Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин Романова, Юлия Романовна

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Многообразие вирусов гриппа - генетически детерминированный признак. Сегментированная организация генома вируса гриппа, состоящего из (-)РНК, способствует обмену генетической информацией между штаммами при смешанной инфекции за счет реассортации. Отсутствие корректирующей активности у вирусной полимеразы приводит к высокой частоте мутаций в генах вируса гриппа, ответственных за регулярное появление вариантов с новыми антигенными свойствами.

В 1997 году птичий вирус подтипа A(H5N1), не изменяя рецепторную специфичность, инфицировал 18 человек, 6 из них со смертельным исходом (Matrosovich et al., 1999). Вирусы гриппа птиц обычно не инфицируют людей, так как существует межвидовой барьер, обусловленный различной специфичностью рецепторов, присутствующих на поверхности восприимчивых клеток. Рецепторы отличаются по химической структуре и пространственной конфигурации. Однако, при определенных обстоятельствах вирус может преодолеть межвидовой барьер. Описанные случаи заражения, в основном, происходили при близком контакте с инфицированными птицами, что обеспечивало высокую заражающую дозу вируса. Хотя у людей полностью отсутствует иммунитет к вирусу подтипа A(H5N1), трансмиссибильность вируса оказалась очень низкой и до настоящего времени не привела к его широкому распространению среди людей (Katz et al., 1999). Случаи передачи вирусов от человека к человеку отмечались только при тесном контакте с больными, а эффективное распространение вируса от человека к человеку так и не было зафиксировано (Tran et al., 2004; Ungchusak et al., 2005). Однако, высокая патогенность этих штаммов и беспрецедентное распространение среди птиц создали опасность возникновения нового пандемического штамма. Эта угроза вызывает необходимость усовершенствования существующих противогриппозных вакцин и противовирусных препаратов.

Для предотвращения пандемии вируса A(H5N1) с помощью существующих инактивированных вакцин необходимо сначала определить доминирующий пандемический штамм и затем произвести вакцину в количестве, необходимом для вакцинации всего населения. Инактивированная вакцина не может быть произведена заранее, поскольку в случае несовпадения вакцинного и пандемического штаммов по антигенным свойствам защита не будет эффективной. Следующая сложность связана с патогенностью данного вируса для куриных эмбрионов - основного субстрата для производства современных вакцин.

Суммируя результаты проведенных клинических испытаний с вакцинами против вирусов гриппа сероподтипа H5N1, можно заключить, что инактивированные вакцины оказались недостаточно иммуногенны. Одна стандартная иммунизация, содержащая 15 мкг НА не вызывала у вакцинируемых защитный титр антител. Только двукратная иммунизация с двойным количеством антигена обеспечивала у привитых протективный иммунитет. При такой эффективности в случае пандемии потребуется в 4 раза больше вакцины, чем обычно и, следовательно, больше времени для ее производства и полноценной защиты населения. Повышение эффективности инактивированных вакцин было показано также при использовании адъювантов (Keitel et al., 2008; Nolan et al., 2008).

Альтернативой куриным эмбрионам для производства вирусной массы являются тканевые культуры. Такое производство независимо от поставщиков эмбрионов и может быть начато в любой момент, как только готов вакцинный штамм. Кроме того, вакцинный штамм, культивируемый на клетках млекопитающих может вызывать выработку антител, обладающих большей перекрестной реактивностью и обеспечивающих лучшую защиту, чем штаммы, выращенные на эмбрионах (Alymova et al., 1998). Две клеточные линии, а именно, MDCK и Vero уже лицензированы в отдельных странах для производства инактивированных гриппозных вакцин.

Вакцинация живыми вакцинами, в отличие от инактивированных, вызывает более длительную и кроссреактивную защиту (Belshe et al., 2000; Liang et al., 1994; Meitin, Bender, and Small, 1991). Кроме того, живая вакцина также эффективна при вакцинации детей уже после однократной иммунизации (Александрова Г.И., Климов А.И., 1994); (Ashkenazi et al., 2006; Jefferson et al., 2008; Vesikari et al., 2006). Эти преимущества обеспечивают возможность значительно быстрее защитить население в случае пандемии с помощью живых вакцин. Существенным недостатком живых вакцин является длительная репродукция отдельных вакцинных штаммов в респираторном тракте людей, которая может привести к нежелательному распространению вакцинного вируса или его генетического материала в популяции людей. Кроме того, аттенуированные вакцины могут быть реактогенны для детей раннего возраста (Belshe et al., 2007).

