Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Определение, методы выявления, распространенность лекарственной резистентности вируса гепатита В (обзор литературы)
1.1. Вирусный гепатит В — возбудитель, патогенез, клиника (краткая характеристика)
1.2. Противовирусные препараты в терапии ХГВ 17
1.3. Механизм действия аналогов нуклеозидов/нуклеотидов - ИОТ 19
1.4. Определение лекарственной резистентности и механизм ее формирования 23
1.5. Разнообразие мутаций в гене полимеразы ВГВ, 28 ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости
1.6. Взаимное влияние гена полимеразы и поверхностного гена ВГВ 33
1.7. Методы определения лекарственной устойчивости ВГВ 36
1.8. Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ 44
Собственные исследования 52
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
1. Материалы исследования
1.1. Характеристика пациентов с ВГВ - моноинфекцией 52
1.2. Характеристика пациентов с коинфекцией ВИЧ/ВГВ 54
2. Методы исследования 55
2.1. Серологические маркеры ВГВ-инфекции 55
2.2. Молекулярные маркеры ВГВ-инфекции 56
2.3. Сравнительная оценка методов определения генотипа ВГВ и мутаций в гене полимеразы ВГВ (INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping и метода прямого секвенирования)
2.4. Методы статического анализа результатов исследований Результаты исследований 61
Глава 3. Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ в регионах Российской Федерации
3.1. Распространенность первичной лекарственной устойчивости 61 ВГВ в регионах Российской Федерации среди ВГВ-моноинфицированных пациентов
3.2. Распространенность первичной лекарственной устойчивости 67 ВГВ в регионах Российской Федерации среди ВГВ/ВИЧ -коинфицированных пациентов
3.3. Частота выявления маркеров инфицирования ВГВ и распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ среди «условно здорового» населения гиперэндемичного по ГВ региона (Республика Тыва)
Глава 4. Анализ аминокислотных замен перекрывающегося участка Р-гена и S-гена
Глава 5. Эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-биохимическая характеристика пациентов с наличием и отсутствием первичной лекарственной резистентности ВГВ
Глава 6. Сравнительная характеристика двух диагностических тестов (INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping и метода прямого секвенирования), предназначенных для определения генотипа ВГВ и мутаций в гене полимеразы ВГВ
Обсуяедение полученных результатов 96
Выводы 106
Практические рекомендации 107
Список литературы
- Механизм действия аналогов нуклеозидов/нуклеотидов - ИОТ
- Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ
- Серологические маркеры ВГВ-инфекции
- Эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-биохимическая характеристика пациентов с наличием и отсутствием первичной лекарственной резистентности ВГВ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирусный гепатит В (ГВ) является глобальной медицинской и социальной проблемой. Это обусловлено его повсеместным распространением среди различных групп населения, многообразием клинических форм и исходов (включая цирроз печени (ЦП) и первичный рак печени), стабильно-высокими показателями заболеваемости (И.В. Шахгильдян, М.И. Михайлов, Г.Г. Онищенко, 2003).
В терапии хронического гепатита В (ХГВ) применяются интерфероны-а (стандартные, пегилированные) и аналоги нуклеоз(т)идов - ингибиторы обратной транскриптазы (ИОТ).
Длительная терапия аналогами нуклеоз(т)идов ассоциирована с риском
формирования лекарственной устойчивости ВГВ, и вследствие, этого с прогрессированием течения заболевания (F. Wightman; 2004, Т. Yamazhan, 2007).
Продолжительная персистенция генома вируса гепатита В (ВГВ) в инфицированных гепатопитах и высокая частота возникновения спонтанных мутаций в вирусном геноме являются основой для селекции мутантных вариантов ВГВ, ассоциированных с формированием лекарственной устойчивости к ИОТ. Показано, что мутации в гене полимеразы ВГВ, связанные с лекарственной резистентностью, могут возникать до начала проведения противовирусной терапии (ПВТ) ИОТ, и инфицирование такими вариантами вируса может приводить к формированию первичной лекарственной устойчивости (R. Colonno, 2006; М. Ghany, 2007).
