Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I 12
1.1 Медико- социальное значение проблемы ВЗК 12
1.2 Представление об этиологии и патогенезе язвенного колита 14
1.3 Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы при различных патологических состояниях 19
1.3.1 Структура матриксных металлопротеиназ 20
1.3.1.1 Коллагеназы 21
1.3.1.2 Желатиназы 22
1.3.1.3 Стромелизины 22
1.3.1.4 Матриксные металлопротеиназы мембранного типа (ММП-МТ) 23
1.3.2 Специфические и неспецифические ингибиторы ММП 24
1.3.3 Роль матриксных металлопротеиназ при патологии внутренних органов 27
1.3.4 Участие матриксных металлопротеиназ в канцерогенезе 29
1.3.5 Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы в патогенезе ВЗК 31
1.4 Вопросы диагностики и лечения язвенного колита 36
Глава 2 41
Материалы и методы исследования 41
2.1 Материалы исследования 41
2.2 Методы исследования 43
2.2.1 Оценка клинических проявлений ЯК 43
2.2.2 Лабораторное исследование 44
2.2.3 Эндоскопическое исследование толстого кишечника 44
2.2.4. Морфологическое исследование 45
2.2.5 Иммуногистохимическое исследование колонобиоптатов 46
2.2.6 Статистическая обработка данных 47
Глава 3 Комплексная оценка больных язвенным колитом 49
3.1. Клиническая характеристика больных язвенным колитом 49
3.1.1. Оценка клинических проявлений ЯК с использованием индекса Мэйо и Рахмилевича 52
3.2. Оценка эндоскопического исследования кишечника с использованием эндоскопического индекса активности язвенного колита по Мэйо-Schroeder и по Рахмилевичу 53
3.3. Активность матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 у больных язвенным колитом 55
3.4. Определение взаимосвязей между ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки и клиническими, эндоскопическими и лабораторными показателями у больных ЯК. 72
3.5. Прогностическая значимость определения ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у больных ЯК 82
3.5. Оценка экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 к сигмовидной и прямой кишке у больных СРК-Д 86
ГЛАВА 4 91
Обсуждение результатов исследования 91
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
- Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы при различных патологических состояниях
- Оценка клинических проявлений ЯК
- Оценка эндоскопического исследования кишечника с использованием эндоскопического индекса активности язвенного колита по Мэйо-Schroeder и по Рахмилевичу
- Прогностическая значимость определения ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у больных ЯК
Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы при различных патологических состояниях
Язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) считаются заболеваниями современного общества и с середины XX века их частота в развивающихся странах неуклонно растет. Самая высокая заболеваемость и распространённость (ВЗК) отмечается в Северной Европе и Северной Америке, а наиболее низкая – в странах Азии, где ЯК является наиболее распространённой формой ВЗК [30]. Так, в Германии более чем 300 000 людей страдает ВЗК [41]. В Голландии частота ВЗК в городах составляет 5,1 случаев, в пригородах и сельских районах 3 и 3,6 случаев на 100 тыс. населения, соответственно [249].
Распространенность ЯК, по данным разных авторов, составляет от 20 до 240 случаев на 100 000 человек, достигая максимальных показателей в Скандинавии, Северной Америке, Израиле, Канаде [7]. Ежегодный прирост заболеваемости ЯК составляет 5-20 случаев, для болезни Крона (БК) 5-15 случаев на 100 тыс. населения [10].
Несмотря на то, что на сегодняшний день отсутствует реестр больных ВЗК на территории Российской Федерации, за последние десятилетия появились данные, которые, хотя бы частично отражают эпидемиологию данных заболеваний. Так по данным Никулиной И.В. с соавт. (1997), полученным в ходе эпидемиологического исследования в г. Москве и Московской области заболеваемость ЯК составила 1,7, распространенность 22,3 случая на 100 000 населения [16].
С 2002 года в Ростовской области изучается распространенность ВЗК с использованием специально разработанных анкет. Как показали исследования А. В. Ткачева с соавт. (2009), к 2008 году было выявлено 182 новых пациента с ЯК [23]. В Новосибирске с 2003 года по данным Е.Ю Валуйских и соавторов было выявлено 680 больных ВЗК: 375- с ЯК, 277 – с БК и 27 «неклассифицируемым» колитом [9].