Результаты испытаний живых холодоадаптированных вакцин, приготовленных из вирусов гриппа сероподтипа Н5, дали противоречивые результаты. Вакцинные кандидаты, полученные на основе донора A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) (США), содержащие поверхностные антигены от вирусов сероподтипа (H5N1) A/Vietnam/1203/04 или A/Hong Kong/213/03 почти не репродуцировались в респираторном тракте привитых и вызывали очень слабый иммунный ответ (Karron et al., 2009). Холодоадаптированная вакцина, приготовленная на основе донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Россия), содержащая НА низкопатогенного для птиц штамма A/duck/Potsdam/86/92 (H5N2), интенсивно реплицировалась в верхнем отделе респираторного тракта привитых и вызывала прирост антител у 31% вакцинируемых (Desheva et al., 2006; Rudenko et al., 2008). Причины таких различий до настоящего момента не выяснены.

В данной работе был использован новый подход к созданию живой аттенуированной вакцины, объединяющий сильные стороны живого и инактивированного препаратов. Этот метод основан на создании аттенуированных штаммов, дефектных по репродукции в ИФН компетентных клетках, за счет удаления неструктурного белка вируса гриппа NS1 (Egorov et al., 1998). Белок NS1 - один из факторов патогенности вируса гриппа, ответственный за подавление врожденного иммунитета хозяина и позволяющий вирусу гриппа успешно реплицироваться на фоне подавленной системы ИФНов (Fernandez-Sesma, 2007; Krug et al., 2003). Эта функция NS1 белка необходима в первые часы инфекции и поэтому определяет ранний и обильный его синтез (Krug et al., 2003). Удаление белка NS1 или повреждение его функции ведет к абортивной репликации вируса из- за индукции и активации широкого круга противовирусных белков, таких как PKR и OAS, ведущих к формированию противовирусного статуса в инфицированной и соседних клетках (Egorov et al., 1998; Ferko et al., 2004; Garcia-Sastre and Biron, 2006). Такой вирус не способен противостоять реакции врожденного иммунитета вакцинируемого. Врожденный иммунитет активируется почти немедленно после инфицирования и предотвращает дальнейшее распространение инфекции в организме. Этот механизм включает активацию фагоцитов, дендритных клеток и макрофагов, а также инициацию провоспалительного ответа за счет выделения широкого спектра цитокинов, хемокинов и других антимикробных факторов (Takeuchi and Akira, 2008; Vercammen, Staal, and Beyaert, 2008). Таким образом, иммунизацию вирусами с удаленным NS1 белком (ANS1 вирусы) можно сравнить с иммунизацией вирусоподобными частицами (Bright et al., 2008). В то же время ANS1 мутантные врусы инфекционны для клеток верхнего отдела респираторного тракта и могут индуцировать белковые синтезы и презентацию вирусных антигенов аналогично живой аттенуированной вакцине (Ferko et al., 2004).

Эффективность интраназальной живой вакцины в значительной степени зависит от того, как вакцинный вирус инфицирует клетки верхнего респираторного тракта. Известно, что вирусы гриппа человека предпочтительнее прикрепляются к клеткам реснитчатого эпителия в трахее, бронхах и бронхеолях, тогда как H5N1 вирусы гриппа птиц предпочитают клетки нижнего респираторного тракта, а именно альвеолы. Этот феномен связан с повышенной афинностью Н5 НА к рецепторам типа Sia2-3Gal, доминирующим на поверхности клеток нижнего респираторного тракта, а не к Sia2-6Gal, преобладающим в трахее человека (Shinya et al., 2006; Suzuki, 2005). Однако, несмотря на эти различия, вирусы серотипа H5N1 способны инфицировать ex vivo культуры, полученные из аденоидных, назофарингеальных и тонзиллярных тканей (Nicholls et al., 2007). Эти данные согласуются с фактом активной репродукции в верхнем отделе респираторного тракта людей вакцинного штамма, содержащего НА вируса гриппа птиц A/duck/Potsdam/86/92 (H5N2) (Desheva et al., 2006; Rudenko et al., 2008). Поэтому, рецепторная специфичность НА вируса гриппа, по-видимому, не единственный фактор, ограничивающий низкую инфекционность вирусов гриппа птиц для людей.

