Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Воспалительные заболевания кишечника актуальная медико-социальная проблема (обзор литературы)
1.1. Этиопатогенез воспалительных заболеваний кишечника: базисные позиции
1.2. Антимикробные пептиды и воспалительные заболевания кишечника
1.3. Диагностические подходы при воспалительных заболеваниях кишечника 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Дизайн исследования 37
2.2. Методы исследования больных 40
2.2.1. Клинические методы исследования 40
2.2.2. Эндоскопические методы исследования 40
2.2.3. Морфологическое исследование колонобиоптатов 41
2.2.4. Микробиологическое исследование содержимоготолстой кишки
2.2.5. Специальные лабораторные методы исследования 41
2.2.5.1. Методика оценки эффективности фагоцитоза 41
2.2.5.2. Методы оценки маркеров синдрома системной з воспалительной реакции (СРБ, фибриноген, СОЭ)
2.2.5.3.Методика определения фекального кальпротектина 43
2.2.5.4. Определение уровня дефензина-а в крови 44
2.2.5.5. Определение концентрации дефензина- в кале 44
2.3. Общая характеристика больных клинических групп 45
2.4. Статистическая обработка результатов 47
Глава 3. Клиническая характеристика, воспалительные маркеры, антимикробные пептиды и состояние фагоцитарной активности крови больных язвенным колитом при рецидиве заболевания
3.1. Клиническая характеристика больных с рецидивом язвенного колита
3.2. Характеристика синдрома общей воспалительной реакции у больных с рецидивом язвенного колита
3.3. Характеристика фагоцитарной активности нейтрофилов у больных с рецидивом язвенного колита
3.4. Содержание фекального кальпротектина у больных с рецидивом язвенного колита
3.5. Продукция антимикробных пептидов в сыворотке крови и копрофильтрате у больных с рецидивом язвенного колита 73
3.6. Состояние толстокишечной микробиоты у больных с 89
рецидивом язвенного колита
Глава 4. Динамика клинико-эндоскопических и лабораторных маркеров активности у больных с рецидивом язвенного колита на фоне 12-недельной курсовой терапии 99
4.1. Клинико-эндоскопический профиль у больных с 99
язвенным колитом на фоне курсовой терапии
4.2. Результаты общих, специальных лабораторных, бактериологических исследований у больных язвенным колитом на фоне курсовой терапии
4.2.1. Динамика лабораторных показателей системной воспалительной реакции у больных язвенным колитом на фоне курсовой терапии
4.2.2. Динамика показателей активности фагоцитоза на фоне курсовой терапии больных с язвенным колитом
4.2.3. Динамика изменения содержания фекального кальпротектина на фоне курсовой терапии 115
4.2.4. Динамика изменений толстокишечной микробиоты на фоне курсовой терапии
4.3. Динамика изменений а- и -дефензинов в биологических средах на фоне курсовой терапии язвенного колита 124
4.3.1. Динамика изменений а- и -дефензинов в сыворотке крови и кале на фоне курсовой терапии язвенного колита
4.3.2. Анализ взаимосвязей между содержанием антимикробных пептидов в биологических средах и клиническими, эндоскопическими, лабораторными показателями активности язвенного колита
4.4. Прогностическая значимость мониторинга эндогенных антимикробных пептидов и кальпротектина при наблюдении за больными язвенным колитом
Глава 5. Обсуждение результатов исследования 140
Выводы 149
Практические рекомендации 150
Указатель литературы
- Антимикробные пептиды и воспалительные заболевания кишечника
- Микробиологическое исследование содержимоготолстой кишки
- Характеристика фагоцитарной активности нейтрофилов у больных с рецидивом язвенного колита
- Динамика лабораторных показателей системной воспалительной реакции у больных язвенным колитом на фоне курсовой терапии
Введение к работе
Актуальность темы
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) носят упорный рецидивирующий хронический характер с чередованием эпизодов обострений и периодов ремиссии, что объясняет постоянный интерес исследователей к изучению патогенетических механизмов трансформации клинического благополучия в обострение симптоматики заболевания (Халиф И.Л. с соавт., 2009; Белоусова Е.А. и соавт., 2010; Баранов А.А. с соавт., 2011; Павленко В.В., 2013). Местные и системные воспалительные реакции стенки кишки провоцируются рядом факторов, в том числе продуктами бактериальной жизнедеятельности (Ливзан М.А., 2012). Контакт с патогенными бактериями активирует «врожденную кишечную защиту» путем экспрессии провоспалительных генов и секреции цитокинов и хе-мокинов (Агафонов В.Е. с совт.,2011; Окороченков С.А. с соавт., 2012). Сохранность слизистой оболочки (СО), наличие обострения или ремиссии ВЗК зависят от установления баланса между патогенными факторами и компонентами системы защиты (Steinstraesser L., 2010). Эндогенные антимикробные пептиды (АМП) относятся к неспецифическим факторам гуморальной врожденной иммунной системы и обеспечивают защиту против широкого спектра бактерий, грибов и оболочечных вирусов (Алешина Г.М., 2010). Секреция АМП клетками кишечной стенки направлена на активацию врожденных иммунных механизмов (Кулакова Е.В. с соавт., 2012), однако сопряжение их уровней с течением ВЗК, динамичное изменение при лечении остается неясным, что обеспечивает актуальность работ в этом направлении.