Выявление вариантов ВГВ с мутациями в гене полимеразы (Р-ген), ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости до начала проведения лечения, является клинически важным аспектом при ведении пациентов, нуждающихся в терапии аналогами нуклеоз(т)идов. Анализ мутантных вариантов ВГВ, связанных с лекарственной резистентностью, позволит предупредить обострение заболевания у таких пациентов, связанное с неэффективностью противовирусных препаратов. При высоком риске прогрессировать вирусного ГВ, особенно у пациентов с коинфекцией ВГВ/ВИЧ, ранее выявление устойчивых к терапии вариантов ВГВ является наиболее значимым. Используемый для детекции мутантных вариантов ВГВ метод должен быть достаточно чувствительным, чтобы применяться как до начала терапии нуклеоз(т)идными аналогами, так и в процессе лечения, когда уровень виремии может
быть очень низким и/или когда мутантные варианты ВГВ присутствуют в общей вирусной популяции в меньшей доле (J. Нео, 2008; С. Osiowy, 2006).
Данные о частоте первичной лекарственной резистентности ВГВ среди пациентов с острым и хроническим ГВ ограничены, поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется изучению распространенности мутантных вариантов ВГВ среди ВГВ-инфицированных пациентов, не получающих терапию ИОТ.
Эпидемиологические и вирусологические аспекты первичной лекарственной устойчивости ВГВ к терапии аналогами нуклеоз(т)идов среди ВГВ-инфицированных пациентов в Российской Федерации (РФ) ранее не изучались. Отсутствуют сведения о спектре мутаций, приводящих к развитию лекарственной устойчивости ВГВ, об их распространенности в регионах РФ с различной интенсивностью циркуляции ВГВ.
В связи с этим актуальным является определение эпидемиологических и вирусологических характеристик вариантов ВГВ, устойчивых к терапии аналогами нуклеоз(т)идов, среди пациентов, ранее не получавших ПВТ. Вышеизложенное определило цели и задачи исследования.
Цель исследования
Изучить распространенность вариантов ВГВ с наличием мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью, среди инфицированных ВГВ лиц, ранее не получавших противовирусную терапию аналогами нуклеоз(т)идов, в регионах Российской Федерации с различной степенью интенсивности циркуляции ВГВ.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
определить частоту выявления мутаций в Р-гене ВГВ, связанных с лекарственной устойчивостью среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и ВГВ/ВИЧ-коинфекцией, ранее не получавших терапию аналогами нуклеоз(т)идов;
охарактеризовать аминокислотные замены в Р-гене ВГВ;
сравнить вирусологические и клинико-биохимические показатели у лиц с наличием и отсутствием первичной лекарственной устойчивости ВГВ;
выбрать метод скрининга мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к аналогам нуклеоз(т)идов;
разработать алгоритм выявления лекарственной устойчивости ВГВ для оптимизации выбора противовирусного препарата.
Научные положения, выносимые на защиту
Частота выявления первичной лекарственной устойчивости ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов в группе пациентов с ВГВ-моноинфекцией составила 6,2% (17/273), с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией - 10,0% (3/30). Анализ распространенности мутантных вариантов ВГВ в изучаемых регионах Российской Федерации показал, что наибольшее число случаев первичной лекарственной резистентности ВГВ регистрируется среди ВГВ-инфицированных пациентов Московский области (15%; 9/60, р<0,01) в сравнении с другими регионами, что, по-видимому, связано с внедрением в данном регионе в программу противовирусной терапии ХГВ аналогов нуклеоз(т)идов.
При анализе нуклеотидных последовательностей гена полимеразы ВГВ определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (M204I, A181S, T184I, L199W, А194Т) и потенциально значимые мутации -Т184Р, L179S, S213F, M204L, L82P, S213Y, L179S, V214Y) - замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе.
При выборе метода скрининга мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования, тогда как коммерческий тест INNO-LiPA DR v2 более чувствителен, поскольку выявляет мутантные варианты ВГВ, присутствующие в общей вирусной популяции в минорном количестве (около 5%). Однако тест INNO-LiPA DR v2 имеет ограниченный спектр выявляемых мутаций.
Научная новизна работы
Впервые в регионах Российской Федерации, различающихся по интенсивности циркуляции ВГВ, определена частота выявления вариантов ВГВ с наличием мутаций, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью к аналогам нуклеоз(т)идов, среди ВГВ-инфицированных и ВГВ/ВИЧ-коинфицированных пациентов, не получавших противовирусной терапии.
Впервые при анализе аминокислотных последовательностей домена обратной транскриптазы изолятов ВГВ, выделенных на территории Российской Федерации, определены 2 группы мутаций: клинически значимые аминокислотные замены (M204I, A181S, ТІ841, L199W, А194Т) и замены, в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в научной литературе (Т184Р, L179S, S213F, M204L, L82P, S213Y,
L179S, V214Y). Данные мутации рассматриваются как потенциально значимые, поскольку находятся в позициях гена полимеразы, имеющих решающие значение для диагностики лекарственной устойчивости ВГВ.