Поверхность эпителиальных клеток дыхательных путей человека представляет существенный барьер для вирусной инфекции. Этот барьер включает мукозную систему очистки клеток, вязкий мукозный слой и макрофаги, которые предотвращают доступ вируса к клеткам. Кроме того, клетки дыхательных путей в ответ на воспаление или раздражение начинают выделять протоны, что может привести к снижению кислотности носовой полости человека до pH 5,2 (England et al., 1999; Hehar et al., 1999; McShane et al., 2003; Washington et al., 2000). Известно, что кислый pH, нагревание и химические денатуранты вызывают одно и то же необратимое конформационное изменение НА, аналогичное тому, которое происходит в эндосомах и вызывает слияние вирусной и эндосомальной мембран (Carr, Chaudhry, and Kim, 1997). Если данное конформационное изменение происходит до попадания вируса в эндосомы, то вирус теряет инфекционность. Поэтому, чтобы преодолеть мукозный барьер, НА вируса гриппа должен обладать определенной стабильностью в отношении упомянутых инактивирующих факторов.

Вирусы гриппа человека и низкопатогенные вирусы гриппа птиц относительно устойчивы к кислому pH, поскольку пограничное рН конформационного изменения НА этих вирусов лежит в интервале 5,1 - 5,4 (Skehel and Wiley, 2000). НА высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц изменяет конформацию при более высоких значениях pH, а именно 5,6 - 6,0, поэтому эти вирусы менее стабильны (Scholtissek, 1985). Показано, что путем введения мутаций в НА высокопатогенного вируса птиц с помощью сайт индуцированного мутагенеза можно снизить pH активации НА и повысить стабильность этого вируса к факторам окружающей среды (Reed et al., 2009a). Эта модификация приводила к снижению вирулентности и трансмиссибильности вируса для диких водоплавающих уток. Мы предположили, что низкая инфекционность высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих и, как следствие, низкая эффективность живых аттенуированных вакцин, полученных на их основе, обусловленна высоким пограничным рН активации НА, приводящим к низкой стабильности НА этих вирусов.

Цель работы: выявление генетических детерминант инфекционности вируса гриппа для млекопитающих и иммуногенности противогриппозных вакцин; поиск путей повышения прививочных свойств кандидатов в вакцинные штаммы живой интраназальной вакцины на модели вирусов, аттенуированных за счет удаления NS1 гена.

Задачи исследования:

1. Получение вакцинного кандидата, аттенуированного путем модификации NS гена и содержащего поверхностные антигены высокопатогенного штамма вируса гриппа птиц сероподтипа А(Н5^) методом обратной генетики.

2. Разработка условий культивирования полученного вакцинного кандидата в тканевой культуре Vero.

3. Изучение безвредности, иммуногенности и защитных свойств вакцинного кандидата в доклинических исследованиях на цыплятах, мышах, хорьках и обезьянах.

4. Введение мутации в ген НА высокопатогенного штамма вируса гриппа H5N1, снижающей пограничное рН конформационного изменения белка НА и получение вакцинного кандидата, содержащего мутантный НА, методом обратной генетики.

5. Изучение свойств вакцинного кандидата, содержащего введенную мутацию, in vitro и инфекционности, иммуногенности и протективной эффективности in vivo на мышиной модели.

6. Изучение роли мутаций, возникающих в НА вирусов гриппа человека при пассировании в тканевой культуре Vero, на стабильность вирусов к повышенной температуре и кислому рН и иммуногенность вакцинных кандидатов для хорьков.

7. Поиск путей предотвращения появления адаптационных мутаций за счет изменения условий культивирования вирусов в тканевой культуре Vero.

8. Изучение влияния адаптационных мутаций, снижающих стабильность вирусов, на урожайность и иммуногенность инактивированных противогриппозных вакцин.

Научная новизна.

В работе впервые показано, что инфекционность и иммуногенность вирусов гриппа для млекопитающих определяется пограничным значением рН при котором происходит конформационное изменение основного поверхностного белка вируса гриппа - НА. Впервые продемонстрировано, что высокое значение рН активации НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц является причиной их ^иженной инфекционности для млекопитающих. А введение мутации в НА2 субъединицу высокопатогенного вируса гриппа сероподтипа H5N1 птиц приводит к повышению его ифекционности для млекопитающих. Впервые обнаружено, что мутации, возникающие при адаптации штаммов вируса гриппа человека к росту в тканевых культурах, приводящие к снижению стабильности НА вирусов к кислой среде и повышенной температуре, ведут к снижению иммуногенности живых интраназальных вакцин. Впервые предложены условия культивирования штаммов вируса гриппа человека в тканевой культуре, позволяющие предотвратить появление дестабилизирующих адаптационных мутаций. Впервые показано, что применение данных условий при культивировании вирусов гриппа человека в тканевых культурах позволяет повысить урожайность инактивированных противогриппозных вакцин.