ЯК может наблюдаться в любом возрасте, однако наиболее часто регистрируется у подростков и молодых людей в возрасте 30-40. В ряде исследований были получены результаты, которые свидетельствуют о том, что второй пик заболеваемости регистрируется в возрасте 60-70 лет, однако в дальнейшем эти данные не нашли подтверждения [69].
Смертность при ЯК не выше, чем в общей популяции, однако среди пациентов с впервые диагностированным заболеванием и у пациентов с распространёнными формами уровень смертности несколько выше [210, 281].
На сегодняшний день рост заболеваемости ЯК связывают с так называемой «гигиенической теорией», меньший контакт с патогенной флорой и паразитарными инвазиями, обуславливает отрицательное влияние на иммунную систему и является предрасполагающим фактором развития язвенного колита [84, 102].
Наиболее важными факторами, влияющими на эпидемиологию данного заболевания, является этническая принадлежность, генетическая предрасположенность, географические факторы, образ жизни [41]. Так у лиц еврейской национальности регистрируется более высокая частота ВЗК, чем среди представителей других этнических групп: ЯК регистрируется чаще в 3,5 раза, БК - в 3-6 раз [18]. Также следует отметить, что аппендэктомия в анамнезе и курение обладают защитными свойствами в отношении развития данного заболевания [20]. Доказательством защитного действия курения является тот факт, что у лиц, никогда не куривших и куривших ранее, ЯК отмечается чаще, чем у курильщиков [166]. По данным мета-анализа, выполненного Godet P.G. et al. (1995), у женщин принимающих оральные контрацептивы, вероятность развития ВЗК на 29% выше, чем в контрольной группе [106]. Однако работы последних лет не подтверждают эти данные [18]. Наличие генетической предрасположенности к ЯК подтверждается данными эпидемиологических исследований. Относительный риск развития ЯК у потомства, где хотя бы один из родителей страдает данным заболеванием в 10-15 раз выше, чем в общей популяции [20, 239, 245, 246]. Как следствие, постоянный рост заболеваемости и распостраненности ЯК обуславливает необходимость проведения дальнейших исследований в изучении данной патологии.
Представление об этиологии и патогенезе язвенного колита Несмотря на прогресс в изучении механизмов развития ЯК этиология заболевания остается неизвестной. Длительное время существовала теория о наличии специфического неидентифицированного инфекционного возбудителя, которая так не нашла подтверждения.В качестве возможной причины ЯК исследовались такие возбудители, как Shigella ,Shigella-подобный токсин, Salmonella, Yersinia. В ряде работ обострение заболевания связывали с выявлением Clostridium difficile [242], та же роль отводилась инфекции, вызванной Salmonella, что, вероятно, обусловлено снижением защитной способности слизистой оболочки [64].
В настоящее время предполагается, что условно-патогенная флора желудочно- кишечного тракта (ЖКТ) может играть значительную роль в патогенезе ЯК [108, 252]. Так, в своих исследованиях R. Duchmann et. al. (1995) выявили, что в контроле мононуклеарные клетки СО не реагировали на собственные бактерии в отличие от моделей ВЗК, у которых наблюдалась выраженная инфильтрация мононуклеарами [81].
Оценка клинических проявлений ЯК
Полученные результаты подтверждают данные о том, что на территории РФ преобладают тяжелые формы ЯК [16]. Также использовался индекс клинической активности ЯК по Рахмилевичу. В соответствии с ним больные ЯК были распределены следующим образом: ремиссия отмечалась у 16 пациентов (30%), минимальная степень активности - у 20 пациентов (37%), умеренная степень активности - у 18 пациентов (33%). Проведенный анализ указывает на то, что отсутствие унифицированного подхода к оценке клинических, а также эндоскопических проявлений заболевания ведет к различиям в оценке тяжести течения ЯК. 3.2. Оценка эндоскопического исследования кишечника с использованием эндоскопического индекса активности язвенного колита по Мэйо- Schroeder и по Рахмилевичу
Эндоскопическое исследование является одним из важнейших компонентов, как в первичной диагностике ЯК, так и при оценке состояния СО толстой кишки при ранее установленном ЯК, что обусловлено возможным несоответствием клинических проявлений изменениям непосредственно в толстом кишечнике, выявленными при проведении колоноскопии или гистологической активности. Был проведен анализ эндоскопических проявлений (по Мэйо-Schroeder). Результаты представлены в таблице 3.7 .Был проведен анализ эндоскопических показателей (по Рахмилевичу).