Впервые при выборе метода скрининга с целью обнаружения мутаций в гене полимеразы ВГВ установлена более высокая информативность прямого секвенирования и высокая чувствительность коммерческого теста INNO-LiPA DR v2.
Впервые на основании проведенного исследования разработаны два алгоритма выявления мутаций в гене полимеразы ВГВ среди пациентов с ВГВ-инфекцией:
для проведения научных скрининговых исследований;
для оптимизации выбора аналога нуклеоз(т)идов в клинической практике с целью уменьшения прогрессирование ХГВ и предупреждения развитие тяжелых осложнений.
Практическая значимость и внедрение результатов работы
Результаты, полученные в процессе работы, позволили разработать и рекомендовать в клиническую практику алгоритм выявления мутаций в Р-гене ВГВ, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости, который позволит оптимизировать выбор противовирусного препарата (аналога нуклеоз(т)идов) у пациентов с ВГВ-инфекцией.
Данный алгоритм внедрен и активно используется в научно-исследовательской работе отдела вирусных гепатитов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН.
Проблема и методы диагностики лекарственной резистентности ВГВ к аналогам нуклеоз(т)идов среди ВГВ-инфицированных пациентов изложены в проекте методических рекомендаций Министерства здравоохранения и социального развития РФ «Выявление мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью вируса гепатита В среди пациентов с коинфекцией вируса иммунодефицита человека и вируса гепатита В».
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на международном конгрессе по вирусным гепатитам (13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (март 2009 г., Вашингтон), на конференции молодых ученых Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (апрель 2009 г., Москва), на Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (май 2009
г., Москва), на научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии» (ноябрь 2009 г., Москва).
Апробация диссертации состоялась 30 июля 2010 г. на заседании Ученого совета Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (протокол №1 от 30 июля 2010 г.).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 статьи - в реферируемых журналах ВАК.
Объем и структура диссертации
Механизм действия аналогов нуклеозидов/нуклеотидов - ИОТ
Вирусный гепатит В является одной из актуальных и важных проблем современной медицинской науки и практического здравоохранения. Это обусловлено его повсеместным распространением среди различных групп населения, многообразием клинических форм и исходов (включая цирроз печени и первичный рак печени), стабильно-высокими показателями заболеваемости. В настоящее время коло 2 млрд. человек в мире имеют маркеры ВГВ-инфекции, из них у 300-400 млн. человек инфекция протекает в хронической форме. При этом примерно 25% инфицированных по прогнозам умирает от ЦП и ГЦК [7].
ГВ - широко распространенная инфекция человека, вызываемая вирусом гепатита В (ВГВ); в клинически выраженных случаях характеризуется симптомами острого поражения печени и интоксикацией, отличается многообразием клинических проявлений и исходов заболевания [7].
ВГВ относят к семейству Hepadnaviridae, к роду Orthohepadnavirus. Основными характеристиками вирусов, составляющих это семейство, являются: с диаметром 40-48 нм (в среднем - 42 нм). Частица состоит из ядра -нуклеотида, имеющего форму икосаэдра, диаметром 28 нм, внутри которого находится двухцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза (рис.1.1.1.). Нуклеокапсид построен из молекул капсидного антигена (HBcAg).
Наружную оболочку вируса толщиной 7 нм образует поверхностный антиген - HBsAg. Синтез HBsAg происходит в цитоплазме гепатоцитов, где его меньшая часть используется для сборки ВГВ, а остальная - секретируется в межклеточное пространство и поступает в кровь. Поверхностный белок ВГВ представлен тремя формами - большой, средней и малой (L, М и S), в соотношении 1:1:4. Наличие в оболочке ВГВ большой формы поверхностного антигена (LHBsAg), содержащей Pre-S 1-белок, обеспечивает связывание вируса с гепатоцитом.
Нуклеиновая кислота ВГВ представлена двухцепочечной кольцевой молекулой ДНК, протяжённостью около 3200 п.н. Геном вируса включает в себя четыре гена: S-ген (кодирующий HBsAg), состоящий из трёх участков Pre-S 1, Pre-S2 и S; С-ген (кодирующий HBcAg), состоящий из участков Рге-С и С; Р-ген, кодирующий ДНК-полимеразу, обладающую функцией обратной транскриптазы; Х-ген, отвечающий за синтез Х-белка (рис. 1.1.2.). Высокая информативная ёмкость ДНК ВГВ обеспечивается тем, что открытые рамки считывания частично перекрывают друг друга. ДНК ВГВ способна встраиваться (интегрировать) в клеточный геном и сохраняться в нем на протяжении многих лет.