Одним из факторов, определяющих состояние барьера СО, является группа протеинов, объединяемых термином «дефензины» (Никитина И.Г. с соавт., 2012). Дефензины представляют собой вы-сокопотентные естественные антибиотики организма и относятся к группе АМП. В тонкой кишке продуцируются а-дефензины HD5 и HD6, в толстой - многие -дефензины (Kim J.Y. et al., 2009). Предполагается, что дефензины образуют «первую линию защиты» СО, которая предохраняет организм от широкого спектра микроорганизмов (Chu Н. et al., 2012). Дефензины действуют антибактериально, связываясь с наружной оболочкой бактерий и образуя в ней микропоры, что в итоге нарушает ее целостность и ведет к гибели
микроорганизма. Дефензины обезвреживают грамнегативные и грампозитивные бактерии, кислотоустойчивые палочки, грибковые микроорганизмы, вирусы и протозоиды (Будихина А.С. с соавт., 2008). Кроме этого дефензины могут оказывать влияние на процессы воспаления, пролиферации, ранозаживления, продукцию цито-кинов, хемотаксис иммунокомпетентных клеток в организме человека (Мамчур В.И. с соавт., 2012; Bals R., 2000). Другим функциональным классом иммунозащитных пептидов для кишечного эпителия выступают металлсвязывающие вещества. К ним можно отнести кальпротектин, связывающий цинк, кальций и действующий бактериостатически (Rheenen P.V. et al., 2010). Биологическая функция кальпротектина заключается в регуляции процессов воспаления (привлечение моноцитов), антимикробной активности (локальное ингибирование цинк-зависимых металлопротеиназ), анти-пролиферативной активности (индукция апоптоза) (Roon А. С. V., 2007). Фекальный кальпротектин (ФК) у пациентов с ВЗК отражает миграцию лейкоцитов через стенку кишечника (Rheenen P.V. et al., 2010). Однако в настоящий момент раскрыты не все прогностические потенции кальпротектина для характеристики течения ВЗК.
У больных ВЗК в результате исследования уровней АМП в биологических средах получены малочисленные и весьма противоречивые результаты (Kanmura S. et al., 2009). Повышение содержания а-дефензинов в сыворотке крови, -дефензинов в кале у больных с язвенным колитом (ЯК) отмечают Mahida Y.R. et al. (2004), Yamaguchi N. et al. (2009), Кулакова Е.В. с соавт. (2012). Напротив, в работе Bhat S. и Milner S. (2007) авторы обращают внимание на пониженный уровень -дефензина в кале, отмечая, что это обстоятельство может способствовать дальнейшему инфицированию и септическому течению воспалительного процесса. Неоднозначность выводов, возможно, связана с тем, что в исследованиях не изучена зависимость между продукцией дефензинов и характеристиками ЯК (тяжесть течения, локализация воспаления в толстой кишке, длительность ремиссии). Дальнейшее изучение роли АМП в этом направлении сможет уточнить компоненты патогенеза ЯК, расширить диапазон диагностических и терапевтических перспектив исследования АМП при ВЗК.
Цель исследования: изучить особенности продукции антимикробных пептидов и их связь с изменениями толстокишечной
микробиоты у больных с язвенным колитом, определив их клинико-диагностическое значение.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ шкальной оценки активности и тяжести ЯК, определив эффективность ее применения в клинической практике.
-
Определить содержание антимикробных пептидов (а- и -дефензинов, кальпротектина) в разных биологических объектах (сыворотка крови, копрофильтрат) у больных с ЯК в зависимости от фазы заболевания и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке.
-
Исследовать динамику продукции антимикробных пептидов (а-и -дефензинов, кальпротектина) в разных биологических объектах (сыворотка крови, копрофильтрат) и состояние микробиоты толстой кишки у больных с ЯК в зависимости от клинико-эндоскопических характеристик и длительности базисной терапии заболевания.
-
Определить зависимость между уровнем продукции а- и -дефензинов, фекального кальпротектина и клинико-эндоскопическими критериями активности и тяжести рецидива ЯК, обосновав возможность их использования в качестве неин-вазивных диагностических маркеров.
-
Оценить диагностическое и прогностическое значение фагоцитарного потенциала клеток крови для оценки степени активности ЯК.
-
Модифицировать алгоритм диагностики и лечения ЯК с использованием неинвазивных маркеров прогноза риска развития рецидива заболевания.
Научная новизна
Впервые выявлено патогенетическое значение дефензинов и толстокишечной микробиоты у больных ЯК в зависимости от распространенности патологического процесса.
Впервые установлены новые интегральные маркеры оценки эффективности терапии рецидива ЯК, основанные на определении а-дефензина в сыворотке крови, -дефензина и кальпротектина в копрофильтрате.
Впервые установлено влияние стандартной терапии рецидива ЯК на уровень секреции а- и -дефензинов нейтрофилами.
