Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения [Электронный ресурс] Зверева Елена Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы "Антиоксидантные препараты в лечении воспалительных заболеваний" 10

1.1. Средства для лечения воспаления .10

Нестероидные противовоспалительные средства 10

Стероидные противовоспалительные средства 12

Антиоксидантные препараты 13

1.2. Местное лечение воспалений 16

1.2.1. Антиоксидантные препараты, обладающие противовоспалительной активностью и используемые для наружного применения 18

Супероксиддисмутаза 20

ВитаминС. 21

Витамин Е 22

Витамин А... 22

Синтетические антиоксиданты... 23

Комбинации антиоксидантных препаратов 25

Липоевая кислота 26

1.3. Перспективные лекарственные формы для наружного применения 29

Глава 2. Материалы и методы исследования 36

2.1. Материалы исследования 36

2.2. Методы исследования 39

2.2.1. Исследования биологической активности липоевой кислоты 39

2.2.2. Изучение физико-химических и технологических свойств наружной лекарственной формы с липоевой кислотой 46

2.2.3. Методики идентификации и количественного определения субстанции и геля липоевой кислоты 47

2.2.4. Биофармацевтические исследования липоевой кислоты 53

2.2.5. Микробиологические исследования лекарственной формы для наружного применения с липоевой кислотой 55

Глава 3. Исследования биологической активности липоевой кислоты 57

3.1. Сравнительная оценка биологической активности субстанции и разработанной наружной лекарственной формы липоевой кислоты 57

3.1.1. Оценка влияния липоевой кислоты на острое экссудативное воспаление на модели каррагенинового отека лапы крыс 57

3.1.2. Оценка влияния наружной лекарственной формы липоевой кислоты на острое экссудативное воспаление на модели каррагенинового отека лапы крыс 60

3.1.3. Оценка влияния субстанции липоевой кислоты на хроническое пролиферативное воспаление на модели фетровой гранулемы у крыс 63

3.1.4. Изучение анальгетического действия субстанции и разработанной наружной лекарственной формы липоевой кислоты 65

3.1.5. Изучение жаропонижающего действия липоевой кислоты на модели пирогенной лихорадки у крыс 67

3.1.6. Изучение противовоспалительной активности наружной лекарственной формы липоевой кислоты на модели ультрафиолетовой эритемы у морских свинок 68

3.1.7. Изучение влияния липоевой кислоты на развитие отека, вызванного простагландино 71

3.1.8. Изучение влияния липоевой кислоты на развитие отека, вызванного простагландином

3.1.8. Изучение ульцерогенного действия при однократном введении липоевой кислоты крысам 73

3.2. Определение раздражающего действия разработанных образцов геля липоевой кислоты при накожных аппликациях 74

Глава 4. Разработка и исследование лекарственной формы липоевой кислоты для наружного применения 76

4.1. Физико-химические свойства липоевой кислоты 76

4.1.1. Изучение растворимости липоевой кислоты 76

4.1.2. Идентификация липоевой кислоты в субстанции 78

4.2. Выбор оптимального состава и технологии изготовления наружной лекарственной формы с липоевой кислотой 82

4.3. Изучение процесса набухания геля липоевой кислоты 86

4.4. Выбор оптимального состава и технологии изготовления геля липоевой кислоты 90

4.5. Изучение структурно-механических свойств гелей липоевой кислоты 93

4.6. Количественный и качественный анализ липоевой кислоты в наружной лекарственной форме 98

4.7.Изучение фармацевтической доступности геля липоевой кислоты 106

4.8.Изучение механизма взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в геле липоевой кислоты 109

4.9.Изучение стабильности геля липоевой кислоты в процессе хранения. 111

Глава 5. Обсуждение собственных результатов 118

Выводы 134

Библиографический список используемой литературы 136

Приложение 171

• Антиоксидантные препараты
• Оценка влияния липоевой кислоты на острое экссудативное воспаление на модели каррагенинового отека лапы крыс
• Идентификация липоевой кислоты в субстанции

Введение к работе

Актуальность темы. Воспалительный процесс является ведущим патогенетическим звеном многих заболеваний, которые составляют около 80% всей патологии в практике врача любой специальности [47, 102, 108].

Современная медицина обладает широким арсеналом средств противовоспалительного действия, однако наряду с благоприятным фармакологическим действием и достаточной степенью клинической эффективности, все они вызывают ряд нежелательных побочных реакций [4, 38,64,74,233].

