с ФСГС и IgА–нефропатией, а также у здоровых лиц выполнен забор биообразцов мочи в специальные стерильные контейнеры. Процесс пробоподготовки мочи к проведению выделения и идентификации пептидов и белков включал выполнение центрифугирования биообразца (1 мл мочи) на скорости 12000 об/мин и проведение аффинной хроматографии биообразца с целью удаления маскирующих белков (хроматографические колонки Econo - Pac 10 DG Desalting Columns, 30, набор для очистки сывороточного IgG Econo - Pac Serum IgG Purification Kit, Bio-Rad, США).
В настоящем исследовании разделение отдельных пептидов и белков мочи пациентов с ФСГС и IgА – нефропатией производилось с помощью стандартных наборов, включающих 3 вида хроматографического разделения (MB-HIC C8 Kit, MB-IMAC Cu, MB-Wax Kit, Bruker, США).
Получение масс-спектрограмм выделенных белков, полипептидных цепей и пептидов выполняли на основе MALDIOFOF-МS (прибор Ultraflex II, Bruker, США). Подготовка выделенных белков, полипептидных цепей и пептидов к МС исследованию выполнялась в соответствии со следующими алгоритмами. Проведению масс-спектрометрического анализа предшествовало нанесение пептидных (Mr в диапазоне от 700 до 4000 Дa) и белковых стандартов (Mr в диапазоне от 3000 до 45000 Дa) на сверхчувствительную планшету AnchorChipTM. Пептидные и белковые стандарты включены в Service Kit I: одиночные пептиды и пептидная смесь включают брадикинин 1-7, ангиотензин 1-7, ангиотензин II, ангиотензин I, субстанция P, бомбезин, ренин, АКТГ 1-7, АКТГ 18-39, соматостатин 28; одиночные белки и белковая смесь-инсулин, убиквитин I, цитохром С, миоглобин, а также белок А, сывороточный альбумин. Подготовка отдельных стандартных пептидов к проведению МС - анализа состояла в следующем: каждый пептид растворяли в 50 мкл ТФУ и смешивают на вортексе несколько секунд; подготовка раствора матрицы выполняли путем формирования водного раствора, содержащего 30% ацетонитрила и 70% ТФУ, в котором растворяли матрицу HCCA при комнатной температуре, в дальнейшем раствор подвергали ультразвуковому воздействию, избыточную матрицу центрифугировали 5 мин со скоростью 14000 об/мин и применяли только гомогенную фазу; смешивали равные объемы раствора стандарта и матрицы, наносили 1 мкл на стандартную мишень на планшете и высушивали при комнатной температуре. Приготовление образца (0,5 мкл образца пептида на точку размером 600 мкм и 1 мкл раствора чистого образца белка на точку размером 400 мкм) и нанесение его на AnchorChipTM выполнялось методом сухой капли с использованием 2 мкл раствора HСCA (для пептидов) и 0,5 мкл раствора 2,5-DHB (для белков) (Li, J., 2011). Автоматизированный анализ MALDIOFOF-МS с идентификацией специфических белков мочи пациентов проводился с помощью полной интегрированной системы компьютерных программ, включающих flexControl/BioTools 2.1./ MASCOT (Bruker Daltonics, США).
Идентификацию и анализ аминокислотной последовательности пептидов и белков проводили с помощью алгоритма Mascot Search (v2.1, Matrix Science, Лондон, Великобритания).
В настоящем исследовании идентификация спектра пептидов и белков мочи пациентов в on-line режиме сопровождается анализом их первичной и трехмерной структуры, выявлением полиморфизмов химического строения, что является основой для оценки прогрессирования поражения почек при ФСГС и IgА–нефропатии и позволяет разработать перспективные диагностические профили мочи для точной верификации диагноза и стадии поражения почечной ткани.
Результаты исследования представлены в виде молекулярных профилей мочи пациентов, полученных на основе MALDIOFOF-MS пептидных фрагментов и белков, включающих выявленные белки-маркеры с указанием Mr белков (Дa). Условием включения белка-маркера в диагностический профиль являлся показатель «покрытия сиквенса» при анализе масс-спектрограмм, который составил более 15%. Учитывался показатель «ожидаемой интенсивности пептидного фингерпринта» («Expect») для каждого обнаруженного белка в поисковой системе Mascot Search (Великобритания). Чувствительность MALDIOFOF-MS метода обнаружения белков в моче составляет 1 нг/мл. Биоинформационный анализ межмолекулярных взаимодействий выполнен в международных базах данных NCBI, SwissProt, MSDB (Dave, K.A. et al., 2011).
