Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Лактобактерии: биологические свойства, функции и лекарственные препараты 9
1.2. Свойства метаболитов лактобактерии 17
1.3. Технологические разработки лекарственных препаратов на основе бактериальных метаболитов 23
Глава 2. Объекты и методы исследований 36
2.1. Объекты 36
2.2. Методы исследований 39
2.2.1. Физико-химические методы 39
2.2.2. Микробиологические методы 49
2.2.3. Статистические методы 52
Глава 3. Получение и сравнительное изучение свойств нативного и концентрированного ультрафильтратов культуральнои жидкости лактобактерии штамма L. plantarum 8Р-АЗ 53
3.1. Выбор параметров концентрирования УКЖЛ 53
3.2. Изучение физико-химических параметров нативного и концентрированного УКЖЛ 54
3.2.1. Определение плотности, титруемой кислотности и рН 54
3.2.2. Влияние процесса концентрирования на азотистый состав УКЖЛ 57
3.2.3. Исследование состава органических кислот в нативном и концентрированном УКЖЛ 58
3.2.4. Определение состава аминокислот методом бумажной хроматографии и с помощью высокоскоростного аминокислотного анализатора 64
3.3. Сравнительная оценка бактериотропного действия нативного и концентрированного УЮКЛ 67
3.3.1. Изучение специфической (пробиотической) активности 67
3.3.2. Изучение антагонистической активности 71
3.3.3. Оценка антибактериального действия 73
3.3.4. Исследование влияния нативного и концентрированного УКЖЛ на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам 76
Выводы по главе 78
Глава 4. Разработка технологии и оценка качества мягких лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий 80
4.1. Технология и оценка качества суппозиториев вагинальных, содержащих концентрат УКЖЛ 80
4.1.1. Исследование влияния составов суппозиторных масс на качество лекарственных форм с концентрированным УКЖЛ 80
4.1.2. Оптимизация технологии суппозиториев с концентратом УКЖЛ 83
4.1.3. Исследование реологических параметров суппозиторных масс 89
4.1.4. Составление технологической схемы производства суппозиториев с концентратом УКЖЛ 98
4.1.5. Стандартизация суппозиториев с концентратом УКЖЛ 104
4.2. Технология и оценка качества мази защитного действия- 108
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 118
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 120
ПРИЛОЖЕНИЯ 136
- Лактобактерии: биологические свойства, функции и лекарственные препараты
- Объекты
- Выбор параметров концентрирования УКЖЛ
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время наблюдается расширение номенклатуры пробиотических препаратов. Перспективным направлением в этой области является разработка пробиотиков метаболитного типа. Данная группа пробиотиков осуществляет регулирование симбионтных отношений организма человека и его микрофлоры за счет компенсации метаболитов и создает благоприятные условия для развития собственной микрофлоры. Про-биотики метаболитного типа представляют собой препараты заместительной терапии и практически не оказывают побочных действий (Грачева Н.М., 2007).
Один из препаратов, содержащих микробные метаболиты, широко используемый на отечественном фармацевтическом рынке - Хилак - форте (Меркле ГмБХ, Германия). Препарат представляет собой капли для приема внутрь и содержит в своем составе концентрат продуктов метаболизма саха-ролитических (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Enterococcus faecalis) и протеолитических (Escherichia coli) микроорганизмов (беззародышевые водные субстраты продуктов обмена веществ). В его состав дополнительно введены молочная, фосфорная и лимонная кислоты, сорбат калия, сбалансированный состав буферных солей (кислый фосфорнокислый натрий и калий), лактоза и ряд аминокислот.
В Пермском НПО «Биомед» (Несчисляев В.А., Чистохина Л.П., 2004) разработан способ получения препарата «Микростим» на основе метаболитов Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ. В ходе исследований установлена выраженная пробиотическая и антимикробная активность препарата. При изучении влияния метаболитного препарата на иммунную систему установлена его иммуномодулирующая активность при пероральном и интравагинальном применении.