Впервые, с использованием пограничных уровней а-дефензина в сыворотке крови, -дефензина и фекального кальпротектина в ко-профильтрате был разработан и математически обоснован способ прогнозирования риска развития рецидива ВЗК (патент №2517069, публикация в 15 бюллетене от 27.03.14г.).
Расширен стандартный алгоритм диагностики и лечения ЯК за счет включения комплекса неинвазивных маркеров, дополняющих оценку достижения клинико-эндоскопической ремиссии и прогноз риска раннего рецидива заболевания.
Практическая значимость
Разработаны дополнительные интегральные критерии оценки активности рецидива и достижения полноценной клинико-эндоскопической ремиссии ЯК, которые могут быть использованы в клинической практике для оптимизации курсовой медикаментозной терапии заболевания.
Разработан алгоритм прогнозирования рецидива ЯК, основанный на определении содержания а- дефензина в сыворотке крови, -дефензина в кале и фекального кальпротектина, активности и интенсивности фагоцитарного звена иммунной системы, коррелирующих с эндоскопической активностью заболевания и площадью вовлечения кишки в воспалительный процесс, позволяющий сформировать группы больных с ЯК с высоким риском раннего рецидива и персонифицировать программы поддерживающей терапии заболевания.
Основные положения работы, выносимые на защиту
У больных с рецидивом ЯК увеличена продукция антимикробных пептидов (а-, -дефензина, кальпротектина), изменена микробиота толстой кишки (увеличена пропорция условно-патогенной микрофлоры, при значительном снижении нормобио-тических компонентов), зависящие от активности и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке, приводящие к снижению мукозальной защиты СО толстой кишки
У больных с ЯК в период рецидива заболевания при высокой активности воспаления и распространенном и / или тотальном поражении толстой кишки развивается снижение интенсивности фагоцитоза и ограничение функциональных резервов нейтрофилов крови
Определение концентрации а-дефензина в сыворотке крови, -дефензина и кальпротектина в копрофильтрате позволяет полу-
чить дополнительные неинвазивные интегральные критерии оценки активности заболевания и стадировать течение заболевания, оценить достижение полноценной ремиссии и прогнозировать риск раннего рецидива ЯК.
Личный вклад автора. Личное участие автора в получении науч
ных результатов, излагаемых в диссертации, осуществлялось на
всех этапах работы и включало: отбор пациентов, проведение пол
ного клинического и эндоскопического обследования, первичную
обработку полученного материала, его систематизацию, статисти
ческую обработку и анализ результатов, написание статей в про
фильных научных журналах, внедрение результатов научного ис
следования в клиническую практику работы отделения гастроэнте
рологического клиники РостГМУ МЗ РФ, амбулаторно-
поликлинического отделения МБУЗ КДЦ «Здоровье».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 4 статьи в рецензируемых журналах. Получен патент на изобретение №2517069 «Способ прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника» (публикация в 15 бюллетене от 27.03.14г.).
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на ежегодной конференции «Диагностической медицинской ассоциации» (ДиаМА) (г.Москва, 1-4 октября 2012г.), XIII Международном Конгрессе хирургов и гастроэнтерологов (г. Баку, 2013), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г.Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.).
Внедрение результатов работы в практику. Материалы и результаты исследования применяются в учебном процессе на кафедре пропедевтики внутренних болезней, факультете повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов Рост-ГМУ (кафедра гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии). Результаты работы внедрены в практику работы отделения гастроэнтерологического клиники РостГМУ МЗ РФ, амбулаторно-поликлинического отделения МБУЗ КДЦ «Здоровье». Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 78 таблиц, иллюстрирована 11 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, указате-
ля литературы. Указатель литературы включает в себя 247 источников, из них 87 отечественных и 160 зарубежных.
Антимикробные пептиды и воспалительные заболевания кишечника
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым относятся язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), остаются одной из нерешенных проблем в гастроэнтерологии [3]. Этиология и патогенез ВЗК до настоящего времени изучены не достаточно. Рост заболеваемости среди лиц трудоспособного возраста, отсутствие специфического лечения, рецидивирующее течение, развитие угрожающих жизни осложнений, необходимость проведения длительной, часто пожизненной, дорогостоящей терапии и неблагоприятный медико-социальный прогноз обусловливают актуальность дальнейшего изучения ВЗК [11].
Между первыми клиническими проявлениями заболевания и установлением диагноза часто проходит значительное время, что существенно затрудняет своевременность и правильность назначения адекватной терапии и неизбежно негативно сказывается на прогнозе заболеваний. Поздняя диагностика и несоответствующее лечение приводят к развитию осложнений, выходу на инвалидность лиц трудоспособного возраста и летальному исходу. Следует подчеркнуть резкое снижение качества жизни больных ВЗК, за счёт ухудшения физического, социального и эмоционального функционирования. Эксперты определяют следующий перечень наиболее распространённых факторов, ведущих к снижению качества жизни, связанного со здоровьем (КЖСЗ) больных с ВЗК: частый жидкий стул, боли в животе, психоэмоциональное напряжение в связи с боязнью обострения заболевания, его озлокачествления или необходимостью хирургического вмешательства. Более того у больных с перианальными свищами или колостомами нередки проблемы в межличностных отношениях. Интересно, что у больных с БК уровень КЖСЗ достоверно ниже, чем у больных с ЯК.
