Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I 12
1.1 Медико- социальное значение проблемы ВЗК 12
1.2 Представление об этиологии и патогенезе язвенного колита 14
1.3 Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы при различных патологических состояниях 19
1.3.1 Структура матриксных металлопротеиназ 20
1.3.1.1 Коллагеназы 21
1.3.1.2 Желатиназы 22
1.3.1.3 Стромелизины 22
1.3.1.4 Матриксные металлопротеиназы мембранного типа (ММП-МТ) 23
1.3.2 Специфические и неспецифические ингибиторы ММП 24
1.3.3 Роль матриксных металлопротеиназ при патологии внутренних органов 27
1.3.4 Участие матриксных металлопротеиназ в канцерогенезе 29
1.3.5 Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы в патогенезе ВЗК 31
1.4 Вопросы диагностики и лечения язвенного колита 36
Глава 2 Материалы и методы исследования 41
2.1 Материалы исследования 41
2.2 Методы исследования 43
2.2.1 Оценка клинических проявлений ЯК 43
2.2.2 Лабораторное исследование 44
2.2.3 Эндоскопическое исследование толстого кишечника 44
2.2.4. Морфологическое исследование 45
2.2.5 Иммуногистохимическое исследование колонобиоптатов 46
2.2.6 Статистическая обработка данных 47
Глава 3 Комплексная оценка больных язвенным колитом 49
3.1. Клиническая характеристика больных язвенным колитом 49
3.1.1. Оценка клинических проявлений ЯК с использованием индекса Мэйо и Рахмилевича 52
3.2. Оценка эндоскопического исследования кишечника с использованием эндоскопического индекса активности язвенного колита по Мэйо-Schroeder и по Рахмилевичу 53
3.3. Активность матриксной металлопротеиназы-9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 у больных язвенным колитом 55
3.4. Определение взаимосвязей между ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки и клиническими, эндоскопическими и лабораторными показателями у больных ЯК . 72
3.5. Прогностическая значимость определения ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у больных ЯК 82
3.5. Оценка экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 к сигмовидной и прямой кишке у больных СРК-Д 86
Глава 4 Обсуждение результатов исследования 91
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список литературы 104
- Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы при различных патологических состояниях
- Оценка клинических проявлений ЯК
- Оценка клинических проявлений ЯК с использованием индекса Мэйо и Рахмилевича
- Определение взаимосвязей между ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки и клиническими, эндоскопическими и лабораторными показателями у больных ЯК
Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы при различных патологических состояниях
Несмотря на прогресс в изучении механизмов развития ЯК этиология заболевания остается неизвестной. Длительное время существовала теория о наличии специфического неидентифицированного инфекционного возбудителя, которая так не нашла подтверждения.В качестве возможной причины ЯК исследовались такие возбудители, как Shigella ,Shigella-подобный токсин, Salmonella, Yersinia. В ряде работ обострение заболевания связывали с выявлением Clostridium difficile [242], та же роль отводилась инфекции, вызванной Salmonella, что, вероятно, обусловлено снижением защитной способности слизистой оболочки [64].
В настоящее время предполагается, что условно-патогенная флора желудочно- кишечного тракта (ЖКТ) может играть значительную роль в патогенезе ЯК [108, 252]. Так, в своих исследованиях R. Duchmann et. al. (1995) выявили, что в контроле мононуклеарные клетки СО не реагировали на собственные бактерии в отличие от моделей ВЗК, у которых наблюдалась выраженная инфильтрация мононуклеарами [81].
В ряде исследований было выявлена пролиферация E.coli в кишечнике у экспериментальных моделей животных и пациентов с ЯК [40, 150, 252]. Исследования, выполненные на моделях мышей с нокаутным геном (129/SvEv) показали, что хроническое воспаление в кишке у мышей IL- 10-/- приводит к уменьшению разнообразия микрофлоры кишечника и стойкому снижению количества E. сoli в кишке [150]. По данным Pilarczyk-Zurek et al. (2013) значительное увеличение количества E. сoli, а не ее высокая вирулентность, может влиять на воспалительный процесс в ЖКТ [220]. Исследования, проведенные Mylonaki et al. (2005) указывают на значительное увеличение популяции E. coli в колонобиоптатах у пациентов с ЯК в стадии обострения по сравнению с пациентами с ЯК в состоянии ремиссии и контрольной группой [195]. Kleessen at al. проводил анализ количественных изменений бактериальной популяции у пациентов с ЯК по сравнению с контрольной группой и продемонстрировал увеличение популяции Enterobacteriacae, включая E. coli [141]. По мнению Masseret E. et. al. (2001) некоторые генотипы E. сoli связаны с ВЗК [178]. Так, у пациентов с ВЗК наиболее часто по сравнению с контрольной группой выявляется штамм E. coli [71, 150]. Однако исследования, проведенные на экспериментальных моделях животных, не выявили корреляции между увеличением количества E. coli и степенью тяжести воспаления, что подтверждается предположением о том, что высокий уровень E.coli является скорее следствием, нежели причиной заболевания [150]. Более того в работе Simmonds N.J. et al. (1993) было показано, что непатогенные штаммы E. сoli ускоряют наступление ремиссии [255].