Теоретическая значимость проведенных исследований.

Полученные результаты имеют фундаментальное значение, поскольку впервые демонстрируют, что инфекционность штаммов вируса гриппа для млекопитающих, а следовательно и эффективность полученных на основе этих штаммов живых вакцин определяется пограничным значением рН, при котором происходит конформационное изменение НА вируса гриппа, ответственное за слияние вирусной и эндосомальной мембран. Показана возможность аттенуации высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц сероподтипа H5N1 путем удаления NS1 гена в сочетании с модификацией сайта расщепления HA с целью создания вакцин нового типа, а именно, живых интраназальных не реплицирующихся в верхнем отделе респираторного тракта вакцинируемых. Установлена роль мутаций, возникающих в НА при культивировании вирусов в тканевых культурах и снижающих иммуногенность вакцинных штаммов живых противогриппозных вакцин.

Практическая значимость работы.

Разработаны новые условия культивирования вакцинных кандидатов в тканевой культуре Vero, позволяющие предотвратить появление адаптационных дестабилизирующих мутаций в НА, что сохраняет инфекционность исходных штаммов вируса гриппа человека и повышает иммуногенность полученных на их основе вакцинных штаммов живых вакцин для интраназального применения. Получен высоко иммуногенный вакцинный штамм для живой противогриппозной вакцины, инициирующий кроссреактивную защиту. Полученные результаты послужили основой для проведения клинических испытаний вакцинного штамма сероподтипа А(Н5М).

Применение новых условий культивирования при производстве вирусной массы для инактивированных вакцин приводит к повышению эффективности производства.

Положения, выносимые на защиту.

8. 1. Удаление гена, кодирующего NS1 белок вируса гриппа сероподтипа H5N1 в комбинации с модификацией сайта расщепления НА - эффективный метод аттенуации высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц.

   2. Интраназальная иммунизация ANS1 вакцинным кандидатом сероподтипа H5N1 вызывает кроссреактивный и протективный иммунитет при отсутствии вирусной репродукции.

   3. Высокий уровень рН активации НА (5,8 - 6,0) высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц сероподтипа H5N1 - главный фактор низкой инфекционности и иммуногенности этих вирусов для млекопитающих.

   4. Адаптация сезонных штаммов вируса гриппа человека к росту в тканевых культурах при стандартных условиях приводит к появлению дестабилизирующих мутаций в НА, вызывающих снижение иммуногености полученных на их основе вакцинных штаммов живых интраназальных вакцин.

   5. Культивирование вирусов в тканевой культуре при пониженной кислотности среды предотвращает появление адаптационных мутаций в НА вируса гриппа и позволяет улучшить урожайность и иммуногенность производимых по данной технологии вакцинных штаммов для живых и инактивированных вакцин.

   Внедрение результатов работы.

   По теме работы получен один международный патент US 7,494,659B2 «Live attenuated influenza vaccine» и подана одна заявка на международный патент US 2010/0172934 A1 «Method for production of pH stable enveloped viruses». В данной работе методом обратной генетики впервые получен вакцинный штамм, содержащий поверхностные антигены высокопатогенного штамма вируса гриппа сероподтипа H5N1, аттенуированный путем модификации NS гена. Аттенуация полученного вакцинного штамма показана на цыплятах и трех видах лабораторных животных, а именно: мышах, хорьках и приматах (macaca mulatta). Изучены иммуногенные свойства полученного вакцинного кандидата в доклинических исследованиях. Полученные данные создали базу для проведения клинических испытаний Л NS вакцин на людях.

   Апробация работы.

   Результаты диссертационной работы докладывались на Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Бангкок, Тайланд, 2007), Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Париж, 2007), 6-й Международной конференции „Options for influenza control and prevention" (Торонто, Канада, 2007; Гонконг, 2010), Международной конференции „Negative Strand Viruses" (Берген, Бельгия, 2010), Конференции ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, Швейцария, 2008), Конференции ВОЗ «Вакцины, вызывающие иммунитет широкого спектра» (Женева, Швейцария, 2011).