В связи с этим остается актуальным поиск высокоэффективных лекарственных средств, подавляющих воспаление и обладающих минимальными побочными реакциями. Одним из подходов является изыскание таких средств среди препаратов метаболического типа действия [49, 127]. К подобным относится липоевая кислота, которая является коферментом группы кокарбоксилаз и применяется в качестве гепатопротектора, в комплексном лечении диабетической нейропатии, атеросклероза, интоксикаций [7, 55, 61, 158, 185, 194]. Одно из интересных свойств липоевой кислоты - ее антиоксидантная активность [149, 231, 242]. Как известно, антиоксидантная система организма регулирует интенсивность свободно-радикального окисления липидов клеточных мембран. Ослабление антиоксидантной защиты приводит к накоплению недоокисленных метаболитов, вызывая деградацию мембранных структур, воспаление, старение и опухолевый рост [175, 223, 256].

Показано, что многие антиоксиданты обладают противовоспалительными свойствами, как при внутреннем, так и при наружном применении (витамин Е, аскорбиновая кислота, мексидол, димефосфон и др.) [5, 189, 192, 256, 285, 315,]. Однако, несмотря на безопасность, по эффективности многие из них уступают нестероидным противовоспалительным препаратам (НПВС). В

отличие от других антиоксидантов липоевая кислота и ее восстановленная форма дигидролипоевая кислота способствуют регенерации окисленных эндогенных антиоксидантов, обеспечивая мощную поддержку работы других антиоксидантных звеньев в организме [149, 159, 180, 242].Ограниченное число отечественных лекарственных препаратов противовоспалительного действия для наружного применения и отсутствие наружной лекарственной формы (ЛФ) с липоевой кислотой указывают на целесообразность ее создания.

Цель работы. Изучение противовоспалительных свойств липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения.

Задачи исследования: 1.Изучить противовоспалительную, анальгетическую и жаропонижающую активность липоевой кислоты при пероральном способе введения на моделях острого экссудативного и хронического пролиферативного воспаления, химического болевого раздражения и лихорадки.

2.Теоретически и экспериментально обосновать состав и разработать технологию мягкой наружной лекарственной формы с липоевой кислотой. 3. Разработать методики количественного и качественного анализа липоевой кислоты в наружной лекарственной форме и исследовать ее стабильность. 4.Изучить специфическую активность и раздражающее действие разработанной наружной лекарственной формы липоевой кислоты и подобрать ее оптимальную концентрацию.

Научная новизна работы. Впервые, на моделях острого и хронического воспаления, химического болевого раздражения и лихорадки установлено наличие у липоевой кислоты противовоспалительного, анальгетического и жаропонижающего эффектов. Выявлено, что липоевая кислота имеет более высокий терапевтический индекс противовоспалительной активности и индекс безопасности, чем диклофенак- натрия.

Физико-химическими методами анализа - ВЭЖХ, ТСХ, ПМР- и масс-спектрометрией, УФ-спектрофотометрией разработаны методики идентификации и количественного определения липоевой кислоты в субстанции и наружной ЛФ - 1% геле.

Реологическими методами исследования установлено влияние концентраций липоевой кислоты на структурно-механические свойства наружной ЛФ. С использованием метода дериватографии определены температурные факторы, оказывающие влияние на стабильность наружной ЛФ с липоевой кислотой.

На основании комплекса проведенных исследований теоретически и экспериментально обоснован состав и разработана технология изготовления 1% геля липоевой кислоты, обладающий противовоспалительной и анальгетической активностью, сопоставимой с эффективностью 1% геля диклофенака- натрия, а также стабильностью и безвредностью.

По результатам исследования подана заявка на изобретение "Композиция для наружного применения, обладающая противовоспалительной, анальгетической и антибактериальной активностью", получена приоритетная справка (регистрационный №2006116942 от 18.05.2006 г.).

Научно-практическая значимость и внедрение результатов работы:

- результаты проведенных исследований свидетельствуют о наличии
противовоспалительных и анальгетических свойств у липоевой кислоты при
внутреннем и наружном применении, а также жаропонижающей активности
при пероральном способе введения и являются обоснованием для
дальнейшей оценки ее эффективности в клиники.

разработан оптимальный состав мягкой ЛФ с липоевой кислотой для наружного применения, обладающий противовоспалительной и анальгетической активностью.