Многочисленные научные исследования показывают, что возникновение и течение ЯК во многом обусловлено генетическими и молекулярными нарушениями регуляции клеток иммунной системы [11], в частности наличие генетически обусловленной аномалии местного иммунного ответа на нормальный внутрипросветный антиген (или антигены) [9, 138].
Иммунная система ЖКТ взаимодействует с большим количеством пищевых и микробных антигенов, что вызывает состояние «непатогенного» воспаления кишечника. Взаимодействие кишечного эпителиального барьера и специализированных иммунных клеток требуется для того, чтобы дифференцировать «опасные» антигены, различные пищевые возбудители, и не представляющие опасность и полезные бактерии – комменсалы, и таким образом, поддерживать иммунный гомеостаз. Дефекты в проницаемости стенки ЖКТ ведут к развитию неадекватного иммуного ответа, даже в отношении пищевых или просветных антигенов. Слизистая оболочка (СО) толстой кишки, вовлеченная в воспалительный процесс в результате нарушения проницаемости кишечной стенки подвергается воздействию большого количества просветных антигенов, в результате чего формируется порочный круг [174].
При ЯК отмечается активация врожденного (макрофаги, нейтрофилы) и приобретенного (Т- и В- лимфоциты) иммунитета, отсутствие толерантности к условно- патогенной флоре, что также подтверждает наличие неадекватного иммунного ответа на антигены резидентной флоры у этого контингента больных. Это указывает на пролиферативный или цитокиновый Т- клеточный ответ на антигены, происходящие из собственных фекальных экстрактов [81, 190].
В процессе развития воспаления в собственной пластинке СО толстой кишки увеличивается абсолютное количество макрофагов и дендритных клеток, продукция провоспалительных цитокинов, хемокинов, а также адгезивных и ко-стимулирующих молекул, которые опосредуют миграцию иммунных клеток через строму к источнику наибольшей продукции цитокинов и через эпителий в просвет кишки с образование крипт абсцессов [230].
Провоспалительные агенты продуцируются преимущественно моноцитами и полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ), которые мигрируют в очаг воспаление скорее, чем резидентные макрофаги. Резидентные макрофаги обладают ограниченной активностью в отношении бактериальных адьювантов, вследствии снижения количества Toll-рецепторы и CD14+, ко-лигандов для липополисахаридов [257]. Показано, что клетки кишечного эпителия в нормальном состоянии имеют низкий уровень Toll-рецепторов, которые экспрессируются на поверхности различных эффекторных клеток врожденной иммуной системы, что позволяет эпителиальным клеткам находиться в дистальном отделе тонкой и в толстой кишке при высоких концентрациях бактерий в просвете кишки [132]. Также многочисленные бактериальные адьюванты, такие как липополисахариды, пептидогликаны, флагеллины могут селективно связываться с Toll-рецепторами. Лигирование Toll-рецепторов активирует NFB (транскрипционный ядерный фактор каппа) и митоген-активируемую протеинкиназу, что ведет к стимуляции транскрипции провоспалительных и регуляторных генов. Активация NFB стимулирует экспрессию многочисленных молекул (IL-1 , IL -6, IL-8, TNF), имеющих отношение к патогенезу ВЗК [243]. Кроме того, липополисахариды, пептидогликаны, флагеллины также вызывают активацию макрофагов, что ведет к выработке IL-1 , IL -6, IL-8, TNF , молекул адгезии, IL-18, IL-12 р40, активных форм кислорода, оксида азота, лейкотриенов, участвующих в иммунном ответе [138].