Внутри нуклеокапсида ВГВ, помимо вирусной ДНК, находится ДНК-полимераза. Этот фермент необходим для достройки одноцепочечного участка короткой цепи ДНК ВГВ внутри вирусной частицы, а также для репликации вируса в гепатоците, в ходе которой происходит образование РНК-репликативного посредника (прегенома) с одновременной транскрипцией и трансляцией.
Вирусная ДНК несет информацию о белках вируса, необходимых для его существования (HBsAg, HBcAg, HBeAg, HBxAg).
Считается, что ВГВ является одним из самых изменчивых ДНК-содержащих вирусов, частота синонимических замен в геноме ВГВ составляет 4.57 х 10"5/ сайт/ год [93]. Сложный цикл репликации ВГВ, включающий этап обратной транскрипции, обеспечивает его повышенный мутационный потенциал. Идентифицированы варианты ВГВ, имеющие мутации во всех генах вируса. В настоящее время описано более 150 мутантных вариантов ВГВ [79].
Одним из основных свойств вируса, обеспечивающего широкое распространение ВГВ, является его высокая инфекционность. Для заражения ГВ достаточно от 10 до 100 частиц вируса. Некоторые сыворотки крови с наличием ВГВ инфекционны даже в разведениях 10"7—10"8. Концентрация вирусных частиц в сыворотках крови с наличием HBsAg колеблется от 1010 частиц в 1 мл до количеств, не доступных выявлению с помощью иммунной электронной микроскопии. ВГВ удается обнаружить во всех половых секретах инфицированного человека [7]. Считают, что ВГВ в 100 раз более инфекционен, чем ВИЧ. Высокая устойчивость ВГВ к различным воздействиям внешней среды также обеспечивает широкое распространение ГВ [7].
ВГВ попадает в организм человека непосредственно в кровь (при парентеральных вмешательствах, гемотрансфузиях) или через слизистые оболочки, повреждения кожного покрова (при половых контактах, тесном бытовом контакте), вертикальной передаче, вызывая первичную вирусемию
Спектр проявлений инфекции, вызванной ВГВ, многообразен [7]. От острого гепатита (включая молниеносную, или фульминантную форму) до хронического гепатита, который может переходить в ЦП и первичный рак печени.
Наиболее частым вариантом течения является острая циклическая форма, при которой выделяют четыре периода: инкубационный, продромальный (преджелтушный), желтушный (разгар заболевания) и реконвалесценцию.
По тяжести заболевания ОГВ подразделяют на гепатит, имеющий легкое, среднетяжелое, тяжелое течение, включая и фульминантный гепатит, который в большинстве случаев заканчивается смертью больного. У взрослых и детей старшего возраста обычно острый гепатит протекает в легкой и среднетяжелой форме. В большинстве случаев ОГВ заканчивается выздоровлением.
У части больных (5-10%) заболевание может принимать затяжное или персистирующее течение. Развитие ХГВ зависит от возраста, когда произошло заражение [26,72]. При перинатальном инфицировании (особенно, если мать имеет HBeAg) ХГВ развивается в 90% случаев, в возрасте от одного до пяти лет - в 20-50%, а среди взрослых - у 5%.
Хронический гепатит В - длительное воспалительное поражение печени вызванное ВГВ, которое может переходить в более тяжелое заболевание -цирроз, оставаться без изменений или регрессировать под влиянием лечения или спонтанно. Основными критерием для причисления заболевания к ХГВ является сохранение диффузного воспаления печени более 6 месяцев [7].
В большинстве случаев ХГВ протекает бессимптомно. При хроническом гепатите с высокой активностью клинические проявления заболевания, как в периоды ремиссий, так и рецидивов, более выражены.
Активно протекающий процесс с развитием тяжелых осложнений (ЦП и ГЦК) может привести к полной потере трудоспособности. Так исследование, проведенное среди жителей о. Тайвань установило, что процент умерших от цирроза печени или первичного рака среди больных ХГВ составил от 15% до 25% [34].