Для разработки технологии и стандартизации лекарственных форм препарата «Микростим» необходимо изучение состава ультрафильтрата культу-
5 ральной жидкости лактобактерий и условий его концентрирования, что определило актуальность проведенных исследований. Особенно актуальным является создание мягких лекарственных форм на основе метаболитов лактобактерий для профилактики и терапии гинекологических заболеваний.
Цель настоящего исследования - разработка технологии и оценка качества мягких лекарственных форм (вагинальных суппозиториев и мази защитного действия) пробиотического препарата на основе метаболитов лактобактерий штамма-продуцента L. plantarum 8Р-АЗ.
Основные задачи исследования:
Получить экспериментальные серии УКЖЛ штамма L. plantarum 8Р-АЗ, подобрать оптимальные условия и отработать способ его подготовки (концентрирование) для получения лекарственных форм.
Провести сравнительное изучение физико-химических и биологических характеристик нативного (исходного) и концентрированного УКЖЛ.
Разработать состав и технологию суппозиториев вагинальных и мази защитного действия на основе концентрированного УКЖЛ.
Оценить качество полученных лекарственных форм метаболитного препарата и провести стандартизацию суппозиториев вагинальных с концентрированным УЮКЛ.
Научная новизна работы. Предложен способ подготовки исходного субстрата для получения лекарственных форм метаболитного препарата. Определены оптимальные параметры концентрирования нативного УЮКЛ на вакуум-выпарной установке, позволяющие значительно улучшить технологические свойства и сохранить биологическую активность.
Изучен качественный и количественный состав исходного и концентрированного УКЖЛ. Показано, что все действующие вещества сохраняются при концентрировании и их количество увеличивается пропорционально степени сгущения. У концентрированного УЮКЛ установлена пробиотическая, противомикробная активность, а также определено его влияние на чувствительность L. plantarum 8Р-АЗ и Е. coli М-17 к ряду антибиотиков.
С помощью метода математического планирования, а также реологических исследований выбраны оптимальный состав и технология вагинальных суппозиториев. Показана возможность определения противомикробной активности МЛФ метаболитного препарата микрометодом серийных разведений.
Практическая значимость. Разработана рациональная технология МЛФ препарата на основе УКЖЛ, что позволяет расширить номенклатуру и повысить потребительские свойства метаболитных пробиотиков.
Составлено изменение (накопительная ведомость изменений № 24 от 18 декабря 2008 г.) к промышленному регламенту на производство лактобак-терина сухого (регистрационный номер ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 1567-04), включающее концентрирование бактериальной взвеси лактобактерий методом ультрафильтрации для получения клеточной взвеси и бесклеточной культуральной жидкости (УКЖЛ).
Результаты исследований внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО ПГФА кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии (акт внедрения от 18 апреля 2008 г.).
На защиту выносятся результаты экспериментального и теоретического обоснования технологии и стандартизации мягких лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств», посвященной 85-летию со дня рождения А.С. Саратикова (Томск, 2006); на второй российско-китайской Международной конференции по фармакологии (Пермь, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на четвертом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пушино, 2006); Международном конгрессе «Пробиоти-
7 ки, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); Региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург — Пермь, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященной 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» (Пермь, 2008)
Автор выражает благодарность сотрудникам отделения препаратов бактериотерапии Пермского филиала НПО «Биомед» канд. мед. наук Чисто-хиной Л.П., а также д. мед. наук Маслову Ю.Н. (ПГМА) за содействие в проведении микробиологических исследований; д. хим. наук Чекрышкину Ю.С. и канд. тех. наук Якушеву P.M. (Институт УРО РАН технической химии) за помощь в проведении реологических исследований и определении состава органических кислот УКЖЛ; д. фарм. наук Петриченко В.М. за оказание помощи в изучении аминокислотного состава УКЖЛ.
Лактобактерии: биологические свойства, функции и лекарственные препараты
Организм человека в естественных условиях, его органы и системы, колонизированы рядом микроорганизмов. Стерильными остаются сердце, кровь, лимфа, мозг, спинномозговая и синовиальная жидкости, мочевой пузырь, а также другие органы и ткани, которые не сообщаются с внешней средой [109]. Количество бактериальных клеток достигает 1012 КОЕ/мл в различных отделах, что на порядок превышает число клеток организма [1, 93, 135]. Микроорганизмы, заселяющие разные экониши, различаются как по качественному, так и по количественному составу [104]. Различают микробио-ту кожных покровов, полости рта, верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы [109, 123, 125, 147].