Частота ЯК по данным разных авторов составляет от 21 до 268 случаев, а БК от 9 до 199 случаев на 100 тыс. населения, достигая максимальных значений в странах Скандинавии, Северной Америке, Канаде, Израиле. Важным эпидемиологическим фактом является отмечающаяся в последние годы тенденция к увеличению заболеваемости ЯК среди лиц старше 60 лет и БК в детском возрасте [22, 71,94,98]. В целом распространенность ВЗК по России остается неизвестной. Первые эпидемиологические исследования в России были проведены в Московской области. Согласно данным, полученным Е.А.Белоусовой, распространенность ВЗК в европейской части России соответствует 20,4 на 100 тысяч населения для ЯК и 3,7 на 100 тысяч населения для БК [11]. По данным И.В. Никулиной и соавт. (1997) особенностью заболеваемости ВЗК в России является 3-кратное преобладание тяжелых осложненных форм с высокой летальностью, что связано с поздней диагностикой [57]. Так, диагноз ЯК в течение первого года болезни устанавливается только в 25% случаев, в остальных случаях понимание о болезни определяется на протяжении 3-12 лет от дебюта клинических симптомов. Соответственно, при поздней диагностике ЯК, тяжелые осложнения развиваются в 29% случаев. При установлении диагноза БК в период до трех лет частота осложнений составляет 55%, при более поздней диагностике - 100% случаев. Региональная статистика ВЗК в открытой печати приводится с 2002 года [55, 77]. Так, в Ростовской области за 2004-2005 годы было выявлено 1428 больных ВЗК, из них 1135 случаев ЯК, 293 случая БК [77]. За 2008 год выявлено 182 новых пациента с ЯК и 45 -с БК. Уровень смертности от ВЗК также зависит от своевременной диагностики и адекватности терапевтических подходов, составляя приблизительно 6 случаев на 1 миллион населения в США, странах Северной Европы и Великобритании. При этом более высокий риск отмечается у двух категорий больных: перенесших колэктомию и пожилых. В России показатель смертности от ВЗК составляет 17 случаев на 1 миллион населения. Данные различия ряд авторов объясняет тем, что в России в большинстве случаев диагноз устанавливается отсрочено - через несколько лет от момента появления первых клинических симптомов заболевания. Отсутствие достаточных знаний о механизмах развития заболеваний тормозит разработку научно-обоснованной стратегии ведения этой категории больных. Последнее придает указанной проблеме не только медицинский, но и социальный характер.
Этиология ЯК и БК остается неизвестной, так как не обнаружено определенного инфекционного агента, пищевого антигена или иного внешнего фактора, который мог бы вызвать заболевание в эксперименте. На сегодняшний день общепризнанной точкой зрения является представление о ВЗК как многофакторном заболевании с генетической предрасположенностью [206]. Предрасположенность к заболеванию определяется генами, кодирующими иммунный ответ, которые запускаются внешним стимулом [93]. Семейные случаи заболевания регистрируются у 10-20% пациентов с ВЗК, но более очевидна семейная «история» при БК, хотя среди ближайших родственников ЯК встречается в 15 раз чаще, чем в общей популяции. Однако малая величина конкордантности по ЯК у монозиготных близнецов (6-14%), по сравнению с близнецовой конкордантностью при БК (44-50%) является самым сильным свидетельством того, что для патогенеза ЯК факторы местной среды более важны, чем генетические факторы [20].
Установлено, что из факторов окружающей среды в патогенезе ВЗК наиболее значимы курение, очень высокий гигиенический уровень в детстве, непереносимость лактозы, употребление в повышенных количествах рафинированных углеводов, недостаток балластных веществ. Так, лица, употребляющие много жира, особенно ненасыщенные жирные кислоты, чаще заболевают ЯК, а курящие – БК [107]. Выявлено, что курение повышает образование слизи и тормозит моторику толстой кишки. Результаты исследований in vivo показали, что никотин оказывает подавляющее действие на функцию Th-2, которые преобладают при ЯК, однако, никотин не действует на клетки Th-1.
Воспалительный процесс в кишке приводит к изменению функционирования периферической и центральной нервной системы, что в свою очередь оказывает влияние на течение самого воспалительного процесса [12]. У 35% больных ЯК наблюдается дисбаланс автономной нервной системы, заключающийся в ослаблении парасимпатической иннервации и преобладании симпатической, что, возможно, способствует воспалительному ответу [69]. Более того, психологический стресс рассматривается как потенциальный триггер ЯК, регистрируемый в 40% случаев ЯК.