разработан проект фармакопейной статьи предприятия на наружную ЛФ с липоевой кислотой и проведена апробация лабораторного регламента.

- результаты исследований используются в учебном процессе TOY ВПО Казанского государственного медицинского университета. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фармакологической оценки противовоспалительного,
жаропонижающего и анальгетического действия липоевои кислоты при
внутреннем и наружном применении.

2. Разработанные методики количественного и качественного анализа липоевои кислоты в субстанции и наружной ЛФ методами ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрии.

3. Результаты экспериментального обоснования состава наружной ЛФ с липоевои кислотой и оценки ее стабильности при хранении.

4. Технологическая схема производства 1% геля с липоевои кислотой.

Апробации работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции "Рациональное использование лекарств" (г. Пермь, 2004г.), Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине IX" (г. Казань, 2004 г.), Международном научном конгрессе "Высокие технологии" (г. Париж,2004г.), Конференции "IBRO Workshop in neuroscience" (г. Казань, 2005 г.), IV международной конференции "Фундаментальные исследования" (г.Римини, 2005г.), Российско-китайской научной конференции "Фундаментальная фармакология и фармация в клинической практике" (г. Пермь, 2006г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания материалов и методов исследования (2 глава), изложения собственных результатов (3-4 главы), обсуждения результатов (5 глава), выводов и приложения. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель включает 325 источников, в том числе 132 отечественных и 193 иностранных авторов.

Антиоксидантные препараты

Антиоксиданты (АО) имеют очень широкий спектр действия, так как активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) и образование активных форм кислорода (АФК) наблюдается при многих патологиях, таких как атеросклероз; нарушения мозгового, коронарного и периферического кровообращения; сахарный диабет и диабетическая ангиопатия; ревматоидные, воспалительные и дегенеративные заболевания опорно-двигательной системы; поражения глаз; шок различного генеза; легочные заболевания; онкологическая патология; термические поражения; различные интоксикации и многие другие [25, 112, 127].

Известно, что повреждение тканей всегда сопровождается избыточной генерацией АФК и интенсификацией процессов ПОЛ. Генерация АФК фагоцитами приводит не только к элиминации чужеродных агентов, но и к разрушению клеток и межклеточного матрикса в очаге воспаления [108, 203]. Так, свободнорадикальное окисление является одним из главных патогенетических звеньев воспалительных процессов любого генеза [175, 223, 256]. Источником свободных радикалов (СР), а также других кислородпроизвод-ных медиаторов и модуляторов воспаления - перекиси водорода (Н202), синглетного кислорода (ГО2), гипохлорида (НОСІ) служат: дыхательный взрыв фагоцитов при их стимуляции, каскад арахидоновой кислоты в процессе образования эйкозаноидов, накопление нейтрофилов, ферментные процессы в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях, цитозоле, а также самоокисление малых молекул, таких, как гидрохиноны, лейкофла-вины, катехоламины и другие [ 82, 106, 140, 195, 251]. Классификация антиоксидантов

АО - понятие собирательное, поэтому оно не подразумевает принадлежности к какой-то определенной химической группе веществ [13]. В то же время на сегодня общепринятая классификация АО отсутствует. Простейшая классификация основана на растворимости веществ в водной и липидной фазе и позволяет выделить две группы АО: гидрофильные (водорастворимые, например, аскорбиновая кислота, мочевая кислота, цистеин и другие) и липофильные (жирорастворимые токоферолы, ретинол, билирубин и другие) [19]. Тем не менее, наиболее удобным является подразделение АО по наличию в структуре молекулы определенных функциональных групп, связанных с проявлением антиоксидантных свойств. Согласно классификации Зайцева В.Г. АО прямого действия разделены на пять основных категорий: доноры протона, полиены, катализаторы, ловушки радикалов, комплексообразователи [28].

1. Доноры протона - наиболее обширная группа АО, применяемых в медицине, к ним относятся вещества с легкоподвижным атомом водорода. Они могут быть разделены на следующие подгруппы:

1.1. Фенолы. За счет легко подвижного атома водорода одной или нескольких фенольных групп в составе молекулы АО данной группы взаимодействуют с образующимися в ходе ПОЛ радикалами. Основные представители: токоферолы, ионол, пробукол, производные фенолов и нафтолов, флавоноиды, катехины, фенолкарбоновые кислоты, эстрогены.