В 2004-2009 гг. проявления эпидемического процесса ГВ в РФ приобрели принципиально новый качественный характер: продолжающееся снижение заболеваемости острыми формами сочеталось с увеличением регистрации клинически выраженного ХГВ. В последние годы, в том числе в связи с распространением инъекционной наркомании отмечается значительный рост ВГВ-инфекции в РФ. Так, заболеваемость хроническим ГВ за последнее десятилетие выросла вдвое (9,0 на 100 тыс. населения — 1999 г. и 14,39 на 100 тыс. населения - 2009 г.).
Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ
При изучении мутационных изменений в Р-гене ВГВ отмечено, что у больных с коинфекцей ВИЧ и ВГВ наиболее часто выявляются двойная Ы80М+М204УЯ (62,1%), тройная L173V+L180M+M204V (31%) и L173V+L180M+M204I (3,4%) мутации, тогда как частота встречаемости простых мутаций M204I и M204V ниже, чем при ВГВ - моноинфекции и составляет 3,4% и 0% соответственно [38,110].
Первичная резистентность к адефовиру ассоциирована с мутациями, локализованными в В (А181Т) и D (N236T, 1233V) сайтах домена ДНК-полимеразы [94]. Лекарственная устойчивость к адефовиру развивается менее часто, чем к ламивудину. В результате длительной терапии отмечено развитие лекарственной резистентности у 3%, 9%, 18%, 28% больных через 2, 3, 4 и 5 лет применения препарата, соответственно [104]. Резистентность к адефовиру формируется раньше у пациентов, инфицированных ламивудинрезистентными вариантами ВГВ (18-25% после 1-2 года терапии) [61].
J. Villeneuve и савтр. был описан первый случай выявления мутации N23 6Т у пациента после трансплантации печени, получавшего терапию адефовиром [112]. Известно, что сочетание мутации А181Т с V214A/Q215S обуславливает развитие кросс-резистентности к ламивудину [27,55]. Мутация 1233V была идентифицирована сравнительно недавно. При проведении клинических исследований было показано, что мутация 1233V в Р-гене ВГВ выявляется приблизительно у 2%, N236T и A181V - у 5,9% пациентов с ВГВ-инфекцией на 2 году лечения адефовиром.
В многочисленных работах подчеркивается, что резистентность к энтекавиру наблюдается у пациентов, у которых определяется присутствие лекарственной устойчивости к ламивудину [77]. Мутации, ассоциированные с появлением резистентности к энтекавиру, локализованы в В-сайте (T184S/A/I/L), С-сайте (S202G/C) и Е-сайте (M250I/V) домена ДНК-полимеразы [77]. Энтекавир обладает высоким «генетическим барьером» к развитию резистентности ВГВ, поэтому для формирования устойчивости к нему необходимо появление трех последовательных мутаций, две из которых являются ассоциированными с терапией ламивудином (M204V и L180M). Показано, что при применении энтекавира в виде монотерапии частота развития лекарственной устойчивости ВГВ на 4 году лечения составляет менее 1%. В основном резистентность к энтекавиру наблюдается при лечении больных с исходной резистентностью к ламивудину и составляет 6%, 19% и 40% после 1, 3 и 4 лет терапии, соответственно [61].
Мутации, ассоциированные с развитием лекарственной устойчивости к телбивудину, локализуются в тех же участках Р-гена ВГВ, что и мутации, связанные с резистентностью к ламивудину и адефовиру, что обуславливает развитие явления перекрестной устойчивости при терапии данными препаратами (L80V7I, L180M, M204I и А181Т). Частота развития вторичной лекарственной устойчивости при терапии телбивудином составляет 0% и 1% на 1 и 2 году терапии, соответственно у HBeAg-позитивных пациентов и 0% - у HBeAg-негативных пациентов на 2 году лечения [42].
Известно, что тенофовир активен в отношении как ВИЧ, так и ВГВ и эффективен при терапии коинфицированых пациентов [97]. Возможная резистентность к тенофовиру была описана сравнительно недавно и связана с мутациями, локализованными в В - и С- сайтах домена ДНК-полимеразы ВГВ (А194Т, L180M, M204V). Исследования, проведенные G. Schmutz с соавт., показывают, что данные мутации наиболее часто выявляются среди ВГВ/ВИЧ - коинфицированных пациентов, получавших терапию тенофовиром [30]. Имеется ограниченное количество публикаций по частоте развития лекарственной устойчивости ВГВ на фоне терапии тенофовиром. Установлено, что на первом и втором году лечения тенофовиром появление мутантных вариантов ВГВ в результате селекционного «давления» препарата не наблюдается (частота развития лекарственной устойчивости к тенофовиру составляет 0%).