По данным когортных исследований снижение заболеваемости инфекциями приводит к увеличению частоты воспалительных заболеваний. Таким образом, санитарное состояние, возможно, играет значительную роль в развитии ВЗК, и прежде всего БК. Интересные данные были представлены Feillet H. et al. (2004) по результатам экспериментального исследования при создании модели ВЗК у грызунов [130]. Было показано, что начало колита может быть предупреждено назначением бактерий, бактериальных экстрактов или гельминтов. Авторы называют два основных механизма, объясняющих защитную роль инфекций в отношении иммунных нарушений - конкуренция и супрессия. Первый механизм реализуется за счет конкуренции за антиген, которая вызывается фагоцитами, конкуренции за связывание антигенных пептидов с молекулами главного комплекса гистосовместимости, а также за счет конкуренция за цитокины, необходимые для дифференцировки и гомеостаза лимфоцитов. К супрессивным механизмам относят действие супрессивных цитокинов (ИЛ-10, трансформирующий фактор роста-), которые играют основную роль в активации регуляторных Т-лимфоцитов. Авторы аргументируют вывод о том, что бактерии и паразиты осуществляют неспецифическую протекцию при ВЗК [131].
Микробиологическое исследование содержимоготолстой кишки
Недостаточность кардии грыжа пищеводного отверстия регистрировалась практически у половины больных: 42,9% и 49,2% случаях, соответственною Воспалительные изменения слизистой пищевода, тела и антрального отдела желудка, 12-перстной кишки имели место в 47,6%, 57,1%, 76,2% и 28,6% случаев, соответственно. Эрозии СО пищевода, тела, антрального отдела желудка и 12-перстной кишки были выявлены в 17,5%,
28,6%, 69,8% и 25,4% наблюдений, соответственно. Атрофические изменения СОЖ и дуоденогастральный рефлюкс встречались редко: 4,8% и 11,1% случаев, соответственно. Положительный уреазный тест на Helicobacter pylori констатирован у 19 (30,2%) больных. Полуколичественная оценка эндоскопической активности ЯК проводилась с использованием критериев Schroeder (табл. 3.13).
По методике Schroeder выделяют минимальную, умеренную и выраженную эндоскопическую активность. Критериями для минимальной активности являются наличие гиперемии слизистой толстой кишки, смазанный сосудистой рисунок при отсутствии контактной ранимости. Умеренная эндоскопическая активность сопряжена с такими критериями как выраженная гиперемия, отсутствие сосудистого рисунка, контактная ранимость, эрозии. Спонтанная ранимость слизистой толстой кишки, наличие изъязвлений были критериями выраженной эндоскопической активности.
У больных ЯК чаще встречалась умеренная эндоскопическая активность: 13 (72,2%), 18 (75%) и 18 (85,7%) пациентов 1, 2 и 3 групп, соответственно. Общий балл эндоскопической активности по Mayo-Schroeder в 1, 2 и 3 группах составил 1,7±0,1, 1,8±0,09 и 2,1±0,08 баллов соответственно.
Таким образом, в исследовании были сформированы три клинические группы больных с ЯК, ранжированные по распространенности воспалительного процесса и его активности. Лабораторные маркеры общей воспалительной реакции в сыворотке крови и кале у больных с рецидивом ЯК представлены в таблице 3.14.
Количество лейкоцитов в периферической крови в 1, 2 и 3 группах наблюдения превышало в 1,7, 1,9 и 1,97 раза значения группы здоровых добровольцев (p 0,05). Кратность превышения величины СОЭ в группе здоровых волонтеров в 1, 2 и 3 группах составила 3,9, 3,9 и 4,1 раза соответственно (p 0,05). Уровень СРБ в 1, 2 и 3 группах превышал значение в контрольной группе в 11,8, 11,1 и 11,4 раза соответственно (p 0,05). Концентрация фибриногена сыворотки крови была у больных с рецидивом ЯК, чем в группе волонтеров в 2,2, 2,5 и 2,65 раза, соответственно (p 0,05). Таким образом, среди лабораторных маркеров общей воспалительной реакции максимально изменялись величины СРБ и СОЭ. У больных 2 и 3 групп количество лейкоцитов в периферической крови было достоверно выше по сравнению с 1 группой наблюдения (p 0,05) (табл. 3.14).
Внутригрупповой анализ маркеров общей воспалительной реакции у больных с рецидивом ЯК позволил установить, что ускоренное СОЭ имело место у всех больных (табл. 3.15).
Практически у всех пациентов с рецидивом ЯК наблюдался лейкоцитоз, значимое повышение СРБ и фибриногена в крови. Так, в 1, 2 и 3 группах больных лейкоцитоз наблюдался в 83,3% (n=15), 95,8% (n=23) и 100% (n=21), повышение СРБ в крови выше 10 мг/л – в 94,4% (n=17), 91,7% (n=22) и 100% (n=21), гиперфибриногенемия – в 88,9% (n=16), 95,8% (n=23) и 100% (n=21), соответственно. Лишь в единичных случаях у больных 1 и 2 групп лабораторные маркеры общей воспалительной реакции находились в пределах нормального диапазона. Статистически значимых различий маркеров общей воспалительной реакции в группах больных с рецидивом ЯК обнаружено не было.
Таким образом, лабораторные маркеры общей воспалительной реакции у больных ЯК расширяли представления о тяжести рецидива ЯК.