1.2. Азот-содержащие гетероциклические вещества. Механизм действия данной подгруппы, аналогичен фенольным АО. Высокой подвижностью в молекуле таких веществ обладает атом водорода, связанный с азотом и входящий в составе ароматического гетероцикла. Основные представители: мелатонин, производные 1,4-дигидропиридина, 5,6,7,8-тетрагидробиоптерин, производные пирролопиримидина.

1.3. Тиолы. Механизм их действия двойственный: тиоловые АО способны выступать как в роли доноров протона (с образованием тиольных радикалов), так и в роли хелаторов катионов переходных металлов. Более эффективны, чем фенольные АО. Основные представители: глутатион, цистеин, гомоцистеин, N-ацетилцистеин, эрготионеин, дигидролипоевая кислота.

1.4. а,(3-Диенолы. Механизм действия основного представителя этой группы АО, а именно аскорбиновой кислоты состоит в том, что она легко отдает протоны, превращаясь в дегидроаскорбиновую кислоту (процесс обратим).

1.5. Порфирины. Механизм действия, по-видимому, множественный: доноры протона, комплексообразователи, катализаторы (в виде комплексов с катионами некоторых металлов). Основной представитель: билирубин.

2. Полиены - вещества с несколькими ненасыщенными связями. Они легко окисляются, конкурируя за АФК и радикалы с биомолекулами и тем самым, защищая последние от окисления. Способны взаимодействовать с различными СР, ковалентно присоединяя их по двойной связи. Сами по себе обладают невысокой антиоксидантной активностью, но сочетание с АО — донорами протона (при условии более высокой молярной концентрации последних) приводит к усилению антиоксидантного эффекта смеси. Основные представители: ретиноиды (ретиналь, ретиноевая кислота, ретинол и его эфиры) и каротиноиды (каротины, ликопин, спириллоксантин, астацин, астаксантин и др.).

Оценка влияния липоевой кислоты на острое экссудативное воспаление на модели каррагенинового отека лапы крыс

Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты в сравнении с диклофенак натрия проводили на белых нелинейных крысах обоего пола массой 150-240 г на модели каррагенинового отека.

Предварительно определяли острую токсичность субстанций липоевой кислоты и препарата сравнения диклофенак-натрия для лабораторных животных с соблюдением правил программы доклинических испытаний по оценке безопасности потенциальных лекарственных препаратов, описанной в главе 2.

Введение токсико-летальных доз липоевой кислоты крысам сопровождалось снижением двигательной активности, общим угнетением, снижением реакции на раздражители, ригидностью хвоста, акроцианозом, нарушением дыхания. Периодически возникали клонико-тонические судороги. Гибель крыс наступала в течение первых суток после введения препарата на фоне судорог от угнетения дыхания. На вскрытии у погибших животных отмечалось полнокровие внутренних органов. Почки, печень были без видимых изменений, на слизистой оболочке желудка наблюдались многочисленные кровоизлияния местами до некроза.

В результате изучения токсичности нами установлено, что максимально-переносимая доза субстанции липоевой кислоты для крыс при введении "per os" составила 200 мг/кг, средняя смертельная - 1110±83 мг/кг, абсолютно-смертельная доза 1600 мг/кг. В ходе эксперимента установлено, что крысы-самки и крысы-самцы одинаково чувствительны к токсическому действию препарата. По параметрам острой токсичности липоевая кислота может быть отнесена к классу мало токсичных веществ [36]. Средняя смертельная доза для крыс используемой в экспериментах субстанции диклофенак-натрия составляла 131+27 мг/кг.

Изучение противовоспалительной активности исследуемых препаратов на модели острого экссудативного воспаления — каррагенинового отека проводили согласно методике, описанной в главе 2. За час до индукции воспаления липоевую кислоту в диапазоне доз от 1/10 ЛД5о до 1/100 ЛД5о вводили зондом в желудок в виде водной суспензии с твином 80 в качестве эмульгатора. Препарат сравнения - диклофенак-натрия растворяли в воде очищенной и вводили в диапазоне доз 1/10 ЛД5о до 1/30 ЛД5о- Контрольные группы животных получали воду очищенную с добавлением и без добавления твина 80 в том же объеме, что и опытные группы. Полученные в ходе эксперимента данные представлены в приложении (таблица 3.1.).