В нормальном состоянии иммунная система поддерживает баланс между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами. Селективная активация субпопуляций Т- лимфоцитов CD4+ (Т- хелперов 1 (Тх1) и 2 типов (Тх2)) считается основным звеном нарушений иммунитета при ВЗК. Тх1 опосредуют воспалительный и цитотоксические реакции, Тх2 обеспечивают образование антител и тормозят функцию Тх1[7, 15, 240].
Цитокины синтезируются различными видами клеток: макрофагами, лимфоцитами, нейтрофилами, эпителиальными клетками. Воспалительный процесс, ассоциированный с ВЗК, приводит к нарушению нормального равновесия этих биологически активных веществ, что во многом определяет особенности течения заболеваний. По влиянию на процесс воспаления цитокины условно можно подразделить на провоспалительные и противовоспалительные [1].
Оценка клинических проявлений ЯК
При проведении анализа полученных результатов были выявлены статистически высоко значимые различия в экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в сигмовидной и прямой кишке между больными ЯК в стадии ремиссии, обострения и здоровыми добровольцами.
Были выявлены статистически значимые различия экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в колонобиоптатах в группе больных ЯК в стадии ремиссии при сравнении с группой пациентов ЯК в стадии обострения при умеренной и тяжелой степени течения. Особого внимание заслуживает факт отсутствия статистически значимых различий между группой больных ЯК в стадии ремиссии с пациентами с ЯК в стадии обострения, минимальной активности и здоровыми добровольцами, вместе с тем были выявлены значимые различия между группой ЯК в стадии обострения, минимальной активности и здоровыми добровольцами. Полученный результаты могут свидетельствовать о том, что, несмотря на наличие клинической и эндоскопической ремиссии в ряде случаев морфологическая ремиссия так и не достигается.
Дальнейший анализ показал, что высоко-значимыми по всем показателям экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в сигмовидной и прямой кишке являются парные сравнения группы ЯК в стадии обострения со здоровыми добровольцами (p 0.0001) и с группой ЯК в стадии ремиссии (p 0.005). Парные сравнения группы больных ЯК в стадии ремиссии со здоровыми добровольцами оказались значимыми только для уровней экспрессии ТИМП-1 (таблица 3.15). Это может свидетельствовать о нарушении регуляции экспрессии ММП-9 посредством снижения уровня ТИМП-1 у больных ЯК даже в стадии ремиссии заболевания. Сходные данные имеется в немногочисленных исследованиях, проведенных у больных с данной патологией [171, 197, 277]. Было выявлено, что при проктите, левосторонней и тотальной форме ЯК отмечается повышение экспрессия ММП-9 в СО сигмовидной и прямой кишки Me (Q0,25-Q0,75) (3,0(2,0-3,0) / 3,0(2,0-3,0); 3,0(2,0-3,0)/ 3,0(2,0-3,0); 3,0(3,0-3,0)/ 3,0(2,0-3,0)), соответственно. Экспрессия ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки также повышена при всех формах ЯК, однако имеет менее интенсивный характер (таблица 3.15).
При анализе экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в колонобиоптатах у больных ЯК с различными формами заболевания (тотальной, левосторонней, дистальной) статистически значимых различий выявлено не было (Таблица 17). При этом отличия от здоровых добровольцев были статистически значимы (p 0.001) для всех форм заболевания.
Исследование показателей экспрессии ММП-9 в СО сигмовидной и прямой кишки указывают на ее повышение и при легком Me(Q0,25-Q0,75) (3,0(2,0-3,0)/ 3,0(3,0-3,0)), и при среднетяжелом Me(Q0,25-Q0,75) (3,0(3.0-3,0)/ 3,0(3.0-3,0)), и при тяжелом Me (Q0,25-Q0,75) (4,0(3,0-4,0) течении. Экспрессия ТИМП-1 также увеличивается при всех формах ЯК, однако менее интенсивно, чем экспрессия ММП-9 (таблица 3.16). Таблица 3.16 Активность ММП-9 и ТИМП-1 в СОТК у больных ЯК в зависимости от тяжести течения заболевания (индекс Мэйо) p0 - критерий Манна-Уитни: парные сравнения группы больных ЯК, тяжелое течение и группой ЯК среднетяжелое и различия в уровнях экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в колонобиоптатах статистически значимы (p 0.001) для всех групп пациентов по тяжести течения заболевания. При анализе ММП-9 и ТИМП-1 в СО прямой и сигмовидной кишки у пациентов с различной степенью тяжести ЯК более значимые статистические различия были выявлены при сравнении экспрессии ММП-9 в прямой кишке (p = 0.02). Были выявлены статистически значимые различия экспрессии ММП-9 в СО прямой кишки в группе больных ЯК с тяжелой степенью тяжести в отличии от средней и легкой степени тяжести (критерий Манна-Уитни, p = 0.006). Полученные данные свидетельствуют о том, что при невозможности забора биопсийного материала из всех отделов толстого кишечника оценка экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО прямой кишки дает возможность оценить тяжесть атаки ЯК. Результаты исследования свидетельствуют о том, что экспрессия ММП-9 в колонобиоптатах возрастает по мере тяжести тканевого воспаления у пациентов с ЯК.