Известно, что от активности фагоцитоза зависит функция разрушения и выведения иммунных комплексов из организма, активно образующихся при ВЗК [62]. При этом, важно, чтобы возможности фагоцитов к захвату антигенов и их «переваривающая» способность были адекватны возросшему количеству бактериальных и тканевых антигенов при ВЗК, но при этом не вызывали повреждения собственного эпителия толстой кишки [43]. Показатели фагоцитоза в зависимости от локализации воспалительного
Примечание: - достоверные различия по сравнению с контрольной группой; - по сравнению с 1 группой; - по сравнению со 2 группой при р 0,05.
У больных с ЯК изменение активности фагоцитоза выглядело следующим образом: при дистальной локализации воспаления (1 группа больных с проктосигмоидитом) активность фагоцитоза на 12,5% превышала значения группы здоровых добровольцев; при более распространенном поражении толстой кишки (2 и 3 исследовательские группы больных) уровень изучаемого показателя был ниже, чем в контрольной группе. Интенсивность фагоцитоза также зависела распространенности воспаления в кишке: 4,5±0,4, 4,4±0,3 и 3,2±0,2, что на 38,4%, 39,7%, 56,2% отличалось от контрольных значений (7,3±0,3) соответственно в 1, 2 и 3 группах больных (p 0,05). Следовательно, характеристика функциональной активности нейтрофилов свидетельствует о наличие сопряженности между площадью поражения толстой кишки со снижением активности и интенсивности фагоцитоза.
Во всех случаях наблюдения спонтанный НСТ тест был повышен по сравнению с контролем: на 45,5% , 18,5% и 27,3% соответственно для 1, 2 и 3 групп (p 0,05). Наиболее высокое значение спонтанного НСТ теста было характерно для 1 группы (67,8±1,6%), снижалось во 2 и 3 группах на 18,6% и 12,5% (p 0,05), соответственно. Во 2 группе (55,2±1,7%) и 3 группе (59,3±1,3%) величины спонтанного НСТ теста были сопоставимы между собой(p 0,05). Причиной повышения спонтанного НСТ-теста у больных ЯК, очевидно, является поглощение фагоцитами микробов, сопровождающееся усилением потребления кислорода этими клетками, образованием перекиси водорода и свободных радикалов кислорода. Повышение спонтанного теста с НСТ у больных ВЗК может рассматривается как следствие антигенного раздражения в результате бактериального воспаления, усиления антителозависимой цитотоксичности фагоцитов, аутоаллергического процесса, характерных для изучаемой патологии [63, 208].
Характеристика фагоцитарной активности нейтрофилов 64 у больных с рецидивом язвенного колита
Во 2 группе клинический индекс Rachmilewitz после 4, 8 и 12 недель лечения достоверно снижался с 13,8±0,22 до 11,3±0,34, 6,4±0,25 и 3,1±0,18 баллов, соответственно, на 18,1%, 53,6% и 77,5%, (p 0,05). Клинический индекс Truelove и Witts по сравнению с исходной величиной в эти же сроки наблюдения снижался на 31,8%, 63,6% и 81,8% соответственно, (p 0,05). Эндоскопические параметры индексов Rachmilewitz и Mayo-Schroeder во 2 группе через 4 недели лечения достоверно не изменялись, что характеризовало лишь формирование тенденции к снижению активности воспаления и свидетельствовало об отсутствии эндоскопической ремиссии заболевания.
Динамика индексов клинико-эндоскопической активности язвенного колита у больных 3 исследовательской группы на фоне курсовой терапии Индексы Рецидив На фоне лечения недели 8 недель 12 недель
Клинический индекс Rachmilewitz, баллы 14,2±0,38 11,8±0,57 6,9±0,52 3,7±0,27 Клинический индекс Truelove и Witts, баллы 2,3±0,28 1,6±0,13 0,9±0,09 0,6±0,03 Эндоскопический индекс Rachmilewitz, баллы 7,5±0,84 6,2±0,48 5,8±0,41 1,6±0,08 Индекс Mayo -Schroeder, баллы 2,1±0,04 1,5±0,42 1,3±0,22 0,6±0,012 Полный индекс Mayo 8,5±1,35 - - 1,8±0,07 Примечание: - достоверные отличия по сравнению с исходными значениями, при p 0,05
Через 8 и 12 недель лечения у пациентов 2 группы регистрировалось статистически достоверное снижение (p 0,05) эндоскопических индексов активности ЯК. Эндоскопический индекс Rachmilewitz через 8 недель снижался с 6,6±0,57 до 5,4±0,34 баллов на 18,2%, через 12 недель – до 1,2±0,058 баллов, на 81,2% (p 0,05). Индекс Mayo –Schroeder в эти же сроки наблюдения снижался (p 0,05) с 1,8±0,07 до 0,9±0,38 и 0,5±0,005 баллов, соответственно, на 50% и 72,2%. Полный индекс Mayo через 12 недель лечения изменялся с 7,8±1,07 до 1,3±0,02 баллов, снижаясь на 83,3% (p 0,05).