Выявлены статистически значимые значения по трём компонентам эндоскопического индекса в группе больных ЯК в стадии обострения по сравнению с больными в стадии ремиссии: вид сосудов (p = 0.003), ранимость слизистой p = (0.004), повреждения слизистой (p 0.001), Однако, изменения такого показателя, как зернистость, отражающая свет, статистически не достоверны (p=0,262) (таблица 3.8). гистологической активности ЯК в СО толстого кишечника. Было установлено, что у больных ЯК в стадии обострения показатели гистологического индекса имели статистически значимо более высокие значения по сравнению с больными в стадии ремиссии: активное воспаление (p 0.001), хроническое воспаление (p 0.001), деформация крипт (p = 0.001) (таблица 3.9).
Активность матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 у больных язвенным колитом Основные патологические изменения при ЯК локализуются в СО толстой кишки вследствие чего исследования, проводимые в колонобиоптатах являются крайне информативными и значимыми. По данным литературы важную роль в патогенезе ЯК играет ММП и ТИМП. Дисбаланс между провоспалительными, противоспалительными ММП и ТИМП ведет к нарушению защитной и барьерной функции кишечника, что ведет впоследствии к развитию воспаления и образованию язв [228].
В целом, уровень экспрессии ММП довольно низкий, за исключением ММП-9. Это обусловлено тем фактом, что ММП-9 содержится в гранулах нейтрофилов и может быстро высвобождаться в очаге воспаления.
Для определения экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке крови и тканях человека используются различные методы, такие как ПЦР, ИФА, иммунногистохимические методы. В нашей работе проводилось исследование экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки иммуногистохимическим методом.
При проведении нашего исследования наиболее интенсивная экспрессия ММП-9 в колонобиоптатах была выявлена у пациентов ЯК в стадии обострения в ПМЯЛ, которые, вероятно и являются основным источником ММП-9 в кишечнике, время от времени наблюдалось окрашивание ММП-9 в макрофагах (Рис.1, 2;Таблица 3.10,3.11). Иногда при определении экспрессии ММП-9 в строме отмечалось диффузное окрашивание межклеточного матрикса, что возможно объясняется разрушением секретируемой ММП-9 и увеличением ее количества по мере нарастания тканевого воспаления при ЯК. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ММП-9 участвует в развитии воспаления при ЯК, в частности в формировании эрозий, язв, особенно в стадии обострения. Вероятно, увеличение активности ММП-9 в СО сигмовидной и прямой кишки ведет к деструкции ткани посредством разрушения компонентов межклеточного веществ и участвует в различных фазах воспаления в кишечнике, от повреждения до заживления и не является специфичным для ВЗК, так увеличение экспрессии данного показателя отмечается и при патологических процессах в других органах, а также онкологических заболеваниях [12, 21, 228].
Надо отметить, что в СО сигмовидной и прямой кишки наиболее интенсивная экспрессия ТИМП- 1 также наблюдалась у пациентов 1а группы в ПМЯЛ, иногда выявлялась в макрофагах и межклеточном веществе, что, вероятно объясняется теми же причинами, что и появление экспрессии ММП- 9 в этом же клеточном элементе (рис.3,4; табл 3.12, 3.13), однако, менее выряженное, чем экспрессия ММП-9 в этих же отделах кишечника.
В группе здоровых добровольцев экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 отсутствовала, что связано, вероятно, с отсутствием нейтрофилов в СО толстой кишки, содержание же этих ферментов в одиночных макрофагов так мало, что не поддается верификации (рис.5,6).
Оценка эндоскопического исследования кишечника с использованием эндоскопического индекса активности язвенного колита по Мэйо-Schroeder и по Рахмилевичу
В группе здоровых добровольцев было выявлено отсутствие экспрессии или слабая экспрессия протеазы и ее ингибитора в СО толстой кишки (график 4.1, 4.2, 4.3, 4.4), что вероятно объясняется отсутствием нейтрофилов, а в одиночных макрофагах количество фермента так мало, что практически не верифицировалось.
При проведении исследования нами была отмечено, что у больных с рецидивом ЯК ММП-9 на порядок превышает экспрессию ингибитора и в СО сигмовидной и прямой кишки. Судя по локализации наиболее выраженной экспрессии – ПМЯЛ, макрофаги и межклеточное вещество зоны эрозий и язв, преобладание экспрессии ММП-9 над ТИМП-1 частично объясняет механизм образования эрозий и язв, а, следовательно, тяжесть течения и прогноз развития рецидива ЯК. Так же отмечалась выраженная экспрессия ММП-9 в грануляционной ткани в дне язв СО толстой кишки, что подтверждает ее участие в репаративных процессах, и, вероятно, частично объясняет механизм возникновения дефектов СО толстой кишки у этой категории пациентов.