   Личный вклад автора.

   Гипотеза, о роли стабильности НА для инфекционности и иммуногенности штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих, проверка которой явилась предметом данного исследования, принадлежит автору. Работа по получению всех рекомбинантных вирусов и изучению их свойств in vitro проводилась в группе, под руководством и с участием автора. Эксперименты на животных были спланированы с участием автора и проводились в лабораториях, имеющих условия для работы с соответствующими животными, а именно: опыты на цыплятах проводились в Клинике Птиц (Вена, Ветеринарный университет); исследования на мышах осуществлялись в Институте Гриппа (Ст.Петербург) и в Ветеринарном Университете (Вена, Австрия); опыты на хорьках и приматах проводились в Компаниях «Biotest» (Коноровицы, Чешская Республика) и «Retroscreen» (Лондон, Англия). Все полученные от животных пробы анализировались в лаборатории, руководимой автором. Изучение вирусов методом атомно силовой микроскопии проводилось в сотрудничестве с Институтом Физической Химии и Биохимии (Москва, Россия) и Институтом Биофизики (Линц, Австрия). Все материалы, представленные в диссертационной работе обобщены и проанализированы автором лично.

   Вирусы. Эпидемические вирусы гриппа человека A/Solomon Island/3/06 (H1N1) (SL/03/06), A/Brisbane/59/07 (H1N1) (BN/59/07), A/Uruguay/716/07 (H3N2) и реассортант NYMC X-161B (реассортант вируса A/Wisconsin/67/05, H3N2) были получены из Национального института Биологических Стандартов и Контроля (NIBSC, Англия). Первичные изоляты A/Vienna/25/07 (H3N2) (VI/25/07) (MDCK), A/Vienna/28/06 (MDCK) были получены из Австрийского национального Центра по Гриппу (Вена). Изолят A/Thueringen/2202/08 H3N2 (MDCK) получен из Герман^ого Национального центра по Гриппу (Берлин). Изолят A/Ст.Петербург/14/10 H1N1v (SP/14/10) был выделен в Институте Гриппа на MDCK (Ст.Петербург, Россия). Яичные вирусы накапливали в аллантоисной полости 9 -11 дневных куриных эмбрионов при 37C. Тканевые изоляты пассировали на клетках MDCK в бессывороточной среде Opti-pro с добавлением 5 мкг/мл свиного трипсина (Sigma) при 37C и 5% CO₂. Работа с высокопатогенными H5N1 вирусами гриппа птиц A/Vietnam/1203/04 ^VN/1203/04) и A/Thailand/01/04 (TH/01/04) проводилась в Институте Медицинской вирусологии Университета им.Гете (Франкфурт, Германия). Вирусы пассировали на культуре клеток MDCK в лаборатории 3-го уровня биологической безопасности.

   Тканевые культуры. Тканевая культура Vero, полученная из Европейской коллекции клеточных культур была адаптирована к росту в бессывороточной среде Opti-pro (Invitrogen). Культура клеток культивировалась при 37С и 5% CO2 с добавлением 4 мM L-глютамина (Invitrogen). Тканевая культура MDCK культивировалась также при 37C и 5% CO2 в среде DMEM (Invitrogen), содержащей 2% сыворотки новорожденного теленка (FBS, Invitrogen) и 2 мM L-глютамина. Конструирование вирусов методом обратной генетики. Все рекомбинантные вирусы, использованные в работе, были получены методом обратной генетики. Вакцинный кандидат H5N1 был получен как 5:3 реассортант, в котором HA, NA и M гены унаследованы от вируса гриппа A/VN/1203/04 (H5N1), а все остальные гены от вакцинного штамма для инактивированной вакцины IVR-116, адаптированного к Vero. H5N1 сегменты HA (No. AY818135), NA (No. AY818141) и M (No. AY818144) вируса A/VN/1203/04 были синтезированы согласно сиквенсу, опубликованному в GenBank. Сайт расщепления HA высоко патогенного штамма был заменен на трипсин зависимый сайт. Синтезированные сегменты были клонированы в бинаправленные плазмиды pHW2006, включая сиквенс промоторов Pol I и Pol II и сигнал полиаденилирования для трансляции и транскрипции генов вируса гриппа согласно Hoffmann с соавторами (Hoffmann et al., 2000). В результате были получены плазмиды, кодирующие все гены. Структура плазмид показана на Рис.1. Открытая рамка считывания NS1 гена была удалена, как описано ранее (Garcia-Sastre et al., 1998). Вирусы получали трансфекцией плазмид в клетках Vero, используя нуклеофектаминовую технологию согласно инструкции производителя (Amaxa). Через 72 ч супернатанты собирали и использовали для следующего пассажа. Полученный вакцинный кандидат H5N1, содержащий поверхностные антигены вируса гриппа A/VN/1203/04 в комбинации с удаленным NS1 геном был назван VN1203ANS1. Аналогично были получены плазмиды, содержащие гены, кодирующие белки НА и NA вирусов A/Indonesia/05/05 и A/Hong Kong/213/03. Этим же методом были сконструированы 6:2 реассортанты с функциональным NS1 геном, названные соответственно VN1203, IND05, HK213 и использованные в работе для изучения защищенности на животных.