Состав нормальной микрофлоры человека зависит от большого числа экзогенных и эндогенных факторов. К эндогенным факторам относят инфекционные и соматические болезни, иммунодефициты, а также вес и возраст. Экзогенные факторы — климат, географические условия, экология, качество питания, использование лекарственных препаратов [105].
Различают микрофлору облигатную, факультативную и транзиторную [44, 45]. Облигатную (резистентную, индигенную) микрофлору представляют бактерии, постоянно населяющие макроорганизм [126, 136]. К одним из основных представителей облигатной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и вульво-вагинальной области относят лактобактерии [8, 104].
Лактобактерии используют с древнейших времен не только в быту (для целей питания), но и как средства терапии. Кисломолочные продукты применяли при желудочно-кишечных заболеваниях, отравлениях, солнечном ударе, ожогах, укусах змей, язвах, фурункулах и в качестве косметических средств [119]. И.И. Мечников предложил для борьбы с болезнетворными микроорганизмами использовать молочнокислые бактерии в виде простокваши, обогащенной культурой Lactobacillus bulgaricus [3, 10].
Лактобактерии — неспоробразующие грамположительные аэротолерантные палочки, обычно правильной формы, длинные, иногда кокковидные, формирующие короткие цепочки или единичные. Они являются факультативными анаэробами [3, 10].
Данную группу микроорганизмов обнаруживают в человеческом молоке, полости рта; в желудке их содержание составляет 102-103 КОЕ/мл желудочного сока, в тонкой кишке до 103-104 КОЕ/мл кишечного сока, в толстой кишке 106-109КОЕ/г фекалий [10].
Лактобактериям принадлежит одна из ведущих ролей в поддержании симбионтных отношений между макроорганизмом и его микрофлорой, а также в регуляции межмикробных взаимоотношений. К основным функциям лактобактерии относят их участие в обменных процессах и защите от инфекций извне среды [20].
В рамках обменной функции различают белково- и витаминосинтети-ческие свойства, участие в метаболизме и утилизации нутриентов, лекарственных веществ, эндогенных гормонов и канцерогенов. Лактобактерии усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы; омыляют жиры, препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и повышению количества гистамина [20]. Обладают амилазной и казеинолитической активностью, участвуют в метаболизме желчных кислот, холестерина и ксенобиотиков [104, 105]. Таким образом, осуществляется антианемическое, антирахитическое и антихолестеринемическое действие.
К защитной функции лактобактерии относят прямой и опосредованный антагонизм по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, предотвращение колонизации ими слизистых оболочек открытых биологических систем и препятствия к проникновению микробов, микробных токсинов и ксенобиотикоЕ, а также иммуномодулирующие свойства [20].
Антагонистические взаимоотношения лактобактерий с патогенами осуществляются в процессе конкурентного ингибирования, базирующегося на конкуренции за нутриенты и сайты адгезии и выработке ингибирующих субстанций [108, 58]. Средством подавления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов является способность лактобактерий к продукции органических кислот [12, 108]. В процессе сбраживания глюкозы лакто-бактериями при преобладающем продукте — молочной кислоте синтезируется широкий спектр органических кислот и многоатомных спиртов: пируват, ацетат, ацетоуксусная и пропионовая кислоты, 2,3-бутандиол, манитол и другие [109]. Лактобактерий в процессе брожения молочной кислоты образуют антибиотикоподобные вещества: лактолин, лактоцидин, ацидофилин [60]. Их активность чаще всего связана с кислотностью внешней среды. Независимыми от кислотности факторами ингибирования могут выступать перекись водорода [20].