При анализе экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки в группе больных ЯК у мужчин и женщин статистически значимых различий выявлено не было (таблица 3.17).
Определение взаимосвязей между ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки и клиническими, эндоскопическими и лабораторными показателями у больных ЯК. Для выявления взаимосвязи между исследуемыми показателями и клиническими проявлениями ЯК, показателями лабораторных, инструментальных, морфологических исследований был проведен корреляционный анализ. Было установлено наличие высоко-значимой прямой связи (от умеренной до значительной) между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в прямой кишке и показателями индекса Мэйо (r [0.74;0.55]) (таблица 3.18, 3.19).
Оценка клинических проявлений ЯК с использованием индекса Мэйо и Рахмилевича
Были изучены корреляционные связи между клиническим, эндоскопическими, лабораторными исследованиями и показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО прямой и сигмовидной кишки.
Было выявлено, что уровень экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО из вышеуказанных отделов кишечника и в межклеточном веществе в зоне язв, в цитоплазме большинства макрофагов, ПМЯЛ, и в цитоплазме одиночных энтероцитов, а также их суммарный показатель, имели высоко-значимую (p 0.01) корреляцию между собой.
Наиболее выраженная связь выявлена между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной, прямой кишки и индексом Мэйо. Коэффициенты корреляции, указывающие на связь вышеуказанных показателей и клинического индекса Рахмилевича, были несколько ниже, что свидетельствует о том, что именно применение индекса Мэйо вероятно наиболее достоверно отражает активность заболевания.
Корреляция между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в колонобиоптатах и индексом эндоскопической активности по Рахмилевичу является выраженной и сопоставима с показателями корреляции с индексом Мэйо. Так, наиболее высокие коэффициенты корреляции были установлены для показателей повреждения СО толстой кишки, затем - изменениям сосудистого рисунка и ранимости СО.
Более выраженная взаимосвязь была установлена между показателями экспрессии ММП-9 в колонобиоптатах и показателями индекса гистологической активности, взаимосвязь между показателями ТИМП-1 в исследуемых отделах кишечника носила менее выраженный характер. Более высокие коэффициенты корреляции были выявлены между исследуемыми протеазами и следующими показателями индекса гистологической активности: активным и хроническим воспалением для показателя экспрессии ММП-9, ТИМП-1 в СО толстой кишки. Анализ корреляции показал умеренную обратную связь с уровнем гемоглобина между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной кишки. Значимых корреляции экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в соответствующих отделах кишечника с уровнем лейкоцитов и СОЭ установлено не было. Была выявлена высоко-значимая прямая связь между показателями экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в сигмовидной и прямой кишке и СРБ.
С целью прогнозирования рецидива ЯК была построены модели логистической регрессии, на основе которых были проведены ROC-анализы изученных показателей, что позволило определить диагностические пороги для выявления рецидива и ремиссии заболевания, а также оценить чувствительность и специфичность используемых показателей.
Установлено, что повышение экспрессии ММП-9 в прямой кишке на 1 балл (иммуногистохимический метод) ведет к увеличению в 1,7 раза риска развития рецидива ЯК с очень высокой статистической вероятностью (p 0,0001). Риск развития рецидива ЯК возрастает при определении ММП-9 в СО прямой кишки 3 баллов (чувствительность 92% и специфичность 99%).
Не менее информативным для определения риска развития рецидива ЯК является показатель экспрессии ТИМП-1 и в СО прямой, и в СО сигмовидной кишки. При использовании показателя экспрессии ТИМП-1 в СО прямой и сигмовидной кишке AUC=0,96, а чувствительность составляет 92%, специфичность - 91%.