1.6. Взаимное влияние мутаций в Р-гене и S-гене ВГВ Геном ВГВ устроен таким образом, что ORF Р-гена перекрывается с ORF S-гена. Вследствие этого, мутации гена полимеразы, ассоциированные с развитием лекарственной устойчивости, могут напрямую влиять на естественную природу HBsAg и его функции, вызывая сопутствующие изменения . в аминокислотной последовательности S-гена [70,123]. В результате таких аминокислотных замен может изменяться структура «а»-детерминанты HBsAg, которая представляет собой основную мишень для вакцины против ВГВ. Такие мутации, во-первых, могут являться причиной инфицирования ВГВ несмотря на наличие анти-HBs после вакцинации против "дикого" типа ВГВ; во-вторых, наличие аминокислотных замен в поверхностном белке ВГВ может стать причиной «ускользания» HBsAg от детекции иммуноферментными тест-системами. Основные мутации в Р-гене, обуславливающие понижение восприимчивости ВГВ к ламивудину, адефовиру, энтекавиру и телбивудину, могут быть связаны с изменениями в С-терминальном регионе HBsAg [80,98]. Наиболее частой причиной одновременного появления мутаций в Р-и S-гене ВГВ является длительная терапия ламивудином [64,105]. Показано, что мутация M204V в Р-гене, ассоциированная с резистентностью к ламивудину, сопровождается появлением мутации I195M+E164D в S-гене, мутация M204I, ассоциированная развитием резистентности к ламивудину и телбивудину, приводит к появлению мутаций W196S или W196L в поверхностном белке ВГВ [45,52,91,107].
Согласно данным ряда исследований, установлено прямое влияние мутаций Р-гена (в первую очередь связанных с ламивудиновой резистентностью) на антигенные свойства HBsAg. V. Chaudhuri с соавт. установили, что делеция в промотере поверхностного белка и мутации в YMDD-локусе полимеразы ВГВ являются наиболее распространенными причинами развития скрытого HbsAg-негативного гепатита В [20]. Один из наиболее распространенных вариантов ВГВ, несущих тройную мутацию V173L+L180M+M204V в гене полимеразы ВГВ, которая появляется как результат селекционного отбора при терапии ламивудином, приводит к изменению антигенных свойств HBsAg. Установлено, что указанная тройная мутация вызывает 2 аминокислотные замены в перекрывающемся S-гене (E164D+I195M), которые, в свою очередь, способствуют ослаблению связывание анти-HBs с HBsAg.
Серологические маркеры ВГВ-инфекции
Сопоставление результатов, полученных в тестах INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping и методом прямого секвенирования, проводили для образцов сывороток крови, полученных от пациентов с диагностированным ХГВ как леченных аналогами нуклеоз(т)идов (п=1), так и не получавших ПВТ (п=38). Все образцы сывороток крови, полученные от данных пациентов, тестировали однократно, параллельно в тестах INNO-LiPA HBV DR v2, INNO-LiPA HBV genotyping и методом прямого секвенирования.
Методы статического анализа результатов исследований Полученные в работе результаты подвергали статистической обработке по общепринятым методикам с использованием вариационной статистики с помощью стандартной программы EXCEL 2003 и программы статистической обработки данных GraphPadPism 4. Статистическая обработка данных включала: определение средних величин показателей (М); вычисление значений квадратичного отклонения (SD); выявление достоверности различий средних значений показателей в сравниваемых группах с использованием t-критерия Стьюдента, критерия Фишера и х2-квадрата с поправкой Йетса (различия оценивались как достоверные при вероятности 95%-р 0,05).
С целью выявления мутантных вариантов ВГВ, устойчивых к терапии аналогами нуклеоз(т)идов, в исследование были включены пациенты с ВГВ-моноинфекцией из регионов РФ, различающихся уровнями заболеваемости ГВ, т.е. территорий с разной интенсивностью циркуляции ВГВ. На основании данных о заболеваемости ОГВ и ХГВ, предоставленных ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в качестве регионов с низкой интенсивностью циркуляции ВГВ была выбрана Московская область, со средней — Саратовская область и Тамбовская область и с высокой -Республика Тыва и Республика Саха (Якутия). Заболеваемость ОГВ и ХГВ в изучаемых регионах РФ за 2009 год представлена в табл. 3.1.1.