Следовательно, масс-спектрометрия позволила выявить основной пептидный и белковый паттерн мочи пациентов с ФСГС и IgА – нефропатией, что способствовало выполнению сравнительного качественного анализа молекулярных профилей мочи в исследуемых группах. Идентификация пептидов и белков в on-line режиме сопровождалась анализом их первичной и трехмерной структуры, выявлением полиморфизмов химического строения, что является основой для поиска ранних диагностических маркеров ФСГС и IgА - нефропатии и перспективной разработки новых лекарственных средств для терапии этих гистохимических типов гломерулонефрита (Vitorino, R. et al, 2011). Статистическая обработка результатов
С помощью компьютерной программы «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США) выполнялся статистический анализ. Использовались параметрические и непараметрические методы: критерий хи-квадрат, t-критерий Стьюдента, методы Пирсона и Спирмена с оценкой корреляционной зависимости, линейный и нелинейный регрессионный анализ (Реброва, О.Ю., 2003). Все исследуемые величины были представлены в работе в виде выборочного среднего значения и стандартной ошибки средней величины. С помощью параметрического критерия Стьюдента при нормальном законе распределения и непараметрического критерия Манна-Уитни при отличии распределения показателей от нормального оценивалась достоверность различий средних величин независимых выборок. Оценка достоверности различий при статистическом сравнении долей выполняли с использованием критерия Пирсона %2 с учетом поправки Йейтса на непрерывность. Рассчитывали достигнутый уровень значимости (р) во всех процедурах статистического анализа, при этом критический уровень значимости считался равным 0,05 (Дронов, СВ., 2003).
С помощью корреляционно-регрессионного и факторного анализа выполнялась оценка взаимосвязей между различными показателями. С помощью дисперсионного анализа производили сравнение нескольких групп по одному признаку. Если отношение факторной дисперсии к случайной превышало критическое F значение при анализируемом числе степеней свободы и уровне значимости 0,05, нулевую гипотезу об отсутствии взаимосвязи между факторами отбрасывали (Юнкеров, В. И. с соавт., 2002).
Белки молекулярного профиля мочи у пациентов с фокально-сегментарным гломерулосклерозом и IgA-нефропатией и их роль в патогенезе нефрита
Нами выявлено увеличение экспрессии белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста, у пациентов с IgA-нефропатией и особенно с ФСГС. На рис.24 представлена схема межмолекулярных взаимодействий этого белка. Белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста, является членом семейства белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста и циркулирующих в плазме крови. Белок увеличивают период полужизни инсулиноподобных факторов роста и прекращает их взаимодействие с рецепторами клеточной поверхности. Считают, что после секреции белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста, в пространство ткани, окружающей склерозированную почечную ткань, подвергается быстрому расщеплению и инактивации, в связи с чем инсулиноподобные факторы роста и другие ростовые фактора оказываются свободными для связывания со специфическими рецепторами и, таким образом, увеличивают выживаемость клеток почечной ткани (Liu, B. et al., 2003).
Следовательно, белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста, может рассматриваться в качестве защитного фактора в условиях прогрессирования склеротического процесса в почечной ткани при ФСГС и IgA-нефропатией и рекомендуется к включению в молекулярный диагностический профиль мочи при данной патологии.
Примечание: ENSPPYG00000017576 - белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста; IGF1 – инсулиноподобный фактор роста 1 (соматомедин С); IGF2 - инсулиноподобный фактор роста 2 (соматомедин А); FN1 – фибронектин 1; INS – инсулин
Нами отмечено увеличение экспрессии глутатион - S-трансферазы Р 1 у пациентов с ФСГС и IgA-нефропатией. Межмолекулярные взаимодействия глутатион - S-трансферазы Р 1 представлены на рис.25 и представляют собой основные пути реализации биологической активности этого фермента на уровне клетки почек.
Глутатион - трансфераза Р 1 относится к семейству ферментов, играющих важную роль в детоксикации и конъюгации гидрофобных и электрофильных компонентов, выполняет функцию метаболизма ксенобиотиков и детоксикации при иммуновоспалительных процессах в почечной ткани. Увеличение экспрессии глутатион - S-трансферазы Р 1 и экспрессии сопряженных GSTT2, MGST1, GSTO1, MGST2 в моче при ФСГС и IgA-нефропатии может отражать увеличение активности пути глутатионового метаболизма, а именно, конъюгации восстановленного глутатиона с широким спектром экзогенных и эндогенных гидрофобных электрофильных соединений. С повышенной экспрессией глутатион - S-трансферазы Р 1 в моче пациента с ФСГС и IgA-нефропатией может быть связана высокая экспрессия фермента MAPK8, выполняющего функции активатора синтеза провоспалительных цитокинов в почечной ткани и экспрессию ЦОГ-2 (Gui, Y. et al., 2010).