В ходе эксперимента выявлено, что липоевая кислота проявляет противовоспалительное действие, достоверно снижая выраженность отека. Так, липоевая кислота в исследуемом диапазоне доз от 1/10 ЛД5о до 1/100 ЛД5о уменьшает отек стопы на 66 % - 48 %. Диклофенак-натрия в указанном интервале доз, подавлял выраженность каррагенинового отека на 74 - 37% (Р 0,05).

При сравнении эквитоксичной дозы липоевой кислоты и диклофенак натрия, а именно дозы равной 1/10 ЛД50, оба препарата сопоставимо снижали каррагениновый отек на 66% и 74% соответственно.

В процессе экспериментов выявлено, что выраженность отека у животных контрольных групп не отличалась, а значит, применение незначительного количества твина - 80 в качестве эмульгатора при изготовлении исследуемых образцов липоевой кислоты не влияет на фармакологическое действие препарата.

Идентификация липоевой кислоты в субстанции

Как видно из рисунка 4.2, в спектре ПМР имеется пик (триплет) в области 1,8 м.д., что соответствует сигналу двух протонов при атоме углерода, находящегося в цикле (С 1). В области 1,5 м.д. присутствует пик (квартет), соответствующий сигналам протонов водорода при атоме углерода (С 2). Атом углерода (С 3) имеет большое количество заместителей, и водород характеризуется мультиплетным сигналом 8 (СН) = 3,6-3,4 м.д., который смещается в более слабое поле из-за близости серы и длинной углеводородной цепочки.

Сигнал атомов водорода при атоме углерода (С 4) смещается в сторону слабого поля из-за соседней углеводородной цепочки и характеризуется в спектре мультиплетом в области 8 (0) =3,2-3,0 м.д. Атомы водорода при С5, С 6, С 7 характеризуются в спектре пиками соответствующих областях: 5 (СН2) =2,5 м.д.; 8 (СН2) =2,4 м.д.; 5 (СН2) =1,9 м.д.

Многообразие структурной информации спектров ПМР практически исключает совпадение спектров разных соединений. В связи с этим, данный метод можно применять для идентификации липоевой кислоты, а также для дальнейшей разработки методики количественного определения относительного и абсолютного ее содержания в геле. Масс-спектрометрия

Одним из современных методов для определения подлинности лекарственного вещества является масс-спектрометрия, с помощью которой можно идентифицировать с большой скоростью и точностью вещество, даже если его содержание незначительно [129].

С помощью полученных на масс-спектрометрическом детекторе спектров, представленные на рисунке 4.2., можно судить о качественном составе пробы, о молекулярной массе липоевой кислоты.

Так, из рисунка 4.2 видно, в масс-спектре имеется молекулярный ион с m/z 206,33, что свидетельствует о 100% чистоте липоевой кислоты.

Методом масс-спектроскопии была определена брутто формула субстанции липоевой кислоты C8H14O2S2. Масс-спектр имеет следующие характерные соотношения масса/заряд (m/z): 41, 55, 67, 81, 95, 105, 123, 155, 173, 206.

Масс-спектр может служить для идентификации и определения степени чистоты исследуемого вещества. Как видно из рисунка 4.3., используя современную программу обработки данных MASPEC II system, становится возможным получить структурную формулу липоевой кислоты.

Похожие диссертации на Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения [Электронный ресурс]

Разработка липосомальных форм с ситостерином гороха с целью применения в медицинской практикеГлинкина Алина Евгеньевна

Повышение биодоступности лекарственных форм с применением твердых дисперсий Краснюк, Иван Иванович

Разработка и фармакотехнологические исследования таблеток циннаризина с кислотой янтарной.Воробьев Александр Николаевич

Методология разработки лекарственных форм с иммунобиологической и адсорбционной активностьюРешетников Виктор Иванович

Разработка неинъекционных лекарственных форм препарата тимодепрессинГудков Тимофей Александрович

Разработка неинъенкционных лекарственных форм препарата тимодепрессинГудков Тимофей Александрович

Разработка твердой лекарственной формы на основе экстрактивного комплекса корневищ аира и коры крушиныШейкин Владимир Викторович

Разработка капулированных лекарственных форм на основе микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) и методов их стандартизацииТюляев Александр Иванович

Технологические аспекты разработки и совершенствования лекарственных форм лактобактеринаСемченко Андрей Викторович

Разработка технологии таблетированных лекарственных форм на основе нового полусинтетического производного бетулина, обладающего противотуберкулезной активностьюПогребняк Людмила Владимировна