Республика Тыва 4,16 32,61 При обследовании 459 пациентов с ВГВ-моноинфекцией HBsAg был выявлен в 95,2% (437/459) случаях, положительный результат по определению анти-НВс был получен в 100% случаях. ДНК ВГВ выявлена у 241 пациента, имевших анти-НВс и HBsAg с ВГВ-моноинфекцией. Полученные результаты позволили сформировать окончательную группу пациентов с репликацией ВГВ для изучения распространенности первичной лекарственной устойчивости ВГВ — 241 пациент с моноинфекцией ВГВ, ранее не получавших терапии аналогами нуклеоз(т)идов (табл. 3.1.2.).
Прямое секвенирование фрагмента генома ВГВ величиной 713 п.н., соответствующего перекрывающимся участкам генов S и Р ВГВ, позволило определить генотип ВГВ и аминокислотную последовательность домена обратной транскриптазы фермента полимеразы ВГВ для всех изолятов вируса, выделенных от пациентов с ВГВ-моноинфекцией. Распределение генотипов ВГВ среди ВГВ-моноинфицированных пациентов было следующим: генотип D был выявлен у 89,6% пациентов (216/241), генотип А - у 8,3% (20/241) и генотип С - у 2,1% (5/241).
Генотип D (89,6%) Рис. 3.1.2. Генотипическое разнообразие ВГВ в РФ При анализе аминокислотных последовательностей гена полимераза ВГВ были выявлены 2 группы мутаций: значимые аминокислотные замены (мутации, описанные в литературе как обуславливающие развитие лекарственной устойчивости к терапии нуклеоз(т)идными аналогами) и замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но не описанные еще в литературе. Данные мутации рассматриваются как потенциально значимые, поскольку находятся в позициях Р-гена ВГВ, имеющих решающие значение для диагностики лекарственной устойчивости.
У 7 (2,9%) из 241 обследованных пациентов с ВГВ-моноинфекцией в геноме вируса были выявлены значимые аминокислотные замены и у 8 (3,3%) - потенциально значимые. Общая частота выявления мутаций ВГВ, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью, в данной когорте пациентов составила 6,2% (15/241). Ни в одном случае в данной группе пациентов нами не была выявлена аминокислотная замена в YMDD-мотиве ВГВ, являющаяся наиболее распространенной по данным литературы и связанная с развитием устойчивости к широкому спектру ИОТ (ламивудин, энтекавир, телбивудин и тенофовир). Однако при анализе нуклеотидных последовательностей гена полимеразы ВГВ среди ВГВ-моноинфицированных пациентов были выявлены мутации, связанные с развитием первичной лекарственной резистентности к другим аналогам нуклеоз(т)идов. Спектр данных аминокислотных замен и частота их выявления показана в табл. 3.1.3.
Таким образом, в геноме ВГВ от 2 (0,8%) пациентов была выявлена замена в положении 181 (A181S), связанная с устойчивостью к адефовиру, у 4 (1,7%) пациентов - замена в положении 184 (ТІ 841), связанная с невосприимчивостью ВГВ к энтекавиру и у 1 (0,4%) пациента - замена в положении 199 (L199W), ассоциированная с развитием резистентности к телбивудину.
Эпидемиологическая, вирусологическая и клинико-биохимическая характеристика пациентов с наличием и отсутствием первичной лекарственной резистентности ВГВ
Известно, что в геноме ВГВ часть Р-гена, кодирующая обратную транскриптазу, перекрывается с ORF S-гена. Вследствие этого, мутации гена полимеразы, ассоциированные с развитием лекарственной устойчивости ВГВ, могут вызывать изменения в последовательности S-гена, и, как следствие, приводить к конформационным изменениям в структуре HBsAg «дикого» варианта ВГВ и его функции.
Параллельно с анализом нуклеотидной последовательности Р-гена ВГВ нами была проанализирована последовательность перекрывающегося участка S-гена. Из 32 выделенных в Республике Тыва изолятов ВГВ у 10 в S-гене были выявлены несинонимические замены (табл. 4.1.).
Наиболее частой причиной одновременного появления мутаций в гене полимеразы и поверхностном гене ВГВ является длительная терапия ламивудином [47,105]. Из литературных данных известно, что замена метионина на изолейцин в положении 204 YMDD-мотива (M204I), ассоциированная с развитием резистентности к ламивудину и телбивудину, сопровождается появлением аминокислотных замен W196S или W196L в поверхностном белке [60-63].