В 3 группе клинический индекс Rachmilewitz после 4, 8 и 12 недель лечения достоверно снижался (p 0,05) с 14,2±0,38 до 11,8±0,57, 6,9±0,52 и 3,7±0,27 баллов, соответственно, на 16,9%, 51,4% и 73,9% (p 0,05). Клинический индекс Truelove и Witts по сравнению с исходной величиной в эти же сроки наблюдения снижался на 30,4%, 60,9% и 73,9% (p 0,05). Эндоскопические параметры индексов Rachmilewitz и Mayo -Schroeder во 3 группе через 4 недели лечения достоверно не изменялись, что свидетельствовало об отсутствии эндоскопической ремиссии заболевания. Через 8 и 12 недель лечения у пациентов 3 группы также регистрировалось статистически достоверное снижение эндоскопических индексов активности ЯК (p 0,05). Эндоскопический индекс Rachmilewitz через 8 недель снизился с 7,5±0,84 до 5,8±0,41 баллов на 22,7%, через 12 недель – до 1,6±0,08 баллов на 78,7% (p 0,05). Индекс Mayo –Schroeder в эти же сроки наблюдения снизился с 2,1±0,04 до 1,3±0,22 и 0,6±0,012 баллов, соответственно, на 38,1% и 71,4% (p 0,05). Полный индекс Mayo через 12 недель лечения изменялся с 8,5±1,35 до 1,8±0,07 баллов, снижаясь на 78,8% (p 0,05).
Уровни клинического и эндоскопического индексов Rachmilewitz во всех группах через 12 недель лечения находились в интервале от 0 до 4 баллов, что соответствовало достижению клинической ремиссии заболевания. Значения полного индекса Mayo через 12 недель лечения варьировали в диапазоне 0-2 баллов, что свидетельствовало о наступлении эндоскопической ремиссии ЯК. Частота достижения клинической и клинико-эндоскопической ремиссии отражена в табл. 4.4 -4.5.
У больных с дистальной формой ЯК (1 группа) на фоне 8 недельной базисной терапии клиническая ремиссия ЯК по индексам Rachmilewitz, Truelove и Witts была достигнута в 11 (61,1%) случаях. Эндоскопическая ремиссия через 8 и 12 недель курсовой терапии была зарегистрирована в 9 (50%) и 18 (100%) случаях.
Во 2 группе наблюдения через 8 недель лечения констатировано достижение клинической ремиссии заболевания с использованием индексов Следует отметить, что 8 недельная курсовая терапия сопровождалась более низким уровнем (16,7%) формирования эндоскопической ремиссии. В тоже время, через 12 недель лечения во всех случаях зарегистрировано, по результатам индексирования (эндоскопический индекс Rachmilewitz, полный индекс Mayo), наступление клинико-эндоскопической ремиссии заболевания.
У больных 3 исследовательской группы с тотальным поражением толстой кишки через 8 недель курсовой терапии уровень клинической ремиссии по индексам Рахмилевича и Truelove и Witts был достигнут лишь в 2 (9,5%) и 3 (14,3%) случая, эндоскопическая ремиссия лишь в 1 (4,8%) случае, соответственно. К моменту завершения 12 недельной курсовой терапии наступление клинико-эндоскопической ремиссии было констатировано у всех больных с ЯК. Таким образом, к моменту завершения 12 недельного курса лечения при динамическом обследовании больных отмечено несоответствие между количеством пациентов с клинической и эндоскопической ремиссией заболевания. Данное обстоятельство диктует необходимость использования в реальной терапевтической практике не только мониторинг клинических симптомов заболевания, но и проведения динамических контрольных эндоскопических исследований толстой кишки с использованием специальных индексов активности ЯК: Mayo-Schroeder, эндоскопического индекса Rachmilewitz, полного индекса Mayo. Указанный подход позволяет объективизировать наступление полной эндоскопической ремиссии ЯК, сопровождающейся заживлением СО толстой кишки, что обеспечивает достижение основной цели лечения заболевания.
Принимая во внимание отсутствие в стандартах ведения больных с ВЗК регламентирующих положений о сроках проведения эндоскопического исследования толстой кишки для обеспечения контроля эффективности базисной терапии, мы провели анализ частоты контрольных эндоскопических исследований с использованием доступной медицинской документации (табл. 4.6).
Динамика лабораторных показателей системной воспалительной реакции у больных язвенным колитом на фоне курсовой терапии
Использование модели вероятности раннего рецидива позволили выявить критерии вероятности раннего рецидива. В качестве точки разделения раннего рецидива была принята вероятность равная 50%. Величины равные или превышающие указанное значение свидетельствовали о наличии высокого риска раннего рецидива ЯК. В случаях более низких значений вероятности 50%, риск раннего рецидива был минимальным и состояние больного расценивалось как стойкая ремиссии.
С целью прогноза риска рецидива ЯК был проведен дополнительно ROC-анализ для выделения диагностических точек разделения для сс-дефензина, -дефензина и кальпротектина. Результаты ROC-анализа позволили определить диагностические точки разделения: содержания сс-дефензина в сыворотке крови - более 312 нг/мл (диагностическая чувствительность - 71%, диагностическая специфичность - 88%), -дефензина в кале более 213 нг/г (диагностическая чувствительность - 78%, диагностическая специфичность - 85%) и кальпротектина в кале - более 232 мкг/г (диагностическая чувствительность - 82%, диагностическая специфичность - 89%). Вероятность развития раннего рецидива ЯК при достижении указанных диагностических точек разделения АМП и кальпротектина составила 50%.