   PMV/ Пппуптрп Г Терминатор pol I

   Ген вируса гриппа

   Сигнал полиаденилирования

   Рис.1 Карта плазмид, содержащих вирусные фрагменты.

   Аналогично VN1203ANS1 был сконструирован вирус VN1203ANS1-K58I, отличающийся от предыдущего одиночной мутацией в субъединице HA2 58K—^I₁ введенной путем сайт индуцированного мутагенеза (Stratagene). Кроме того, была получена пара вирусов VN1203wtNS и VN1203wtNS-K58I (5:3 реассортанты), содержащих HA с модифицированным сайтом расщепления в комбинации с полноразмерным NS геном и отличающихся только наличием мутации HA2 58K—I. Для изучения защитных свойств вакцинного кандидата на хорьках путем пассирования реассортанта IND05 через легкие хорьков был получен вирус IND05_FA. Дополнительных мутаций в гене HA этого вируса не было обнаружено. Методом обратной генетики также получали вакцинные кандидаты (6:2) сезонных вирусов гриппа A/Vie/28/06 (H3N2) и A/Thu/2202/08 (H3N2).

   Патогенность, иммуногенность и протективная эффективность вирусов для лабораторных животных. Все опыты на животных выполнялись с соблюдением требований Хельсинской декларации.

   Цыплятам вакцинный штамм VN1203ANS1 вводили в дозе 7,1 log₁₀ ТСД₅₀ в объеме 0,2 мл внутривенно (i.v.) или интраназально (i.n.). Птиц наблюдали ежедневно в течение 14 дней; появление клинических симптомов регистрировалось. В орофарингеальных смывах и смывах клоаки наличие вируса проверяли на 3-й день после вакцинации титрованием ТСД₅₀ на Vero клетках.

   Для определения иммуногенности и защищенности беспородных мышей иммунизировали i.n. под наркозом одно- или двукратно вирусом VN1203ANS1, взятым в дозе 5,3 log-io ТСД₅о с интервалом в 3 недели. Через три недели после каждой иммунизации 6 мышей из каждой группы забивали, собирали сыворотки и анализировали в РТГА и ИФА. Оставшихся животных заражали под наркозом в объеме 50 мкл вирусами VN1203 (3,3 Iog₁₀ ТСД₅₀), HK213 (3,2 Iog₁₀ ТСД₅₀/мышь), IND05 (2,2 Iog10 ТСД50) или A/duck/Singapore/1/97 H5N3 (Dk/Sing/97 4,2 Iog10 ТСД50). На 3 и 5 день после заражения мышей забивали и определяли наличие вируса в 10% суспензии тканевых гомогенатов. Количество вируса определяли методом титрования ТСД50 на Vero (для вирусов VN1203, HK213, IND05) или на MDCK (для вируса dk/Sing/97). Для определения инфекционности вирусов беспородных мышей инфицировали i.n. без наркоза вирусом в дозе 4,5; 3,5 или 2,5 Iog₁₀ ТСД₅₀ в объеме 20 мкл. Через 60 ч после заражения животных забивали и собирали пробы носовой ткани, готовили 10% суспензию и определяли содержание вируса титрованием на Vero клетках. 50%-ную мышиную инфекционную дозу (MID50) подсчитывали методом Kerber, и выражали в ТСД₅₀ соответствующих 1 MID₅₀ (Lorenz and Bogel, 1973). Для гистологической оценки инфекционности группы BALB/c мышей иммунизировали i.n. под наркозом вирусами VN1203ANS1 или VN1203ANS1-K58I в дозе 6 log₁₀ ТСД₅₀ в объеме 50 мкл. Через 12 ч после инфицирования мышей забивали. Из органов респираторного тракта (слизистая носовой полости, трахея и легкие) готовили препараты, фиксированные 7% формалином и парафином. Клетки, инфицированные вирусом гриппа, красили моноклональными антителами против вирусного NP по стандартному протоколу с последующим контрастированием и фотографированием. Для получения носовых секретов мышам вводили 0,1 мг пилокарпина (Sigma). Выделяющийся секрет собирали на пористый носитель и элюировали в 50 мкл стерильного PBS на льду в течение 4 ч. Секреты, полученные от индивидуальных животных объединяли и анализировали на наличие IgA антител в ИФА.