Колонизационная резистентность представляет собой устойчивость колонизации условно патогенными микроорганизмами или патогенными бактериями. Различают прямые и непрямые механизмы резистентности. К прямым механизмам относят продукцию бактериями ингибиторов, нарушающих метаболизм патогенных и условно патогенных микроорганизмов; конкурентные взаимоотношения с патогенными бактериями за питательные субстраты и места адгезии; прямую деградацию токсинов. Липотейхоевая кислота лактобактерий способствует высокой адгезии к поверхности эпителия, обеспечивая колонизационную резистентность [83, 102, 105]. Также некоторые виды лактобактерий вырабатывают биосурфактант, который препятствует адгезии патогенных микроорганизмов на эпителии [83].
Объекты
Использовали производственные штаммы: Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ. Штамм L. plantarum 8Р-АЗ, выбранный в качестве штамма-продуцента препарата «Микростим», хранится в коллекции специализированной лаборатории ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва). Морфологические, культу-ральные и биохимические свойства производственного штамма L. plantarum 8Р-АЗ контролируются согласно ФСП 42-05047298054 на препарат «Лактобактерий сухой». Лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ представляют собой неподг вижные грамположительные палочки длиной от 0,7 до 3,0 мкм, располагающиеся беспорядочными скоплениями и отдельными короткими цепочками. Жгутиков не имеют, капсул и спор не образуют. L. plantarum 8Р-АЗ - факультативные анаэробы, растут в атмосфере углекислого газа или азота, а также в присутствии кислорода. На плотной среде МРС-4 образуют выпуклые непрозрачные, белые колонии. На жидкой среде МРС-1 вырастают в виде равномерной мути и гомогенного белого осадка на дне пробирки. На среде МРС-2 образуют колонии в виде «тяжей». Оптимальная температура для роста составляет (37+1) С. Метаболизм бродильного типа, по меньшей мере, половина углерода конечных продуктов брожения приходится на лактат. Лактобактерий ферментируют глюкозу с образованием кислоты без газа; разлагают целлобиозу, эскулин, фруктозу, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, салицин, сорбит, сахарозу, трегалозу. Не разлагают рамнозу. Нитрат не восстанавливают, каталазоотрицательные, цитохромов не содержат. Нативный УКЖЛ получали из бактериальной взвеси лактобактерий штамма Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ на установке УПЛ-0,6. Бактериальные взвеси получали путем периодического культивирования на казеиново-дрожжевой среде в аэробных условиях при температуре 37 С и активном перемешивании. Оптическая мутность составляла не менее 41 единицы мутности по ОСО 42-28-85-86 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). УПЛ-0,6 представляет собой лабораторную ультрафильтрационную, половолоконную, лабораторную установку с фильтрующей поверхностью 0,6 м2. Принцип работы установки основан на разделении высокомолекулярных растворов и коллоидных систем методом ультрафильтрации, причем движущей силой переноса вещества через полое волокно является перепад давления по обе стороны волокна. В состав установки входит аппарат разделительный на полых волокнах АР-1,0 (А - аппарат; Р - разделительный; 1,0 - площадь фильтрации, м2). Показатели АР-1 : Производительность по фильтрату (очищенная вода) при давлении 0,01 МПа и температуре (20±1) С не менее 1 л/ч. Волокно марки ВПУ - 15 ПА - 60. Поверхность фильтрования, м2 - 1. Максимальное рабочее давление, МПА -0,02. Количественное определение органических кислот проводили методом потенциометрического титрования. Показатели рН среды у исследуемых образцов определяли на рН — метре со стеклянным и хлорсеребряным электродами. Настройку иономера осуществляли с использованием буферных растворов. В качестве титранта использовали ОДМ КОН. Исследовали нативный, концентрированный УКЖЛ, водное извлечение из суппозиториев, соответствующее 30-кратному разведению концентрата УКЖЛ. В качестве образцов сравнения брали растворы кислоты ледяной уксусной и 80% раствор кислоты молочной, из которых предварительно готовили 0,1 М растворы. По результатам титрования строили интегральные и дифференциальные кривые и по ним определяли значения констант кислотности (рКа) [2].