В наших наблюдениях наличие М204І-мутации в гене полимеразы ВГВ сопровождалось присутствием в S-гене аминокислотной замены G185A, ассоциированной, по литературным данным, с «иммунным бегством» ВГВ при применении иммуноглобулинов с профилактической целью в отношении ВГВ-инфекции [63].
В остальных 9 случаях выявленные замены в S-белке не сопровождались появлением каких-либо изменений в гене полимеразы ВГВ, ассоциированных с лекарственной резистентностью.
В одном случае (1/32; 3,1%) в S-гене определена значимая мутация -Y206S, которая описана как продукт селективного отбора при применении иммуноглобулинов [62]. В 2 (6,3%) случаях в положении 206 S-гена, впервые выявлена другая замена, не описанная в литературе (Y206C), но локализованная в том же положении, что и значимая замена. По-видимому, ее следует отнести к категории потенциально значимых мутаций. Циркуляция ВГВ с наличием такой замены в популяции, возможно, обусловлена результатом применения иммуноглобулинов. Так как в наших наблюдениях в одном из образцов сывороток крови наличие мутации Y206C сопровождалось отсутствием HBsAg (чувствительность тест-системы 0,01 нг/мл), можно предполагать, что данная замена может быть одной из причин «ускользания» HBsAg от детекции тест-системами иммуноферментного анализа. Однако другой образец с этой заменой был положительным по HBsAg, поэтому связать исключитльно с этой мутацией в S-гене и развитием скрытой ВГВ-инфекции не представляется возможным.
Еще в одном случае при изучении аминокислотной последовательности в S-гене в положении 145 определена замена глицина на серии. В литературе известна наиболее часто встречаемая мутация - замена глицина на аргинин в 145 аминокислотной позиции региона «а»-детерминанты S-гена ВГВ (G145R), обозначаемая как мутация «вакцинного бегства». Поэтому можно предположить, что найденная замена также вероятно будет являться причиной неэффективности вакцинации в отношении ВГВ, поскольку данная мутация локализована в том же положении, что и значимая.
Одновременно при изучении нуклеотидной последовательности Р-гена изолятов ВГВ, выделенных от больных ХГВ была проанализирована последовательность S-гена ВГВ (табл.4.2.).
В некоторых образцах были обнаружены аминокислотные замены в S-гене за пределами «а»-детерминанты. В 6 образцах была выявлена замена в позиции 118 - треонин на аланин (Т118А), по данным W. Carman с соавт., связанная с изменением антигенных свойств HBsAg, что было подтверждено изучением in vitro связывающих свойств антигена/антител [19]. Однако анализ последовательностей S-гена ВГВ, выделенных от лиц, положительных по HBsAg, показал относительно широкое распространение данной мутации. Очевидно, что на чувствительность современных тест-систем для выявления HBsAg данная мутация влияния не оказывает.
В двух образцах были определены 2 аминокислотные замены (M133L, Р120Т) в поверхностном гене генома ВГВ, которые по данным литературы, связаны с «ускользанием» HBsAg от детекции иммуноферментными тест-системами.
Мутантные варианты ВГВ, несущие эти замены, в настоящее время входят в состав панелей для контроля аналитической и диагностической чувствительности современных тест-систем для выявления HBsAg. В нашем исследовании данные аминокислотные замены в поверхностном белке сочетались с мутациями в полимеразе ВГВ (V142E, T128N), что подтверждает взаимное влияние обеих рамок считывания генома ВГВ. Но с другой стороны, выявленные замены в Р-гене не связаны с возможным развитием лекарственной резистентности, так как в литературе нет данных о связи применения ИОТ и развитием данных изменений в гене полимеразы ВГВ.
В остальных случаях выявленные замены в S-гене также не сопровождались появлением каких-либо изменений в гене полимеразы ВГВ, связанных с развитием лекарственной резистентности к противовирусным препаратам.
Анализ частоты выявления первичной лекарственной резистентности в зависимости от генотипа ВГВ показал, что все случаи выявления лекарственно-устойчивых вариантов ВГВ были ассоциированы с генотипом D, как наиболее распространенным генотипом ВГВ, циркулирующим на территории РФ. Все выявленные в данном исследовании варианты ВГВ, относящиеся к генотипам А и С относились к «дикому типу» ВГВ. Сравнение частоты выявления мутаций в Р-гене с частотой определения аминокислотных замен в S-гене не выявил статистически значимой зависимости (табл. 4.3.).