Таким образом, глутатион - трансфераза Р 1 в соответствии с функциональными особенностями является ключевым ранним биомаркером пресклеротической стадии ФСГС и иммуновоспалительного процесса при IgA-нефропатии. Рис. 25. Схема межмолекулярных взаимодействий глутатион – S трансферазы Р 1
Примечание: GSTP1 - глутатион – S-трансферазы Р 1; ENSG00000239562 – глутатион-S-трансфераза T1; MAPK8 – митоген-активируемая протеин киназа 8; CYP1A1 – полипептид 1 подсемейства А семейства А цитохромов P450; GSTZ1 – глутатион-трансфераза зета 1; EPHX1 – микросомальная эпоксид-гидролаза 1; GPX1 – глутатион-пероксидаза 1; CYP2E1 - полипептид 1 подсемейства Е семейства 2 цитохромов P450; CYP1B1 - полипептид 1 подсемейства В семейства 1 цитохромов P450; CYP3A4 - полипептид 4 подсемейства А семейства 3 цитохромов P450; CYP2C19 - полипептид 19 подсемейства С семейства 2 цитохромов P450
В нашем исследовании обнаружено увеличение абсолютного количества пациентов с ФСГС и IgA-нефропатией с увеличением экспрессии альфа-цепи фибриногена в моче. На рис.26 представлена схема межмолекулярных взаимодействий альфа-цепи фибриногена, который является гликопротеином в крови, который состоит из неидентичных полипептидных цепей. Представляется вероятным, что в условиях сосудистого поражения при ФСГС и IgA-нефропатии происходит усиление тромбообразования по причине расщепления фибриногена в фибрин под влиянием тромбина и, как следствие, усиление процессов гипоксии в почечной ткани. Кроме того, продукты расщепления фибриногена и фибрина регулируют клетоную адгезию, обладают вазоконстрикторной и хемотаксической видами активности, являются митогенами для разных типов клеток в почечной ткани. В конечном итоге, локальную экспрессию в почечной ткани альфа-цепи фибриногена с последующей ее экспрессией в моче можно расценивать как возникновение амилоидоза в почках (Bennett, J.S., 2011).
Следовательно, альфа-цепь фибриногена может быть рекомендована к включению в состав молекулярного диагностического профиля мочи с целью выявления активности склеротического процесса и амилоидоза в почечной ткани при ФСГС, иммуновоспалительного процесса при IgA-нефропатии.
Рис. 26. Схема межмолекулярных взаимодействий альфа-цепи фибриногена Примечание: FGA – альфа-цепь фибриногена; FGG – гамма-цепь фибриноген; FGB – бета-цепь фибриногена; F2 - тромбин; APOA1 аполипопротеин A-I; F13A1 – полипептид А1, коагуляционный фактор XIII; ITGB3 – интегрин бета 3; ITGA2B – альфа 2b интегрин; MIS12 - MIS12, MIND компоненты комплекса кинетохоров; LYZ – лизоцим (почечный амолоидоз); F13B – полипептид В, коагуляционный фактор
На рис.27 представлена схема межмолекулярных взаимодействий коллагена, тип III, альфа 1. В настоящем исследовании показано увеличение его экспрессии в моче при IgA-нефропатии. Белок является фибриллярным коллагеном – составным компонентом соединительной ткани в почках и в стенке сосудов (Kuivaniemi, H. et al., 2007).
Представляется вероятным, что в условиях IgA-нефропатии ослабевает эпигенетический контроль экспрессии коллагена, тип III, альфа 1, что приводит к формированию фиброза в почечной ткани. Этот процесс связан с нарушением взаимодействия между поликомб – и гетерохроматинопосредованными системами, отвечающими за репрессию гена коллагена, тип III, альфа 1. Таким образом, коллаген, тип III, альфа 1 требует дополнительных исследований с целью выявления его молекулярной функции при IgA-нефропатии.
Особенности молекулярного профиля мочи при тубуло-интерстициальной фиброзе у пациентов с IgA-нефропатией и фокально-сегментарным гломерулосклероозом
Наиболее важным является взаимодействие толлоидоподобного белка 2 с белком С, связанным с сурфактантом, уровень экспрессии которого в моче увеличивает вместе с интенсивностью экспрессии толлоидоподобного белка 2. Толлоидоподобный белок 2 является участником 2 ключевых клеточных процессов: клеточной дифференцировки и протеолиза. Экспрессия толлоидоподобного белка 2 в моче у здоровых лиц свидетельствует об адекватном контроле антиангиогенных процессов в почечной ткани, реализуемых посредством эндорепеллин, представляющего собой С 115 концевой фрагмент перлекана. В случае активации антиангиогенных молекулярных процессов в нефроэпителии возможно усиление гипоксии при увеличении активности СРО и снижении активности ферментов АОС. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования экспрессии в моче и биологической роли толлоидоподобного белка 2 при различных гистохимических типах ХГН, а также в разные периоды его активности.