   Хорьков (Biotest, Чешская республика) иммунизировали дважды i.n. вирусом VN1203ANS1 в дозе 7,8 log₁₀ ТСД₅₀ с интервалом в 4 недели. Вирусная суспензия представляла очищенный вирус в буфере SPGN (6% сахароза, 3,8 мM KH₂PO₄, 7,2 мM K₂HPO₄, 4,9 мM L- глютамата и 75 мM NaCl). Животных осматривали ежедневно на наличие симптомов. Перед иммунизацией и через 3 недели после каждого введения собирали сыворотки крови. На 3-й день после иммунизации 10 животных из опытной группы и 6 из контрольной забивали, собирали пробы легких, носовой полости, мозга, почек, кишечника, готовили 10% суспензию и анализировали на наличие вируса титрованием на клетках Vero. Антитела в сыворотках определяли методом РТГА и МНТ. Изучение протективной эффетивности вирусов проводили в компании Retroscreen Virology Ltd., (UK). Хорьков иммунизировали под легкой анестезией i.n. с интервалом в 18 дней вирусом VN1203ANS1, в дозе 8,1 log₁₀TQq₅₀. Контрольные животные получали PBS. Через 14 дней после иммунизации животных заражали под наркозом вирусом IND05-FA, в дозе 6,3 log₁₀TQq₅₀. После заражения животных осматривали ежедневно на наличие следующих симптомов: изменение веса, активность, чихание, одышка. Носовые смывы получали промыванием носовой полости хорьков раствором PBS. Носовые смывы собирали перед иммунизацией, 14 дней после и на 1, 3, 5 и 7 день после заражения реплицирующимся штаммом. Наличие вируса в смывах определяли титрованием на Vero.

   Макакам вирус VN1203ANS1 вводили интраназально под наркозом в дозе 7,8 log₁₀TQq₅₀ однократно в виде спрея. (Biotest, Чешская Республика). Животных наблюдали на наличие клинических симптомов и взвешивали. Сыворотки крови собирали до иммунизации и через 4 недели после иммунизации. Носовые смывы собирали до и через 2 дня после иммунизации. Наличие вируса в смывах определяли титрованием ТСД50 на Vero.

   Статистическая обработка данных. При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (M±a). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы с использованием t-теста Стьюдента или U - теста Mann- Whitney. Различия считались достоверными при р<0,05.
   

   Похожие диссертации на Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин

   

   Оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птицВасильев Юрий Михайлович

   Конструирование и сравнительные испытания экспериментальных вакцин против вирусов гриппа H5N1Боравлева Елизавета Юрьевна

   Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита B и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцинБлохина, Елена Александровна

   

   Особенности реассортации современных штаммов вируса гриппа с донорами аттенуации живой гриппозной вакциныБаженова Екатерина Андреевна

   Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа A в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ : иммуногенные и протективные свойства кандидатных вакцинПетухова, Наталья Витальевна

   

   Изучение механизмов вирусингибирующего действия соединения 1-бораадамантана (БГ-12) на модели вируса гриппаПогарская Ирина Владимировна

   

   Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов гриппаКонтаров Николай Александрович

   

   Молекулярные механизмы холодоадаптации и реверсий к TS+фенотипу вирусов гриппа A и BЦфасман Татьяна Михайловна

   

   Разработка средств диагностики высоковирулентного штамма вируса гриппа А подтипа H5N1Аканина Дарья Сергеевна

   Повышение качества вакцин против гриппа A/H5N1 путем увеличения стабильности гемагглютинина и использования нового донора репродукцииСергеева, Мария Валерьевна