Выбор параметров концентрирования УКЖЛ
Исследованиями В.А. Несчисляева и Л.П. Чистохиной (2004 г) установлено, что УКЖЛ, содержащий биологически активный метаболитный комплекс, оказывает прямое угнетающее влияние на патогенные микробы, повышает их чувствительность к антибиотикам, а также антибактериальным веществам, продуцируемым бактериями. Препарат на его основе [77, 115, 116] рекомендован для профилактики и лечения дисбактериозов, кишечных инфекций, а также гнойно-септических осложнений в акушерско-гинеколо-гической практике. Представляется целесообразным создание широкого спектра лекарственных форм препарата на основе УКЖЛ.
Рекомендованная терапевтическая доза исходного УКЖЛ составляет 10 мл [77, 115, 116]. При получении мягких лекарственных форм (мазей, суппозиториев) возникает необходимость предварительного концентрирования биокомпонента.
В работе использовали 5 серий нативного УКЖЛ, полученные из взвеси лактобактерий на установке УПЛ-0,6. Эти серии УКЖЛ разливали во флаконы емкостью 400 мл и стерилизовали при температуре 110 С 30 минут.
Для получения концентрата УКЖЛ до стерилизации его сгущали в 10 раз на вакуум-выпарной установке при следующих параметрах концентрирования: температура - 90 С; разрежение - 0,04-0,05 МПА; объем однократной порции в концентрирующей колбе - 200 мл.
По окончании процесса получали вязкую жидкость коричневого цвета с характерным запахом.
В результате ультрафильтрации и концентрирования были получены серии, представленные в табл. 3.1.
Указанные серии были использованы при последующем сравнительном изучении свойств нативного и концентрированного УКЖЛ по физико-химическим показателям: плотность, рН, кислотность, УФ-спектры; определено количественное содержание низкомолекулярных пептидов, общего азота, органических и аминокислот. Кроме того, представляет интерес изучение антибактериального эффекта концентрированного УКЖЛ по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, вызывающим гинекологические заболевания, а также определение стимулирующей пробиотиче-ской активности и влияние на чувствительность лактобактерий к антибиотикам, используемым в гинекологии.
На данном этапе работы проводили сравнительное изучение параметров нативного и концентрированного УКЖЛ, включая определение его внешнего вида, плотности, кислотности и рН. Данные, представленные в табл. 3.2., позволяют прогнозировать влияние процесса сгущения на определенные параметры УКЖЛ.
Установлено, что при концентрировании нативного УКЖЛ кислотность возрастает в пределах от 15 до 19 раз. Количественные показатели плотности увеличиваются при этом в 1,1 - 1,2 раза. Во всех сериях концентрированного УКЖЛ по сравнению с нативным показатели рН остались неизменными, что свидетельствует о сохранении в ходе концентрирования буферных свойств исходного материала.
УФ-спектры концентрата УКЖЛ, разведенного в 500 раз водой очищенной (рис. 3.1), имеют максимум поглощения при длине волны 245,7 нм и минимум поглощения при длине волны 266,1 нм.
Методики определения общего азота, белков по методу Лоури и с биуре-товым реактивом приведены в главе «Материалы и методы» с. 40-42. Полученные данные для нативного и концентрированного УКЖЛ представлены в табл. 3.3.
Из результатов табл. 3.3., видно, что содержание общего азота при концентрировании увеличивается в 11,3 раза, белка по методу Лоури в 8 раз и по методу с использованием биуретового реактива в 9,6 раз. Поскольку при количественном определении белков методом Лоури и с помощью биуретового реактива получали сопоставимые результаты, оба метода возможно использовать для определения содержания белка в препарате.
Лактобактерии являются активными продуцентами молочной и уксусной кислот [22], поэтому одной из основных задач было определить в нативном и концентрированном УКЖЛ их содержание. Для этого были апробированы методы потенциометрического титрования, тонкослойная хроматография, а также метод высокоэффективного капиллярного электрофореза.
На первом этапе в ходе потенциометрического титрования определяли значения рКа, представляющие собой один из показателей, характеризующих взаимодействия лекарственных препаратов с рецепторами слизистой [41].