Рис. 51. Схема молекулярных взаимодействий толлоидоподобного белка 2 Примечание: TLL2 – толлоидоподобный белок 2, CHRD – хордин, NR2E1 – ядерный рецептор NR2E1, OXCT2 - сукцинил-КoA-3-кетоацид-КоA трансфераза 2, LAMC2 – ламинин, 2цепь, SFTPC – белок С, связанный с сурфактантом
В исследовании показано отсутствие экспрессии белка глицин – амидинотрансферазы в моче у пациентов с ФСГС и IgA-нефропатией с наличием его экспрессии в моче здоровых лиц. Глицин – амидинотрансфераза - это митохондриальный фермент, принадлежащий к амидинотрансферазному семейству, регулирует синтез креатина, который катализирует переход гуанидиновых групп от L-аргинина к глицину, образуя гуанидиноуксусную кислоту, являющуюся предшественником креатина. Снижение экспрессии белка в условиях почечной патологии свидетельствуют об уменьшении резервных возможностей почечной ткани на уровне нефроцита в системе реализации оксидативного стресса, ответа почечной ткани на гормональные стимулы и тканевой регенерации.
Межмолекулярные взаимодействия глицин – амидинотрансферазы представлены на рис.52 и представляют собой основные пути реализации метаболических эффектов этого фермента на уровне клетки.
Примечания: GATM – глицин-амидинотрансфераза; GAMT гуанидиноацетат N-метилтрансфераза; AGXT - аланин-глиоксилат аминотрансфераза; ALDH7A1 – альдгид-дегидрогеназа семейство 7 , член A1; GLDC – глицин-дегидрогеназа; ALDH1B1 – альдегид-дегидрогеназа семейство 1, член B1; GNMT - глицин N-метилтрансфераза; SARDH – саркозин-дегидрогеназа; ALDH9A1 – альдегид-дегидрогеназа 9 семейство, член A1; ALDH3A2 - альдегид-дегидрогеназа 3 семейство, член A2; ALAS2 – аминолевулинат, дельта-синтаза 2
Таким образом, анализ биологической роли белков, экспрессия которых обнаружена в моче пациентов с ФСГС и IgА – нефропатией позволил сформировать функциональные группы молекул белков, которые являются релевантными для включения в диагностический молекулярный паттерн с целью раннего выявления ТИФ.
Одной из причин развития ХПН при хроническом гломерулонефрите является ТИФ, однако на сегодняшний день его верификация остается инвазивной процедурой (Prakoura, N. et al., 2013). Для уточнения развития ТИФ при гломерулопатиях в настоящее время используется нефробиопсия как единственное достоверное исследование. Применение современных не инвазивных методик позволит своевременно принимать меры профилактики и при необходимости корректировать методы лечения.
В настоящее время масс-спектрометрия считается наиболее востребованным и чувствительным методом анализа органических молекул, который позволяет выявлять группы белков, определяющих наличие воспаления или фиброза тубулоинтерстиция (Наточин, Ю.В., 2012; Douthwaite, J.A. et al., 2011). Исследование в моче концентрации маркеров канальциевого повреждения позволяет более точно оценить степень повреждения тубулоинтерстиция и необходимость назначения этим пациентам нефропротективной терапии.
Цель нашего исследования заключалась в поиске новых маркеров тубуло-интерстициального фиброза в моче при IgA-нефропатии и ФСГС с помощью масс-спектрометрии белков и определение их патогенетической роли.
Для реализации поставленной цели в исследование был включен 61 пациент и 30 здоровых добровольцев в составе 3 групп. Всем обследуемым была выполнена масс-спектрометрия мочи. Проведенное исследование было одномоментное, скрининговое, когортное, открытое. Нами обнаружены различия в протеомном профиле мочи пациентов с ФСГС и IgA-нефропатией, связанные с отсутствием экспрессии молекул тимозина – бета 4, белка хемоаттракции моноцитов, сосудистого белка клеточной адгезии в моче пациентов с IgA-нефропатией, но обнаруженных в моче пациентов с ФСГС, а также отсутствие экспрессии гепарансульфата и альфа-цепи коллагена в моче пациентов с ФСГС, но обнаруженных в моче пациентов с IgA-нефропатией.
Необходимо отметить, что молекулы пептидов и белков, экспрессия которых была обнаружена в моче у пациентов с ФСГС и IgA-нефропатией, не регистрировались в протеомном профиле мочи здоровых лиц, в котором выявлена экспрессия толлоидоподобного белка 2 и глицин – амидинотрансферазы, отсутствовавшая в молекулярном профиле мочи у пациентов с хроническим гломерулонефритом.
Проводя изучение нефробиоптата пациентов обеих исследуемых групп, нами была составлена таблица белков, выявленных у пациентов с развитием ТИФ (таблица 11).