В группе пациентов ЯК в стадии ремиссии отмечался баланс между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в колонобиоптатах.
В работах ряда авторов было выявлено, что соотношение между ММП-1 : ТИМП-1 и ММП-3 : ТИМП-1 увеличивается в участках воспаления СО толстой кишки у пациентов с ВЗК по сравнению с интактными участками [116, 152, 183].
Важным аспектом нашей работы явилось определение соотношения ММП-9 : ТИМП-1 в колонобиоптатах у больных ЯК в различные стадии заболевания, которое было выполнено впервые у данного контингента больных. Установлено, что соотношение показателей ММП-9 : ТИМП-1 в СО и сигмовидной, и прямой кишки у больных с рецидивом ЯК составляет 1,5 : 1, что свидетельствует о дисбалансе экспрессии протеазы и ее ингибитора. У пациентов с ремиссией ЯК соотношение ММП-9 : ТИМП-1 1 : 1 и, вероятно, свидетельствует о том, что одним из факторов, влияющих на выраженность воспалительного процесса, тяжесть заболевания, а также продолжительность ремиссии и возникновение обострения заболевания является баланс между ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки. Однако, надо отметить, что у здоровых добровольцев экспрессия ММП-9 в СО исследуемых отделов толстой кишки либо отсутствует, либо так мала, что не поддается верификации и, следовательно, наличие экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки, а также баланс этих показателей у больных с ЯК в стадии ремиссии свидетельствует о разрешении активного воспаления в СО толстой кишки при наличии сохраняющихся признаках хронического воспаления, что служит основанием для назначения поддерживающей терапии на длительный период времени.
Были изучены корреляционные связи между клиническим, эндоскопическими, лабораторными исследованиями и показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО прямой и сигмовидной кишки.
Было выявлено, что уровень экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО из вышеуказанных отделов кишечника и в межклеточном веществе в зоне язв, в цитоплазме большинства макрофагов, ПМЯЛ, и в цитоплазме одиночных энтероцитов, а также их суммарный показатель, имели высоко-значимую (p 0.01) корреляцию между собой.
Наиболее выраженная связь выявлена между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной, прямой кишки и индексом Мэйо. Коэффициенты корреляции, указывающие на связь вышеуказанных показателей и клинического индекса Рахмилевича, были несколько ниже, что свидетельствует о том, что именно применение индекса Мэйо вероятно наиболее достоверно отражает активность заболевания.
Корреляция между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в колонобиоптатах и индексом эндоскопической активности по Рахмилевичу является выраженной и сопоставима с показателями корреляции с индексом Мэйо. Так, наиболее высокие коэффициенты корреляции были установлены для показателей повреждения СО толстой кишки, затем - изменениям сосудистого рисунка и ранимости СО.
Более выраженная взаимосвязь была установлена между показателями экспрессии ММП-9 в колонобиоптатах и показателями индекса гистологической активности, взаимосвязь между показателями ТИМП-1 в исследуемых отделах кишечника носила менее выраженный характер. Более высокие коэффициенты корреляции были выявлены между исследуемыми протеазами и следующими показателями индекса гистологической активности: активным и хроническим воспалением для показателя экспрессии ММП-9, ТИМП-1 в СО толстой кишки. Анализ корреляции показал умеренную обратную связь с уровнем гемоглобина между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной кишки. Значимых корреляции экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в соответствующих отделах кишечника с уровнем лейкоцитов и СОЭ установлено не было. Была выявлена высоко-значимая прямая связь между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в сигмовидной и прямой кишке и СРБ.
С целью прогнозирования рецидива ЯК была построены модели логистической регрессии, на основе которых были проведены ROC-анализы изученных показателей, что позволило определить диагностические пороги для выявления рецидива и ремиссии заболевания, а также оценить чувствительность и специфичность используемых показателей.
Установлено, что повышение экспрессии ММП-9 в прямой кишке на 1 балл (иммуногистохимический метод) ведет к увеличению в 1,7 раза риска развития рецидива ЯК с очень высокой статистической вероятностью (p 0,0001). Риск развития рецидива ЯК возрастает при определении ММП-9 в СО прямой кишки 3 баллов (чувствительность 92% и специфичность 99%).