При превышении уровней сразу трех антимикробных пептидов в биологических жидкостях диагностическая чувствительность возрастала до 87%, а диагностическая специфичность составила 92%.
Таким образом, полученные в процессе исследования результаты демонстрируют важное значение продукции а- и -дефензинов, кальпротектина в инициации и поддержании воспаления в СО толстой кишки, что послужило теоретическим обоснованием целесообразности использования их в качестве дополнительных параметров, определяющих эффективности базисной медикаментозной терапии и прогнозирующих риск раннего рецидива ЯК. Результаты проведенного исследования оценки прогностической значимости мониторинга эндогенных АМП и кальпротектина при наблюдении за больными ЯК позволили разработать патент «Способ прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника» [№ заявки 2012149560 /15(079427) от 13.09.13г.]. Технико экономическая эффективность заявляемого способа заключается в том, что высокая прогностическая вероятность развития рецидива у больных воспалительными заболеваниями кишечника позволяет провести своевременную профилактику и лечение патологии, что способствует снижению риска инвалидизации пациента и потери им своего социального и трудового потенциала. Исследование безопасно, инвазивные вмешательства (забор крови из вены и кала) минимальны, доступно для профильных учреждений здравоохранения, нетрудоемкое, затраты на оборудование и обучение персонала минимальные.
Врожденный иммунитет ЖКТ помимо естественного анатомического барьера, представленного слизистой оболочкой, включает систему наследственной резистентности. Основными ее составляющими являются цитокины, каскад цепи реакций комплемента, лейкоциты с их фагоцитарными свойствами и, в значительной мере, иммунозащитные пептиды. Последние эволюционно приспособлены для предотвращения микробного заражения и повреждения тканей кишки, что является важным с точки зрения патогенеза ВЗК при котором развивается их несбалансированная экспрессия, напрямую зависящая от активности и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке [40, 119, 219]. Несбалансированная экспрессия иммунозащитных пептидов, наблюдаемая при ЯК, требует понимания, т.к. повышение продукции АМП напрямую связано с активностью и распространенностью патологического процесса.
Известно, что АМП делятся на три функциональные группы: пищеварительные ферменты, разрушающие структуру микроорганизма (лизоцим); пептиды, способные связывать жизненно необходимые элементы как цинк или железо (кальпротектин и лактоферрин); и пептиды, которые проникают сквозь поры микробных мембран (дефензины) [18, 97, 213, 245]. Научно-практический интерес представляет изучение ассоциации между уровнем АМП различных функциональных классов и клиническими характеристиками ЯК.
В связи с вышеизложенным, настоящее исследование, целью которого явилось изучить ассоциации между клинико-эндоскопическими характеристиками, распространенностью и активностью ЯК и уровнем иммунозащитных пептидов в биологических средах, является актуальным.
В работу были включены 63 больных ЯК с разной локализацией воспалительного процесса толстой кишки: у 18 пациентов (1 группа) воспалительный процесс ограничивался областью прямой и сигмовидной кишки, у 24 (2 группа) - наблюдалось левостороннее поражение кишки, у 21 больного (3 группа) имел место панколит. Установленные величины клинического и эндоскопического индексов Rachmilewitz, индекса Truelove and Witts и индекса Schroeder или клиники Mayo свидетельствовали об обострении заболевания. При этом, у пациентов трех групп наблюдалась средняя степень активности ЯК. По анамнестическим сведениям было установлено, что клиническая форма заболевания была хронической, течение - рецидивирующим. В качестве ведущего клинического симптома пациенты трех групп указывали на диарею, затем на примесь крови в кале, боль в животе. Частота диареи в половине случаев встречалась с кратностью 3-6 раз в сутки, в трети случаев частота диареи колебалась от 6 до 10 раз в сутки. По анамнезу заболевания, основным клиническим жалобам, эндоскопическим характеристикам повреждения слизистой толстой кишки, кроме локализации и протяженности поражения, больные трех групп практически не отличались.
Установлено, что - и -дефензины отличаются друг от друга организацией дисульфидных связей: для -дефензинов это Cysl–Cys6, Cys2-Cys4 и Cys3-Cys5, в то время как для -дефензинов это Cysl–Cys5, Cys2-Cys4 и Cys3-Cys6 [160]. -дефензины представляют собой классические мелкие «нейтрофильные дефензины», тогда как -дефензины более крупные. Секретируемые нейтрофилами а-дефензины легко можно обнаружить в крови иммуноферментным методом. -дефензинам более свойственна конститутивная экспрессия, тогда как выработка -дефензинов чаще индуцируется и запускается [40, 97]. То есть, если -дефензины секретируются постоянно в фоновом режиме, усиливаясь при воспалении и инфекции, то -дефензинам для секреции требуется определенный пусковой фактор. В период обострения ЯК у пациентов трех групп уровень -дефензина в крови возрастал.