Существуют некоторые сложности при определении единого порогового уровня для дифференциации рецидива и ремиссии ЯК, так как уровни показателей экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 и в СО прямой и в сигмовидной кишки у больных ЯК с ремиссией ниже показателей экспрессии исследуемых протеаз у больных с рецидивом ЯК, и при этом превышают экспрессию данных показателей у здоровых добровольцев. Использование в уравнении логистической регрессии квадрата показателя ММП-9 (общая) в СО прямой кишке позволило повысить точность диагностики: AUC = 0,94, чувствительность 99% и специфичность 89%.
В группе пациентов с СРК была выявлена слабая экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 в СО сигмовидной и прямой кишки, и соответственно, показатели экспрессии исследуемой протеазы и ее ингибитора были выше у больных с рецидивом ЯК. Вместе с тем, экспрессия ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у пациентов с ЯК в стадии ремиссии и у больных с СРК, диарейный вариант, имеют сходные показатели (рисунок 4.6).
Определение взаимосвязей между ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки и клиническими, эндоскопическими и лабораторными показателями у больных ЯК
Полученные данные свидетельствует о наличии морфологического субстрата при СРК, что сопровождается экспрессией ТИМП-1 в СО толстой кишки, в количестве, которое, вероятно, способно ограничивать протеолитическую активность ММП-9 и, соответственно, вести к развитию поверхностного воспаления СО толстой кишки в отличии от более выраженной экспрессии ММП-9 и отставания в экспрессии ТИМП-1 в СО толстой кишки при ЯК в стадии обострения, результатом чего являются тяжелые воспалительные изменения в толстой кишке
Установлено, что для больных СРК-Д соотношение ММП-9 : ТИМП-1 в СО толстой кишки составляет 1 : 1, и совпадает с показателем соотношения указанных показателей у больных ЯК в стадии ремиссии, однако отличается от соотношения ММП-9 : ТИМП-1 у больных ЯК в стадии обострения- 1,5 : 1 (p 0,05). Несмотря на то, что СРК относится к группе функциональных заболеваний, существует мнение о наличии морфологического субстрата, и вероятно, это и является объяснением экспрессии ММП-9 и ТИМП-1 в СО толстой кишки у этой категории пациентов.
1. Установлено повышение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке сигмовидной и прямой кишки у больных с рецидивом язвенного колита, которое зависит от степени активности заболевания.
2. Показана необходимость определения соотношения матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 для оценки тяжести заболевания и возможного развития рецидива язвенного колита. У пациентов с рецидивом соотношение матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 составило 1,5 : 1, а у пациентов в стадии ремиссии – 1 : 1.
3. У больных язвенным колитом выявлена корреляционная зависимость между показателями экспрессии матриксной металлопротеиназы 9, тканевым ингибитором матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочке сигмовидной и прямой кишки и показателями индекса Мэйо. По мере нарастания тяжести заболевания и выраженности воспалительных изменений в толстой кишке наблюдается повышение исследуемых показателей.
4. Установлены отличия экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения у пациентов с язвенным колитом и с синдромом раздраженной кишки. У больных язвенным колитом в стадии обострения показатели имели более высокие значения по сравнению с больными синдромом раздраженного кишечника, у пациентов язвенным колитом в стадии ремиссии и синдромом раздраженного кишечника - не отличались, и были выше, чем у здоровых добровольцев.
Установлено, что экспрессия матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки 3 баллам (при оценке иммуногистохимическим методом) соответствует рецидиву язвенного колита (диагностическая чувствительность 92% и специфичность 99%). Показатель экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки 2 балла (при оценке иммуногистохимическим методом) соответствуют ремиссии язвенного колита (диагностическая чувствительность 99% и специфичность 89%). Повышение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 в слизистой оболочке прямой кишки на 1 балл (при оценке иммуногистохимическим методом) ведет к увеличению в 1,7 раз риска развития рецидива язвенного колита.
Практические рекомендации
Для диагностики язвенного колита и оценки полноценности ремиссии рекомендуется определение экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 и их соотношения в слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки.
Предложено использовать математические модели прогноза риска развития рецидива язвенного колита на основе показателей экспрессии матриксной металлопротеиназы 9 и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы 1 в слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки.