Не менее информативным для определения риска развития рецидива ЯК является показатель экспрессии ТИМП-1 и в СО прямой, и в СО сигмовидной кишки. При использовании показателя экспрессии ТИМП-1 в СО прямой и сигмовидной кишке AUC=0,96, а чувствительность составляет 92%, специфичность - 91%.
Существуют некоторые сложности при определении единого порогового уровня для дифференциации рецидива и ремиссии ЯК, так как уровни показателей экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 и в СО прямой и в сигмовидной кишки у больных ЯК с ремиссией ниже показателей экспрессии исследуемых протеаз у больных с рецидивом ЯК, и при этом превышают экспрессию данных показателей у здоровых добровольцев. Использование в уравнении логистической регрессии квадрата показателя ММП-9 (общая) в СО прямой кишке позволило повысить точность диагностики: AUC = 0,94, чувствительность 99% и специфичность 89%.
В группе пациентов с СРК была выявлена слабая экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки, и соответственно, показатели экспрессии исследуемой протеазы и ее ингибитора были выше у больных с рецидивом ЯК. Вместе с тем, экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у пациентов с ЯК в стадии ремиссии и у больных с СРК, диарейный вариант, имеют сходные показатели (рисунок 4.6).
Прогностическая значимость определения ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у больных ЯК
Полученные данные свидетельствует о наличии морфологического субстрата при СРК, что сопровождается экспрессией ТИМП-1 в СО толстой кишки, в количестве, которое, вероятно, способно ограничивать протеолитическую активность ММП-9 и, соответственно, вести к развитию поверхностного воспаления СО толстой кишки в отличии от более выраженной экспрессии ММП-9 и отставания в экспрессии ТИМП-1 в СО толстой кишки при ЯК в стадии обострения, результатом чего являются тяжелые воспалительные изменения в толстой кишке
Установлено, что для больных СРК-Д соотношение ММП-9 : ТИМП-1 в СО толстой кишки составляет 1 : 1, и совпадает с показателем соотношения указанных показателей у больных ЯК в стадии ремиссии, однако отличается от соотношения ММП-9 : ТИМП-1 у больных ЯК в стадии обострения- 1,5 : 1 (p 0,05). Несмотря на то, что СРК относится к группе функциональных заболеваний, существует мнение о наличии морфологического субстрата, и вероятно, это и является объяснением экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у этой категории пациентов.
1. Установлено повышение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке сигмовидной и прямой кишки у больных с рецидивом язвенного колита, которое зависит от степени активности заболевания.
2. Показана необходимость определения соотношения матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 для оценки тяжести заболевания и возможного развития рецидива язвенного колита. У пациентов с рецидивом соотношение матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 составило 1,5 : 1, а у пациентов в стадии ремиссии – 1 : 1.
3. У больных язвенным колитом выявлена корреляционная зависимость между показателями экспрессии матриксной металлопротеиназы 9, тканевым ингибитором матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке сигмовидной и прямой кишки и показателями индекса Мэйо. По мере нарастания тяжести заболевания и выраженности воспалительных изменений в толстой кишке наблюдается повышение исследуемых показателей.
4. Установлены отличия экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения у пациентов с язвенным колитом и с синдромом раздраженной кишки. У больных язвенным колитом в стадии обострения показатели имели более высокие значения по сравнению с больными синдромом раздраженного кишечника, у пациентов язвенным колитом в стадии ремиссии и синдромом раздраженного кишечника - не отличались, и были выше, чем у здоровых добровольцев.
5. Установлено, что экспрессия матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки 3 баллам (при оценке иммуногистохимическим методом) соответствует рецидиву язвенного колита (диагностическая чувствительность 92% и специфичность 99%). Показатель экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки 2 балла (при оценке иммуногистохимическим методом) соответствуют ремиссии язвенного колита (диагностическая чувствительность 99% и специфичность 89%). Повышение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки на 1 балл (при оценке иммуногистохимическим методом) ведет к увеличению в 1,7 раз риска развития рецидива язвенного колита.
Практические рекомендации
1. Для диагностики язвенного колита и оценки полноценности ремиссии рекомендуется определение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения в слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки.
2. Предложено использовать математические модели прогноза риска развития рецидива язвенного колита на основе показателей экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки.
